一种用于伤口愈合的纳米纤维膜及其制备方法和应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710003075.9 (22)申请日 2017.01.04 (71)申请人 华东师范大学 地址 200062 上海市普陀区中山北路3663 号 (72)发明人 易正芳 吕方 吴成铁 刘明耀 (74)专利代理机构 上海麦其知识产权代理事务 所(普通合伙) 31257 代理人 董红曼 (51)Int.Cl. A61L 15/26(2006.01) A61L 15/18(2006.01) A61L 15/32(2006.01) A61L 15/42(2006.01) A61L

2、15/44(2006.01) A61L 15/46(2006.01) (54)发明名称 一种用于伤口愈合的纳米纤维膜及其制备 方法和应用 (57)摘要 本发明采用聚己内脂、 明胶以及磷酸二正硅 酸钙生物陶瓷为原料， 利用混合静电纺丝技术制 备了一种用于伤口愈合的复合纳米纤维膜。 所述 复合纳米纤维膜能够显著缩短软组织慢性伤口 尤其是糖尿病创伤的愈合时间， 促进创伤区域的 血管新生、 表皮再生和胶原形成， 并且减少慢性 伤口处炎症反应， 对软组织创伤修复具有很好的 应用前景。 权利要求书1页 说明书11页 附图8页 CN 108261557 A 2018.07.10 CN 108261557 A

3、 1.一种用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜的制备方法， 其特征在于， 通过对聚己 内脂、 明胶、 磷酸二正硅酸钙组成的混合溶液进行电纺， 来制备所述用于软组织伤口愈合的 复合纳米纤维膜。 2.如权利要求1所述的用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜的制备方法， 其特征在 于， 所述方法包括： (1)将聚己内脂、 明胶、 磷酸二正硅酸钙溶于HFIP中， 搅拌得到混合溶液； (2)将所述混合溶液进行电纺， 收集得到纤维膜； (3)将所述纤维膜浸泡在戊二醛/乙醇溶液中进行固定， 得到所述用于软组织伤口愈合 的复合纳米纤维膜。 3.如权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述聚己内脂

4、、 明胶、 磷酸二 正硅酸钙颗粒的质量比为10-50： 10-50： 10-50。 4.如权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述电纺的条件为： 电压为8- 12Kv， 流速为0.01-0.04ml/min， 间距为8-15cm， 沉积时间为80-200min。 5.如权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述软组织伤口包括皮肤或肌肉的烧伤、 手术或意外创伤等软组织伤口， 或由疾病引起的伤口。 6.如权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述软组织伤口是由糖尿病引起的伤口， 所述糖尿病包括I型、 II型糖尿病。 7.一种用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜， 其特征

5、在于， 所述复合纳米纤维膜包 含聚己内脂、 明胶、 磷酸二正硅酸钙。 8.一种用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜， 其特征在于， 所述复合纳米纤维膜由 权利要求1所述的方法制备得到。 9.如权利要求7或8所述的用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜， 其特征在于， 所述 用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜具有无序三维孔隙结构， NAGEL在纤维内部均匀分 布。 10.一种用于软组织伤口愈合的敷料， 其特征在于， 所述敷料包括权利要求7或8所述的 用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜。 11.如权利要求7或8所述的用于伤口愈合的复合纳米纤维膜在制备促进伤口愈合的医 疗产品的应用。 12.如权利要求9所

6、述的用于伤口愈合的敷料在制备促进伤口愈合的医疗产品的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108261557 A 2 一种用于伤口愈合的纳米纤维膜及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种用于软组织伤口愈合的纳米纤维膜及其制备方法和用途， 具体涉 及一种新型的含有生物活性陶瓷磷酸二正硅酸钙颗粒(NAGEL)的静电纺丝材料及其制备方 法和用途， 属于生物材料技术领域。 背景技术 0002 近年来， 伴随着全球生活质量的提高， 肥胖、 糖尿病、 营养失调等慢性疾病的发病 率也逐年升高， 其并发症诸如压力性溃疡、 下肢静脉性溃疡以及糖尿病溃疡等慢性伤口的 发生率也明显上升Tu

7、rner N J,et al,Advances in wound care,2015。 据估计， 全球约 有4亿人面临不同因素引起的伤口问题Harding K ,et al .,International woundjournal,2011。 仅在美国， 就约有640万人受慢性伤口的困扰， 相应的医疗支出费用 高达250亿美元Naves CCLM.Advances in wound care,2016。 糖尿病是一种全身性的代 谢性疾病， 在这些患者中大约有15的人会发展成为糖尿病足， 它是一种糖尿病最常见的 并发症。 而且会有6的人需要接受终身治疗。 糖尿病足是全世界花费最高的一种慢性疾 病

