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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810463765.7 (22)申请日 2018.05.15 (71)申请人 太原理工大学 地址 030024 山西省太原市万柏林区迎泽 西大街79号 (72)发明人 桑胜波 申治中 张虎林 张益霞 张强 段倩倩 菅傲群 冀健龙 袁仲云 (74)专利代理机构 太原高欣科创专利代理事务 所(普通合伙) 14109 代理人 崔雪花 冷锦超 (51)Int.Cl. A61L 27/40(2006.01) A61L 27/38(2006.01) A61L 27/24(2006.01。
2、) A61L 27/50(2006.01) A61L 27/60(2006.01) B33Y 10/00(2015.01) B33Y 50/02(2015.01) B33Y 70/00(2015.01) B33Y 80/00(2015.01) (54)发明名称 一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及组织工程皮肤技术领域， 具体为 一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 包括 两个部分， 一个部分是皮肤干细胞的提取技术， 一个部分是皮肤的生物3D重塑技术。 皮肤干细胞 提取包括： 组织获取及处理、 组织酶解、 原代细胞 培养、 传代培养等。 利用生物3D打印机， 采用。
3、三维 扫描建模技术， 打印原料及打印规格计算、 基底 打印、 分层打印， 逐层堆叠的方法， 打印出能完全 符合人体的特定部位、 特定三维特征的全定制皮 肤， 保证了人造皮肤与伤口的完全贴合， 提高了 移植成功率和治愈效果。 同时， 全定制皮肤也可 用于体外皮肤模型的研究， 在肿瘤研究、 药物及 化妆品测试等方面发挥巨大作用。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 108392676 A 2018.08.14 CN 108392676 A 1.一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 其特征在于， 包括如下依次进行的步骤： 3D扫描和皮肤建模， 使用三维扫描仪对人体皮肤受损部位进行扫描， 。
4、得到皮肤受损部 位的三维结构， 再用软件计算出伤口需要移植的全定制皮肤各个属性， 包括： PDMS基底三维 模型和皮肤构造模型； 建立符合皮肤受损部位三维结构的皮肤模型， 使得全定制皮肤完全 贴合伤口， 预估出需要干细胞的数量； 细胞提取， 提取0.1-0.3g人体皮肤组织， 经过清洗、 消毒、 称重、 切碎得到初步处理好的 皮肤组织， 加入相应的蛋白酶和胶原酶进行组织酶解， 得到游离的皮肤细胞组织液； 过滤得 到细胞液， 离心聚集细胞， 再将细胞接种到培养皿， 得到原代皮肤细胞； 原代培养， 取一部分原代细胞， 添加ROCK抑制剂进行培养， 经过传代培养， 得到所需要 量的表皮干细胞； 取一。
5、部分原代细胞， 不添加ROCK抑制剂进行培养， 经过传代培养， 培养出 所需要量的真皮干细胞； 3D分层打印， 先通过3D打印机打印出PDMS皮肤基底； 在PDMS基底上打印胶原凝胶层， 胶 原凝胶层上打印真皮细胞层， 在真皮细胞层上打印胶原凝胶层， 在胶原凝胶层上打印表皮 细胞层， 在表皮细胞层上再打印胶原凝胶层； 皮肤组织培养及移植， 将打印好的全定制皮肤转移到培养皿中， 恒温箱气液界面培养 2-10日， 待皮肤组织初步融合， 再移植到皮肤受损部位或进行体外皮肤模型试验。 2.如权利要求1所述的一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 其特征在于， 所述细 胞提取， 只需要提取少量人体组织。