8、， 患者截肢率也很高。 0003 伤口根据其愈合的病理学过程和愈合时间不同可分为急性伤口和慢性伤口。 0004 急性伤口被定义为可以在两到三个月内自行修复的伤口， 比如手术切口、 II度烧 伤烫伤伤口、 浅层皮外伤、 皮肤急性放射性I度损伤， II度压疮等均为急性伤口。 急性伤口的 愈合遵循有序的病理学过程， 一般包括炎症反应期、 肉芽增生期和组织重塑期三个阶段 Ramasastry S S.Clinics in plastic surgery,2005。 在伤口形成初期， 伤口处会迅速 形成血栓防止血液流失， 快速合成临时细胞外基质(ECM)并形成结痂， 为伤口处细胞的生长 和迁移提供良好的

9、环境和支架； 同时血小板会招募中性粒细胞和巨噬细胞到伤口处， 吞噬 伤口表面的微生物和基质碎片， 防止感染， 这个过程称为炎症阶段， 炎症阶段大概持续一周 左右， 之后进入伤口愈合阶段。 在愈合过程中， 伤口处发生再上皮化， 并生成新生血管为伤 口修复提供营养供给， 成纤维细胞发生迁移， 并发生胶原沉积， 直至伤口完全愈合Nunan R,et al.,Disease Models and Mechanisms,2014。 0005 慢性伤口被定义为超过三个月机体无法修复的伤口。 慢性伤口一般分为静脉性溃 疡、 动脉性溃疡、 创伤性溃疡、 压力性溃疡、 糖尿病溃疡这五大类。 糖尿病伤口作为一种典

10、型 的慢性伤口， 其难以愈合的原因主要包括以下几点： (1)高血糖使白细胞吞噬细菌的能力减 弱， 使伤口处更易受细菌感染， 炎症反应期延长； (2)外围神经病变和局部缺血使血管容易 发生病变并且新生血管不足， 使局部组织的修复能力减弱； (3)血管新生不足进一步导致伤 口处的细胞生长、 迁移受到破坏， 表皮新生减少； (4)伤口处的炎症因子过量表达引起伤口 处的基质金属蛋白酶表达升高， 导致伤口处的细胞质基质过度破坏， 胶原合成减少Rask- Madsen C,et al.,Cell metabolism,2013。 糖尿病伤口的局部组织长期处于缺血， 感染的 状态， 后期极易发展为坏疽， 最

11、终导致截肢甚至危及生命Jeffcoate W J,et al.,The lancet,2003。 临床流行病学研究结果显示由糖尿病溃疡引发下肢截肢的风险高达80以 说 明 书 1/11 页 3 CN 108261557 A 3 上， 而且糖尿病溃疡即使治愈也极易复发Reiber G E,et al.,Diabetes in America, 1995。 因此， 对于糖尿病伤口的控制和治疗有重大的临床意义。 目前临床上控制并治疗糖 尿病足的方法包括： 减压疗法、 手术清创、 控制血糖、 抗生素、 促进血管新生药物或者生长因 子Jeffcoate W J,et al.,The lancet,200

12、3。 对于糖尿病伤口的治疗， 除了控制患者血 糖之外， 防止伤口处感染并且促进血管新生是促进伤口愈合的重要因素。 0006 伤口敷料在伤口愈合方面的应用越来越广泛。 理想的伤口敷料应具有预防感染， 为创面提供湿润环境， 吸收渗液， 促进伤口愈合， 良好的组织可吸收性和组织相容性， 安全 无毒无过敏原， 透气并且容易制备， 价格便宜等特点Amin N,et al.,Worldjournal ofdiabetes,2016。 传统敷料如纱布虽然具有透气、 吸收渗液的作用， 但会导致伤口与敷料 发生粘连， 对患者造成二次伤害。 若皮肤产生直径大于4cm的伤口， 机体便不能自我修复， 此 时需要考虑自

13、体移植和异体移植的治疗MacNeil S.Materials today,2008。 目前， 自体 断层皮移植是临床上针对皮肤创伤公认的标准疗法， 但对于大面积皮肤受损的患者， 一方 面患者需面临身体多处受伤， 另一方面也面临供区皮肤不足的问题S, et al.,Burns,2010。 异体皮肤移植也存在发生免疫排异反应以及感染病原微生物等风 险。 并且对于慢性伤口， 往往选择比较保守的治疗手段， 要保持伤口的湿润并且预防感染， 保护并引导伤口处进行正常的修复过程。 因此， 开发一种理想的可以促进慢性伤口愈合的 伤口敷料具有很大的临床价值和应用前景。 0007 皮肤组织工程的发展为这一需要提供