6、， 进行细胞分离， 药物刺激， 传代培养， 即可得到足够量的 真皮干细胞和表皮干细胞。 3.如权利要求1所述的一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 其特征在于， 所述表 皮干细胞和真皮干细胞保存到液氮中， 以备打印使用； 需要打印的时候将细胞转移到打印 机的原料盒中即可。 4.如权利要求1所述的一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 其特征在于， 所述皮 肤构造模型包括皮肤的三维构造、 打印层的组成以及需要的细胞和凝胶原料。 5.如权利要求1所述的一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 其特征在于， 所述真 皮细胞层、 胶原凝胶层和表皮细胞层的层数和厚度根据实际需要进行建模计算确定。 。
7、6.如权利要求1所述的一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 其特征在于， 所述每 层胶原凝胶的打印过程为： 先打印一层交联剂， 在其上打印一层胶原凝胶， 再打印交联剂固 定本层； 细胞层的打印过程为： 先打印一层交联剂， 在其上打印一层胶原凝胶， 在凝胶上打 印一层细胞层， 再打印交联剂固定本层。 7.如权利要求1所述的一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 其特征在于， 所述胶 原凝胶材料也可以是其他生物可降解材料或者与其他生物可降解材料的混合物。 8.如权利要求1-7任一所述的一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法制成的全定制 皮肤。 9.如权利要求1-7任一所述的一种生物3D打印全。
8、定制皮肤及其制备方法制成的全定制 皮肤的使用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108392676 A 2 一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法 技术领域 0001 本发明一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 属于组织工程皮肤技术领域。 背景技术 0002 皮肤作为人体重要器官， 在隔离外部环境、 保护人体的正常运行上发挥不可替代 的作用。 炎症、 烧伤、 外伤等各种原因都会给我们皮肤带来损伤， 给我们身体健康及生活带 来巨大威胁。 根据实际需要， 出现了自体皮肤移植的方法， 但是成功率较低且皮肤来源有限 一直是这一方法的缺陷， 在大面积烧伤及特殊病人的治愈上受到极大限制。 0。
9、003 随着医疗技术的发展和进步， 出现了人造皮肤技术。 弥补了自体皮肤移植的缺陷， 只需要从自体皮肤中得到少量皮肤细胞即可体外培养出所需求的皮肤组织， 这在皮肤患者 治疗及皮肤组织的研究上发挥了巨大作用。 随着技术的进一步成熟， 已经可以培养出具有 和人体皮肤具有相同属性的全层皮肤， 但是， 目前的人造皮肤多为手工或者平面打印， 在生 产效率和治疗效果上都有所局限。 发明内容 0004 本发明克服现有技术的不足， 提供了一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 该技术采用三维扫描建模技术， 分层打印， 逐层堆叠的方法， 打印出人体特定位置、 特定厚 度、 特定形状的皮肤组织， 做到了根据实际。
10、需要而打印的全定制型皮肤。 0005 本发明一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 包括如下依次进行的步骤： 3D扫描和皮肤建模， 使用三维扫描仪对人体皮肤受损部位进行扫描， 得到皮肤受损部 位的三维结构， 再用软件计算出伤口需要移植的全定制皮肤各个属性， 包括： PDMS基底三维 模型和皮肤构造模型； 建立符合皮肤受损部位三维结构的皮肤模型， 使得全定制皮肤完全 贴合伤口， 预估出需要干细胞的数量； 细胞提取， 提取少量人体皮肤组织， 经过清洗、 消毒、 称重、 切碎得到初步处理好的皮肤 组织， 加入相应的蛋白酶和胶原酶进行组织酶解， 得到游离的皮肤细胞组织液； 过滤得到细 胞液， 离心聚。
11、集细胞， 再将细胞接种到培养皿， 得到原代皮肤细胞； 原代培养， 取一部分原代细胞， 添加ROCK抑制剂进行培养， 经过一段时间传代培养， 得 到所需要量的表皮干细胞； 取一部分原代细胞， 不添加ROCK抑制剂进行培养， 经过一段时间 传代培养， 培养出所需要量的真皮干细胞； 3D分层打印， 先通过3D打印机打印出PDMS皮肤基底； 在PDMS基底上打印胶原凝胶层， 胶 原凝胶层上打印真皮细胞层， 在真皮细胞层上打印胶原凝胶层， 在胶原凝胶层上打印表皮 细胞层， 在表皮细胞层上再打印胶原凝胶层； 所述真皮细胞层、 胶原凝胶层和表皮细胞层的层数和厚度根据实际需要进行建模计算 确定。 0006 皮。
12、肤组织培养及移植， 将打印好的全定制皮肤转移到培养皿中， 恒温箱气液界面 培养2-10日， 待皮肤组织初步融合， 再移植到皮肤受损部位或进行体外皮肤模型试验。 说 明 书 1/5 页 3 CN 108392676 A 3 0007 所述细胞提取， 只需要提取少量人体组织， 进行细胞分离， 药物刺激， 传代培养， 即 可得到足够量的真皮干细胞和表皮干细胞。 0008 所述表皮干细胞和真皮干细胞保存到液氮中， 以备打印使用； 需要打印的时候将 细胞转移到打印机的原料盒中即可。 0009 所述皮肤构造模型包括皮肤的三维构造、 打印层的组成以及需要的细胞和凝胶原 料。 0010 所述每层胶原凝胶的打印。
13、过程为： 先打印一层交联剂， 在其上打印一层胶原凝胶， 再打印交联剂固定本层； 细胞层的打印过程为： 先打印一层交联剂， 在其上打印一层胶原凝 胶， 在凝胶上打印一层细胞层， 再打印交联剂固定本层。 0011 所述胶原凝胶材料也可以是其他生物可降解材料或者与其他生物可降解材料的 混合物。 0012 一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法制成的全定制皮肤。 0013 一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法制成的全定制皮肤的用途。 0014 与现有技术相比， 本发明的有益效果在于： 本发明提供的一种全定制皮肤的制备， 根据建模， 把皮肤分为真皮细胞层、 表皮细胞 层、 水凝胶细胞层， 通过多层打印。
14、， 逐层堆叠的方式， 打印出接近于人体皮肤构造的全定制 皮肤， 是可以生成角质层和毛发的全功能皮肤。 本发明提供的全定制皮肤， 可用于各种皮肤 病， 如牛皮癣、 粉刺、 白化病等患者的皮肤修复。 也可用于烧伤、 糖尿病等患者的皮肤修复。 而且全定制皮肤与伤口完全吻合的特点， 保证了高的治疗成功率及更好的治愈效果。 0015 本发明利用新兴的3D打印技术， 在传统3D打印皮肤的基础上进行工艺改进， 经过 皮肤扫描建模、 打印原料及打印规格计算、 基底打印、 分层打印、 培养待用的皮肤制备过程， 打印出能完全符合人体的特定部位、 特定三维特征的全定制皮肤， 保证了人造皮肤与伤口 的完全贴合， 提高。
15、了移植成功率和治愈效果。 同时， 全定制皮肤也可用于体外皮肤模型的研 究， 在皮肤病、 肿瘤研究、 药物筛选及化妆品测试等方面发挥巨大作用。 0016 本发明全定制皮肤的打印， 皮肤组织经过培养后进行移植， 经过培养后的皮肤组 织保证了细胞健康的存活而且使得细胞之间有一定的黏合， 这样移植后伤口才能更好的愈 合， 保证了皮肤移植的成功率和更好的伤口治愈效果， 推动了医疗技术的进步。 附图说明 0017 图1为本发明皮肤干细胞提取流程图； 图2为本发明皮肤3D重塑流程图； 图3为本发明打印皮肤多层组成图 图中， 1为胶原凝胶层； 2为PDMS基底； 3为真皮干细胞层； 4为表皮干细胞层。 具体实。
16、施方式 0018 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明， 但是本发明的保护范围并不 限于这些实施例， 凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之 内。 0019 实施例1 说 明 书 2/5 页 4 CN 108392676 A 4 本发明一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 包括如下依次进行的步骤： 3D扫描和皮肤建模， 使用三维扫描仪对人体皮肤受损部位进行扫描， 得到皮肤受损部 位的三维结构， 再用软件计算出伤口需要移植的全定制皮肤各个属性， 包括： PDMS基底三维 模型和皮肤构造模型； 建立符合皮肤受损部位三维结构的皮肤模型， 使得全定制皮肤完全 贴合伤。