14、了新的思路。 理想的皮肤组织敷料应具有可 为皮肤损伤处细胞提供有利于其增殖和迁移的微环境， 为细胞生长提供支架， 促进伤口处 成血管化， 以及良好的生物可降解性， 临床易操作性和价格合理等生物学特点Metcalfe A D ,et al .,Biomaterials ,2007； Zahedi P ,et al .,Polymers for Advanced Technologies,2010。 在结构上应具有三维支架结构和高孔隙率， 为皮肤损伤处细胞生长 提供支撑作用， 引导皮肤组织再生。 0008 近年来， 静电纺丝技术的发展， 为皮肤创伤修复提供了一个很好的选择。 利用静电 纺丝技术合成

15、的生物支架， 可以高度的模拟人体的细胞质基质结构， 为细胞的粘附， 生长， 迁移提供了3D的支架。 并且这一优势很多研究已经在动物体内证明。 除了静电纺丝本身有 利于伤口修复的优势以外， 它作为细胞， 药物或者生长因子载体， 也被广泛的应用。 细胞， 药 物或者生长因子这些添加物质可以作为伤口修复过程中其主要作用的活性成分。 目前这一 治疗方案提高了一定的治疗效果， 但是它们也存在很多的缺点， 药物的副作用， 异体细胞很 容易引起机体的排异反应， 生长因子本身来源少， 而且添加量控制不好可能引起肿瘤的发 生。 细胞和生长因子来源少， 制备过程繁琐， 保存条件要求高， 这些因素制约了它们临床方

16、面的发展。 所以人们现在探索利用生物大分子自身刺激伤口处的细胞生长， 迁移， 并且刺激 血管新生等。 0009 目前， 使用明胶静电纺丝工艺来制备纳米纤维成为研究创口包覆材料和止血敷料 的热点。 卢伟鹏等( 明胶科学与技术 ， 2013年第33卷第1期)报道了： 利用明胶与聚己内酯 静电纺丝制备纳米纤维。 通过细胞培养实验， 显示纤维能够促进细胞的粘附与增殖。 将复合 纤维与医用纱布作用在受伤白鼠的创面， 证明明胶纤维具有更快的伤口愈合能力。 0010 朱锐钿等( 材料导报 ， 2008年第22卷第5期)报道了： 以聚己内脂和明胶在三氟乙 醇中共混后， 静电纺丝得到纳米敷料， 可用于伤口愈合等

17、组织工程领域。 说 明 书 2/11 页 4 CN 108261557 A 4 0011 生物活性陶瓷作为一种生物活性材料， 可以释放出各种离子到细胞环境中刺激细 胞分泌各种生长因子， 调节细胞的生长和行为， 预示着其可以用于生物组织工程的应用中。 传统的研究中， 生物陶瓷材料多与明胶通过静电纺丝， 以制备用于骨组织(例如牙周组织) 生成的再生材料， 例如卢伟鹏等( 明胶科学与技术 ， 2013年第33卷第1期)报道了： 利用静 电纺丝技术， 制备了 -磷酸三钙与明胶杂化的纳米纤维引导组织再生膜， 这种明胶杂化膜 可用于牙周组织的再生。 朱锐钿等( 材料导报 ， 2008年第22卷第5期)报道

18、了： 将明胶与羟 磷灰石共混后进行静电纺丝， 得到用于引导骨质细胞再生的复合纳米纤维膜。 鉴于生物活 性陶瓷材料优越特性， 因此引起了将其与明胶或聚己内脂进行静电纺丝制备生物材料膜的 研究。 0012 郑均元( 中国组织工程研究与临床康复 ， 2010年第14卷第16期)报道了： 采用静 电纺丝方法制备 -TCP/Gel引导组织再生膜后， 其与已知生物相容性较好的聚乳酸(PLLA) 膜、 聚丙交酯/乙交酯(PLGA)膜进行比较， 前者不仅在形态与成分上更加近似天然细胞外基 质， 同时又具有良好的生物相容性与生物活性。 0013 然而， 以上涉及明胶与生物陶瓷的静电纺丝生物膜， 或聚己内脂与生物

19、陶瓷的静 电纺丝生物膜， 其都是用于骨组织或硬组织形成的应用中， 并不适合软组织伤口愈合、 特别 是糖尿病引起的皮肤或肌肉组织创伤的医用辅料。 0014 因此， 目前亟需一种能用于糖尿病伤口愈合的新型生物创伤敷料。 发明内容 0015 本发明采用静电纺丝技术将明胶与聚己内酯混合， 突破常规思路， 引入现有技术 中仅用于硬组织修复的生物活性陶瓷磷酸二正硅酸钙(NAGEL)颗粒， 纺织出一种具有无序 三维孔隙结构的薄膜。 即， 本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜， 所述复合纳米纤 维膜为有机/无机复合的纳米纤维材料。 当施用于软组织伤口时， 随着伤口部位的生物活性 陶瓷的降解， 硅离子和钙离

20、子会释放入细胞环境中， 刺激促伤口愈合因子的释放， 利用其本 身的生物活性陶瓷的特性加速伤口愈合， 而不需要额外添加促生长因子等。 因此， 本发明用 于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜可以协同静电纺丝和生物活性陶瓷促进糖尿病伤口 愈合， 尤其是促进糖尿病引起的软组织伤口的愈合。 0016 本发明的目的之一是提供一种用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜的制备方 法， 将聚己内脂、 明胶、 磷酸二正硅酸钙通过电纺制备所述用于软组织伤口愈合的复合纳米 纤维膜。 0017 本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜的制备方法， 所述方法包括： (1)将 聚己内脂、 明胶、 磷酸二正硅酸钙溶于HFIP中， 搅

21、拌得到混合溶液； (2)将所述混合溶液进行 电纺， 收集得到纤维膜； (3)将所述纤维膜浸泡在戊二醛/乙醇溶液中进行固定， 得到所述用 于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜。 0018 具体地， 所述方法包括以下步骤： 0019 (1)将聚己内脂(PCL)、 明胶(gelatin)、 磷酸二正硅酸钙(NAGEL)以10-50： 10-50： 10-50的重量比， 溶解于六氟异丙醇(HFIP)中， 置于磁力搅拌器上以600rpm/min的转速常温 搅拌6-18h得到均一的， 质量浓度为10-25混合电纺溶液； 0020 (2)将所制得均一的混合电纺溶液置于电纺丝装置上， 以电压8-12Kv， 流速0

22、.01- 说 明 书 3/11 页 5 CN 108261557 A 5 0.04ml/min， 间距为8-15cm， 沉积时间为80-200min， 为参数室温条件下进行电纺； 并采用滚 筒(100-1000r/min)进行收集； 0021 (3)将电纺过程所收集的纤维膜浸泡在戊二醛/乙醇溶液(1:3-3:1,v/v)中进行交 联固定， 交联固定时间为3-6h， 交联后的纤维膜用大量的去离子水冲洗； 常温干燥； 得到所 述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜。 0022 其中， 步骤(1)中， 优选地， 所述PCL： gelatin： NAGEL的重量比为30-50： 30-50： 10- 5

23、0； 进一步优选地， 为50： 50： 10， 50： 50： 30或50： 50： 50； 更进一步优选地， 为50： 50： 10或50： 50： 30。 0023 其中， 步骤(2)中， 所述电纺过程所采用的电纺条件优选地为， 常温条件下， 电压 10Kv， 流速0.025ml/min， 间距为12cm， 沉积时间为150min； 滚筒转速为300rpm/min。 0024 其中， 步骤(3)中， 优选条件为戊二醛/乙醇溶液体积比1:1； 交联时间3h。 0025 固定后还可以包括步骤： 固定后的纤维膜用大量去离子水冲洗， 并且浸泡过夜， 取 出， 常温干燥。 0026 本发明中， 所述

24、用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜可直接作用于伤口上， 促 进伤口愈合。 0027 本发明的另一个目的提供一种用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜， 所述复合 纳米纤维膜包含聚己内脂、 明胶、 磷酸二正硅酸钙。 其中， 所述复合纳米纤维膜通过对由聚 己内脂、 明胶、 磷酸二正硅酸钙组成的混合溶液进行电纺制备而成。 0028 本发明的另一个目的是提供一种通过上述方法制备得到的用于软组织伤口愈合 的复合纳米纤维膜， 其可以用来制备用于促进软组织伤口愈合的敷料。 0029 其中， 所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜具有无序三维孔隙结构的薄 膜； 纤维呈现无序状态， NAGEL在共纺的条件下纺入到纤

25、维内部， NAGEL在纤维内部均匀分 布， 所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜具有较高的亲水性。 0030 本发明中， 所述软组织伤口包括皮肤或肌肉的烧伤、 手术或意外创伤等软组织伤 口， 或由疾病， 例如糖尿病、 癌症或肿瘤、 溃疡引起的伤口， 不包括硬组织伤口， 例如骨组织 及其附属细胞、 粘膜， 牙组织及其牙周细胞、 粘膜的伤口。 优选地， 所述伤口是糖尿病引起的 伤口， 包括I型、 II型糖尿病引起的伤口。 0031 本发明中， 所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜可以用于制备促进软组织 伤口愈合的敷料。 0032 本发明的另一个目的是提供一种用于促进软组织伤口愈合的敷料的制备方