17、口， 预估出需要干细胞的数量； 细胞提取， 提取0.1g人体皮肤组织， 经过清洗、 消毒、 称重、 切碎得到初步处理好的皮肤 组织， 加入相应的蛋白酶和胶原酶进行组织酶解， 得到游离的皮肤细胞组织液； 过滤得到细 胞液， 离心聚集细胞， 再将细胞接种到培养皿， 得到原代皮肤细胞； 原代培养， 取一部分原代细胞， 添加ROCK蛋白激酶抑制剂Y-27632进行培养， 经过一段 时间传代培养， 得到所需要量的表皮干细胞； 取一部分原代细胞， 不添加ROCK抑制剂进行培 养， 经过一段时间传代培养， 培养出所需要量的真皮干细胞； 3D分层打印， 将PDMS基底模型及皮肤的构造模型分别转化为生物3D打印。
18、机的执行数 据， 并发送给打印机。 执行数据是指把构造模型的数据转化为打印机喷头工作路径及工作 状态的数据。 0020 先根据PDMS基底模型数据， 通过3D打印机加工出与人体伤口相仿的三维PDMS模 型， 作为皮肤打印的基底； 在PDMS基底上打印一层胶原凝胶， 胶原凝胶层上打印一层真皮细 胞层， 在真皮细胞层上打印三层胶原凝胶层， 在胶原凝胶层上打印一层表皮细胞层， 在表皮 细胞层上再打印一层胶原凝胶层； 皮肤组织培养及移植， 将打印好的全定制皮肤转移到培养皿中， 恒温箱气液界面培养 10日， 待皮肤组织初步融合， 再移植到皮肤受损部位或进行体外皮肤模型试验。 0021 实施例2 本发明一。
19、种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 包括如下依次进行的步骤： 3D扫描和皮肤建模， 使用三维扫描仪对人体皮肤受损部位进行扫描， 得到皮肤受损部 位的三维结构， 再用软件计算出伤口需要移植的全定制皮肤各个属性， 包括： PDMS基底三维 模型和皮肤构造模型； 建立符合皮肤受损部位三维结构的皮肤模型， 使得全定制皮肤完全 贴合伤口， 预估出需要干细胞的数量； 细胞提取， 提取0.2g人体皮肤组织， 经过清洗、 消毒、 称重、 切碎得到初步处理好的皮肤 组织， 加入相应的蛋白酶和胶原酶进行组织酶解， 得到游离的皮肤细胞组织液； 过滤得到细 胞液， 离心聚集细胞， 再将细胞接种到培养皿， 得到原代。
20、皮肤细胞； 原代培养， 取一部分原代细胞， 添加ROCK蛋白激酶抑制剂Y-27632进行培养， 经过一段 时间传代培养， 得到所需要量的表皮干细胞； 取一部分原代细胞， 不添加ROCK抑制剂进行培 养， 经过一段时间传代培养， 培养出所需要量的真皮干细胞； 3D分层打印， 将PDMS基底模型及皮肤的构造模型分别转化为生物3D打印机的执行数 据， 并发送给打印机。 执行数据是指把构造模型的数据转化为打印机喷头工作路径及工作 状态的数据。 0022 先根据PDMS基底模型数据， 通过3D打印机加工出与人体伤口相仿的三维PDMS模 型， 作为皮肤打印的基底； 在PDMS基底上打印一层胶原凝胶， 胶原。
21、凝胶层上打印一层真皮细 胞层， 在真皮细胞层上打印三层胶原凝胶层， 在胶原凝胶层上打印一层表皮细胞层， 在表皮 细胞层上再打印一层胶原凝胶层； 说 明 书 3/5 页 5 CN 108392676 A 5 皮肤组织培养及移植， 将打印好的全定制皮肤转移到培养皿中， 恒温箱气液界面培养6 日， 待皮肤组织初步融合， 再移植到皮肤受损部位或进行体外皮肤模型试验。 0023 实施例3 本发明一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法， 包括如下依次进行的步骤： 3D扫描和皮肤建模， 使用三维扫描仪对人体皮肤受损部位进行扫描， 得到皮肤受损部 位的三维结构， 再用软件计算出伤口需要移植的全定制皮肤各个属性。
22、， 包括： PDMS基底三维 模型和皮肤构造模型； 建立符合皮肤受损部位三维结构的皮肤模型， 使得全定制皮肤完全 贴合伤口， 预估出需要干细胞的数量； 细胞提取， 提取0.3g人体皮肤组织， 经过清洗、 消毒、 称重、 切碎得到初步处理好的皮肤 组织， 加入相应的蛋白酶和胶原酶进行组织酶解， 得到游离的皮肤细胞组织液； 过滤得到细 胞液， 离心聚集细胞， 再将细胞接种到培养皿， 得到原代皮肤细胞； 原代培养， 取一部分原代细胞， 添加ROCK蛋白激酶抑制剂Y-27632进行培养， 经过一段 时间传代培养， 得到所需要量的表皮干细胞； 取一部分原代细胞， 不添加ROCK抑制剂进行培 养， 经过一。