26、法， 所 述方法包括： 0033 (a)按上述方法制备用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜； 0034 (b)将所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜通过常规方法制备得到所述促 进软组织伤口愈合的敷料。 0035 本发明的另一个目的是提供一种由上述方法制备得到的用于促进软组织伤口愈 合的敷料。 0036 本发明中， 所述敷料通过涂布、 粘附、 缝合、 压制将所述纤维膜固定在支持载体上， 可以以绒布、 网或网眼样结构的形式存在。 0037 本发明中， 所述敷料以带、 线、 纤维、 颗粒、 滴剂或膏剂或糊剂或搽剂、 网或网眼样 说 明 书 4/11 页 6 CN 108261557 A 6 结构、

27、片、 膜、 箔或层压制件的形式存在。 0038 本发明中， 所述敷料包括创可贴、 ok绷、 止血绑带等。 0039 本发明中， 所述敷料可以接种治疗性药物； 所述药物是促进伤口愈合的细胞、 细胞 因子、 抗生素； 所述细胞因子包括： 白介素、 生长因子、 抗体。 0040 本发明的另一个目的是提供由所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜或用 于软组织伤口愈合敷料在制备促进软组织伤口愈合的医疗产品的用途。 0041 在具体实施方案中， 所述软组织伤口包括皮肤或肌肉的烧伤、 手术损伤、 意外创伤 等软组织伤口， 或由疾病， 例如癌症或肿瘤、 糖尿病、 溃疡引起的伤口， 不包括硬组织伤口， 例如骨组

28、织及其附属细胞、 粘膜的伤口， 牙组织及其牙周细胞、 粘膜的伤口。 在更具体的实 施方案中， 所述伤口是糖尿病引起的伤口， 包括I型、 II型糖尿病。 0042 术语和定义 0043 术语 “磷酸二正硅酸钙” ， 是一种含有Ca、 Si和P的三元组分的化合物， 分子式为 Ca7Si2P2O16， 商品名为NAGEL。 磷酸二正硅酸钙生物陶瓷采用溶胶-凝胶方法进行合成 Ca7Si2P2O16粉体， 并在1400下煅烧该粉体而制成该生物陶瓷， 也通过直接购买市售的成 品。 研究证明， 该生物活性陶瓷用作人体硬组织修复具有良好的生物活性， 在模拟体液中有 良好的诱导磷灰石矿化的能力， 同时能够促进牙

29、周膜细胞和骨髓基质干细胞的成骨分化， 已经用于骨组织、 牙组织等硬组织的修复和愈合。 0044 术语 “10-50： 10-50： 10-50的重量份比例” ， 指三种成分按所述重量份进行比较， 因 此凡是使用其他比例的形式， 例如质量或重量含量百分比， 体积百分比等， 只要换算成重量 份之后落入上述范围， 这种其他比例的形式都与该术语的含义相同。 0045 术语 “医疗产品” 是利用本发明所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜或其 制备的辅料， 再加工制成的各种常规的医用产品， 例如医用止血工具包、 器械等。 0046 本发明的有益效果在于， 本发明通过静电纺丝技术制备了用于软组织伤口愈合的

30、 复合纳米纤维膜， 所述复合纳米纤维膜为含磷酸二正硅酸钙(NAGEL)的生物陶瓷材料； 通过 系统研究， 结果显示本发明复合纳米纤维膜具有良好的表面理化性质和成血管化能力， 能 够促进伤口愈合， 促进表皮形成， 减少炎症反应， 增加胶原沉积， 能够用于新型的创面修复 敷料。 所述复合纳米纤维膜能够显著缩短软组织慢性伤口尤其是糖尿病创伤的愈合时间， 促进创伤区域的血管新生、 表皮再生和胶原形成， 并且减少慢性伤口处炎症反应， 对软组织 创伤修复具有很好的应用前景。 0047 相比于现有技术中的只限于硬组织伤口修复的磷酸钙或硅酸钙的生物陶瓷材料， 本发明制备的复合纳米纤维膜可广泛用于各类软组织的伤

31、口愈合中， 能够更快地降解， 并 促进伤口愈合， 极大地扩展了生物陶瓷材料的应用范围， 为国内相关研究和应用填补了空 白， 具有极好的市场应用前景。 附图说明 0048 图1为实施例1中所制备得到的材料的电镜图； 其中， 图1A为PL组纳米纤维放大 5000倍的图片扫描电镜图片； 图1B为PL组纳米纤维透射电镜的图片； 图1C为10NAG-PL组的 纳米纤维放大5000倍的图片扫描电镜图片； 图1D为10NAG-PL组纳米纤维透射电镜的图片； 图1E为30NAG-PL组的纳米纤维放大5000倍的图片扫描电镜图片； 图1F为30NAG-PL组纳米纤 说 明 书 5/11 页 7 CN 10826