23、段时间传代培养， 培养出所需要量的真皮干细胞； 3D分层打印， 将PDMS基底模型及皮肤的构造模型分别转化为生物3D打印机的执行数 据， 并发送给打印机。 执行数据是指把构造模型的数据转化为打印机喷头工作路径及工作 状态的数据。 0024 先根据PDMS基底模型数据， 通过3D打印机加工出与人体伤口相仿的三维PDMS模 型， 作为皮肤打印的基底； 在PDMS基底上打印两层胶原凝胶， 胶原凝胶层上打印一层真皮细 胞层， 在真皮细胞层上打印两层胶原凝胶层， 在胶原凝胶层上打印一层表皮细胞层， 在表皮 细胞层上再打印两层胶原凝胶层； 皮肤组织培养及移植， 将打印好的全定制皮肤转移到培养皿中， 恒温箱。
24、气液界面培养2 日， 待皮肤组织初步融合， 再移植到皮肤受损部位或进行体外皮肤模型试验。 0025 所述细胞提取， 只需要提取少量人体组织， 所述提取量可以为0.1g、 0.15g、 0.2g、 0.25g或0.3g， 进行细胞分离， 药物刺激， 传代培养， 即可得到足够量的真皮干细胞和表皮干 细胞。 0026 所述真皮细胞层、 胶原凝胶层和表皮细胞层的层数和厚度根据实际需要进行建模 计算确定。 0027 所述表皮干细胞和真皮干细胞保存到液氮中， 以备打印使用； 需要打印的时候将 细胞转移到打印机的原料盒中即可。 0028 所述皮肤构造模型包括皮肤的三维构造、 打印层的组成以及需要的细胞和凝胶。
25、原 料。 0029 所述每层胶原凝胶的打印过程为： 先打印一层交联剂， 在其上打印一层胶原凝胶， 再打印交联剂固定本层； 细胞层的打印过程为： 先打印一层交联剂， 在其上打印一层胶原凝 胶， 在凝胶上打印一层细胞层， 再打印交联剂固定本层。 0030 所述胶原凝胶材料也可以是其他生物可降解材料或者与其他生物可降解材料的 混合物。 0031 本发明生物3D打印全定制皮肤及其制备方法制成的全定制皮肤， 由真皮干细胞层 和表皮干细胞层组成， 采用逐层打印， 多层堆叠的方式， 符合真实人体皮肤的结构组成， 是 说 明 书 4/5 页 6 CN 108392676 A 6 可以生成角质层和毛发的全功能皮。
26、肤。 所述真皮细胞层、 胶原凝胶层和表皮细胞层的层数 和厚度根据实际需要进行建模计算确定。 0032 一种生物3D打印全定制皮肤及其制备方法制成的全定制皮肤， 可用于各种皮肤 病， 如牛皮癣、 粉刺、 白化病等患者的皮肤修复。 也可用于烧伤、 糖尿病等患者的皮肤修复。 而且全定制皮肤与伤口完全吻合的特点， 保证了高的治疗成功率及更好的治愈效果。 所述 全定制皮肤， 也可用于制备人体特定部位皮肤的体外模型， 方便黑色素肿瘤及各种皮肤病、 药物筛选、 化妆品测试等研究。 0033 本发明提供的一种全定制皮肤的制备， 根据建模， 把皮肤分为真皮细胞层、 表皮细 胞层、 水凝胶细胞层， 通过多层打印，。
27、 逐层堆叠的方式， 打印出接近于人体皮肤构造的全定 制皮肤， 是可以生成角质层和毛发的全功能皮肤。 本发明提供的全定制皮肤， 可用于各种皮 肤病， 如牛皮癣、 粉刺、 白化病等患者的皮肤修复。 也可用于烧伤、 糖尿病等患者的皮肤修 复。 而且全定制皮肤与伤口完全吻合的特点， 保证了高的治疗成功率及更好的治愈效果。 0034 本发明提供的全定制皮肤， 也可用于制备人体特定部位皮肤的体外模型， 方便黑 色素肿瘤及各种皮肤病、 药物筛选、 化妆品测试等研究。 0035 全定制皮肤的打印， 保证了皮肤移植的成功率和更好的伤口治愈效果， 推动了医 疗技术的进步。 0036 本发明不会限制于本文所示的实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和新颖性 特点相一致的最宽范围。 说 明 书 5/5 页 7 CN 108392676 A 7 图1 说 明 书 附 图 1/3 页 8 CN 108392676 A 8 图2 说 明 书 附 图 2/3 页 9 CN 108392676 A 9 图3 说 明 书 附 图 3/3 页 10 CN 108392676 A 10 。