32、1557 A 7 维透射电镜的图片。 0049 图2为实施例1中所制备得到的材料的元素分析以及亲水性分析； 图2A为PL组纳米 纤维不含有Si和Ca元素； 图2B为10NAG-PL组纳米纤维含有Si和Ca元素； 图2C为30NAG-PL组 纳米纤维含有Si和Ca元素， 相对于10NAG-PL组元素含量明显升高了； 图2D为PL组纳米纤维 的亲水性分析， 可以观察到材料亲水性比较差； 图2E为10NAG-PL组纳米纤维亲水性检测， 说 明添加了NAGEL陶瓷的材料亲水性明显改善； 图2F为30NAG-PL组纳米纤维亲水性检测， 同样 说明添加了NAGEL陶瓷的材料亲水性明显改善； 0050 图3

33、为实施例2中制备得到的材料促进人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)， 人成纤维 细胞(HSF)和角质形成细胞(HaCaT)的增殖； 图3A为人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在材料 上增殖的实验结果统计图； 图3B为人成纤维细胞(HSF)在材料上增殖的实验结果统计图； 图 3C为角质形成细胞(HaCaT)在材料上增殖的实验结果统计图。 0051 图4为实施例3中制备得到的材料促进人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的迁移和粘 附； 图4A为人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)经过材料处理以后的Transwell小室的实验图 片； 图4B为A图片的数据统计图； 图4C为人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC

34、)经过材料处理以后 的划线实验图片； 图4D为C图片的数据统计图； 图4E为人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在材 料上生长的粘附效果(上)扫描电镜的图片(下)， 可以观察细胞在材料上的伸展状态； 图4F 为人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在材料上生长的粘附效果的细胞统计图。 0052 图5为实施例4中制备得到的材料促进糖尿病小鼠的伤口愈合； 图5A为不同组材料 对糖尿病伤口小鼠的伤口愈合的效果； 图5B为不同组材料对糖尿病伤口小鼠的伤口愈合的 效果的模拟图； 图5C为不同组材料对糖尿病伤口小鼠的伤口愈合的效果的面积统计图。 0053 图6为实施例5中制备得到的材料促进糖尿病小鼠伤口的表皮再

35、生； 图6A为不同材 料组的皮肤切片染色， 主要展示材料促进表皮迁移的效果； 图6B为不同材料组的皮肤切片 染色， 主要展示材料促进表皮增殖的效果； 图6C为不同材料组的皮肤切片免疫组化图， 主要 展示材料促进表皮增殖的效果； 图6D为图C的数据统计图； 图6E为不同材料组的皮肤切片免 疫荧光图， 主要展示材料促进表皮分化的效果。 0054 图7为实施例5中制备得到的材料促进糖尿病小鼠伤口的胶原累计； 图7A为第7天 的伤口处组织的I型胶原和III型胶原蛋白表达； 图7B为第7天的伤口处组织的I型胶原和 III型胶原基因表达； 图7C为第7天的伤口处组织的III型胶原基因表达； 图7D为第15

36、天的伤 口处组织的I型胶原基质金属蛋白酶的表达； 图7E为Masson三色染色的效果图显示伤口处 的胶原再生； 图7F为图E的数据统计图。 0055 图8为实施例5中制备得到的材料促进糖尿病小鼠伤口区域的血管新生； 图8A为不 同时间点对伤口处的皮肤进行取样观察伤口处的血管再生的情况； 图8B为图A中第7天的血 管数目统计图； 图8C为图A中第11天的血管数目统计图； 图8D为图A中第15天的血管数目统 计图； 图8E为第7天伤口处的皮肤切片进行CD31免疫荧光染色； 图8F为图E中的血管数目的 统计图图8G为第15天伤口处的皮肤切片进行CD31免疫荧光染色； 图8H为图G中的血管数目 的统计

37、图。 0056 图9为实施例6制备得到的材料具有良好的生物相容性和生物可吸收性； 图9A为不 同时间点对埋入皮肤下的材料进行取样观察材料的降解的情况； 图9B为不同时间点对埋入 皮肤下的材料进行Masson三色染色观察材料的降解。 说 明 书 6/11 页 8 CN 108261557 A 8 具体实施方式 0057 结合以下具体实施例和附图， 对本发明作进一步的详细说明。 实施本发明的过程、 条件、 实验方法等， 除以下专门提及的内容之外， 均为本领域的普遍知识和公知常识， 本发 明没有特别限制内容。 0058 实施例1： 制备本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜 0059 将PCL、

38、gelatin以及NAGEL同时溶解在适量的六氟异丙醇(10-25， m/v)溶剂 中， 三种组分的添加量如表1中各组所示， 磁力搅拌转速600rpm/min， 得到均一的混合电纺 溶液， 同时设立对照组A0， 见表1。 0060 表1 0061 测试组聚己内酯， wt明胶， wtNAGEL， wt A0组(PL)50500 A1组(30NAG-PL)505030 A2组(10NAG-PL)505010 0062 其中， 所述PL是指不含NAGEL； 0063 其中， 所述10NAG-PL是指NAGEL的含量为10。 0064 其中， 所述30NAG-PL是指NAGEL的含量为30。 0065

39、 将所制得的混合电纺溶液进行电纺， 电纺条件直流正高压10.0Kv， 流速0.025ml/ min， 间距12cm， 沉积时间150min， 采用滚筒进行收集， 滚筒转速300rpm/min。 0066 将所收集的纤维膜浸泡在戊二醛/乙醇(1:1， v/v)溶液中进行固定， 固定时间3h。 固定后的纤维膜用大量去离子水冲洗， 并且浸泡过夜， 取出， 常温干燥， 得到所述用于软组 织伤口愈合的复合纳米纤维膜(静电纺丝生物材料)。 0067 图1为所制备的用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜的电镜照片。 0068 图1A-B为PL的扫描电镜图， 图1C-D为10NAG-PL的扫描电镜图、 图1E-F

40、为30NAG-PL 的扫描电镜图。 0069 由图1可知， 由于纤维呈现无序状态， NAGEL在共纺的条件下纺入到纤维内部。 NAGEL为10时， NAGEL分布更为均匀， 因此10NAG-PL的纺织效果优于PL和30NAG-PL， 并且可 以预测随着NAGEL含量提高。 0070 图2AC为实施例1制备得到的材料元素含量的分析； 图2D图2F分别为PL、 10NAG-PL、 30NAG-PL的亲疏水性测试图。 图2表明材料已经成功的制备， 并且加入生物活性 陶瓷的材料亲水性也明显得到了提高， 并且可以预测随着NAGEL的含量加入材料的亲水性 变好。 0071 实施例2： 研究本发明用于软组织

41、伤口愈合的复合纳米纤维膜对于伤口修复过程 中细胞增殖的影响 0072 将实施例1中制备的各组材料剪裁成10mm的圆形片状， 于75的酒精中浸泡 30min， 灭菌的PBS清洗2次， 放入48孔板中备用。 分别将人脐静脉血管内皮细胞， 人成纤维细 胞， 人角质形成细胞种植在样品表面， 每孔6103个细胞， 使用的培养基分别为加有5FBS 以及生长因子的ECM培养基， 10FBS的DMEM培养基和10FBS的1640培养基， 培养温度为37 说 明 书 7/11 页 9 CN 108261557 A 9 ， 培养气氛为含5CO2的空气， 培养基每两天更换一次。 用CCK8法来测试细胞在材料表面 的

42、增殖情况。 细胞培养1、 3、 7天后， 避光在48孔板中加入CCK8溶液， 在37下再培养2-4h。 用 分光光度计在波长为450nm处测试溶液的吸光值。 CCK8值用吸光度表示， 吸光度与材料表面 活细胞的数量成正比。 0073 图3为三种细胞(人脐静脉血管内皮细胞HUVEC， 人成纤维细胞HSF和角质形成细胞 HaCaT)在不同类型生物陶瓷复合材料表面的增殖情况。 0074 图3A-图3C结果显示， 培养1， 3， 7天后， 三种细胞在各组生物陶瓷复合材料表面的 增殖能力良好， 随着时间的延长， 细胞数目也相应的增多， 且相对于PL和30NAG-PL， 三种细 胞在10NAG-PL材料上

43、的增殖能力最强。 0075 图3的结果进一步验证了图1-2中扫描电镜所显示的10NAG-PL具有更好的亲水性 效果， 可以显著提高细胞的增殖能力， 且具有显著提高的细胞相容性。 0076 实施例3： 研究本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜对于人血管形成细 胞的迁移、 粘附的影响 0077 将对数期的HUVEC细胞用胰酶进行消化， 消化后， 将细胞接种在24孔板中， 待细胞 密度为培养皿底部90左右时， 用无菌的中枪头轻轻划出一条直线， 吸去培养基， PBS洗两 次。 24孔板的上部加上transwell小室， 里面加入实施例1制备的材料， 加满培养基将细胞置 于5CO2培养箱中培养。 培

44、养6-8小时在OLYMPUS显微镜下拍照， 统计迁移细胞的数目。 0078 向装有Boyden小室的24孔细胞培养板底部加入不同的材料小室下侧加入600 L含 有10血清的内皮细胞培养基。 小室上侧接入100 L含有4104个细胞的培养基不含血清， 于375CO2培养箱中进行孵育， 孵育时间为6-8小时。 染色观察。 0079 血管内皮细胞培养48小时， 样品从培养基中取出， 用浓度为4的多聚甲醛溶液固 定， PBS清洗后， 用DAPI染料对细胞核染色。 材料表面的细胞的粘附的数目显微镜观察。 并且 用扫描电镜观察血管内皮细胞在材料上铺展的形态。 0080 图4显示的是本发明用于软组织伤口愈合

45、的复合纳米纤维膜可以促进血管内皮细 胞的体内迁移。 0081 图4A为细胞结晶紫染色结果， 其中相对于空白对照(不添加任何辅料)、 PL组、 30NAG-PL组， 10NAG-PL组呈现更加致密均匀的细胞迁移效果。 0082 图4C显示内皮细胞划线实验迁移的效果， 随着时间的增加， 细胞逐渐向中间迁移， 10NAG-PL组的细胞总体迁移的相对于其他组快。 0083 图4E显示内皮细胞粘附在不同材料表面的静电扫描图， 图中显示了内皮细胞的粘 附形态， 各组材料之间的伸展状态没有明显的差别。 0084 由图4可以说明， 相对于PL组和30NAG-PL组， 10NAG-PL组可以显著促进内皮细胞的

46、迁移和粘附。 0085 当施用于组织伤口时， 随着伤口部位的生物活性陶瓷的降解， 硅离子和钙离子会 释放进入细胞环境中， 刺激促伤口愈合因子的释放， 利用其本身的优势去加速伤口愈合， 而 不需要额外的添加促生长因子等。 随着NAGEL含量的增加， 30NAG-PL组在纤维的结构组成、 亲水性以及伤口愈合能力等方面并没有显著优于10NAG-PL组， 考虑到时间和生产成本， 以 10NAG-PL组为基础， 对其其体内促进软组织伤口愈合的能力作进一步研究。 0086 实施例4： 体内全层创伤修复实验 说 明 书 8/11 页 10 CN 108261557 A 10 0087 用60mg/Kg的剂量

47、对30只18g的雄性BALB/c实验鼠(国家啮齿类实验动物资源中 心， 中国上海分公司)进行诱导， 连续诱导5天， 测血糖， 血糖值升高的数值达到300mg/dl既 可说明小鼠被成功诱导为糖尿病小鼠， 可以用于后续的实验。 将小鼠背部区域的毛发去除 后， 建立一个完整的厚度伤口(直径为8mm)。 将创面修复材料分别植入小鼠创伤区域， 它们 分别是： (1)空白对照组(Control)； (2)PL组； (3)10NAG-PL组。 实验前， 各组材料用75的酒 精浸泡灭菌30min， 后用灭菌的PBS清洗2次。 植入伤口部位后小鼠背部创伤区域用医用透明 敷料固定。 手术后， 小鼠被分别关在SPF

48、环境下， 保证充足水以及食物。 利用数码相机在固定 的时间点(1， 3， 5， 7， 9， 11， 13天)固定的距离以及角度记录创伤区域的变化情况。 0088 图5为空白对照组、 PL组和10NAG-PL组的糖尿病小鼠背部创伤区域， 创伤面积随时 间的变化情况。 0089 其中， 图5A显示糖尿病小鼠创伤修复的效果， 第七天时， 10NAG-PL组糖尿病小鼠背 部创伤面积减少了57， 对照组减少了18， PL组减少了42。 第13天时， 10NAG-PL组糖尿 病小鼠背部创伤面积减少了94， 对照组减少了69， PL组减少了82。 说明10NAG-PL组相 对于PL组和空白对照组有明显促进伤口愈合的效果。 0090 其中， 图5B显示糖尿病小鼠创伤修复的模拟效果图， 以更直观地反映伤口的愈合 效率。 0091 其中， 图5C显示糖尿病小鼠创伤修复的统计图， 从另一角度反应创伤修复的效果。 0092 与空白对照组和PL组相比， 10NAG-PL组糖尿病小鼠伤口愈合速度明显更快。 0093 实施例5： 研究本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜对小鼠体内的创面 修复质量的影响及其相关机理 0094 5.1创伤区域组织形态分析 0095 每组每次5只7天、 11天、 15天时处死， 取出创伤区域周围的组织标本(2mm左右)进 行组织