本发明提供了三维(3D)、多孔、生物可降解的和生物相容的组织工程化支架，其包括颗粒蛋壳膜(ESM)。更具体而言，至少25％w/w的支架是颗粒ESM，其基本上均匀地分布在其中，并且支架是基本上干燥的。已经令人吃惊地发现，这种支架在结构和功能上的表现都与现有支架相当，但是颗粒ESM的使用代表着显著更加成本有效的产品，以及降低的病原体风险和减少免疫学或毒物学问题的可能，该颗粒ESM是一种蛋工业的丰富副产物，主要由结构蛋白和细胞外基质组分——其包括胶原、透明质酸、糖胺聚糖、角蛋白样和弹性蛋白样蛋白质——组成。也提供了这种支架在组织工程化方法中的用途，其包括伤口护理、骨修复、神经再生、组织和器官再造以及组织和器官构建。这种方法可以是体外的或离体的以及体内的。简单地，也提供了用于生产特定支架的成本有效的方法。
在本领域，天然和合成材料都已经用于制备组织工程化支架。这种材料通常是聚合物，其能够形成3D构造并且提供适合的和足够的配体，以促进细胞迁移、黏着、增殖和/或新生细胞外基质产生。更具体的实例包括天然(纤维)蛋白质和多糖，例如那些细胞外基质(胶原、纤维蛋白、角蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖(例如透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸类肝素和乙酰透明质酸))和藻酸盐、果胶、脱乙酰壳多糖、纤维素(包括氧化再生纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素)和纤连蛋白。人工支架材料包括PLA(聚乳酸)、聚乙醇酸(PGA)和聚己酸内酯(PCL)、聚二烷酮(PDS)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(poly(ethylene oxide terephthalate))(PEOT)和聚(对苯二甲酸丁二醇酯)(PBT)、氮化硅和其共聚物例如聚丙交酯-共-乙交酯(PLAGA)和PEOT/PBT、羟基磷灰石、和磷酸钙(Ca-P)和其衍生物，例如硅酸盐化的磷酸钙和β-磷酸三钙(β-TCP)。
已知基于3D蛋白质的结构或基质有助于破损皮肤中的组织再生并且也可以促进慢性伤口比如溃疡的伤口愈合。商业上可得的基质的范例产品是Integra Dermal Regeneration Template(Integra Biosciences)和Oasis(Healthpoint，Smith&Nephew)。
Integra是一种由胶原和糖胺聚糖制造的开孔海绵并且指示用于全厚度皮肤修复。其使得细胞迁移通过该结构，其又促进其在组织再生过程中的再吸收。其具有空间填充特性并且尤其可用于治疗烧伤和慢性伤口。该产品的组成相对简单的并且制造相对简单，其包括胶原和GAG的水性悬浮液，随后冷冻干燥，以产生干燥稳定的海绵。
Oasis是源自猪小肠黏膜下层的层状或薄片样结构。其使得细胞附着至表面并且其通过伤口愈合过程被再吸收。其比空间填充更局部，但是在伤口愈合过程中被组织周转替代。但是，其不是开孔海绵。其是由脱细胞的ECM组成的相对复杂的产品。其制造相对昂贵。
近来，已经显示当作为完整的膜放置在破损皮肤上时，完整的母鸡蛋壳膜(ESM)可用于促进伤口愈合(Yang，J-Y等2003.Chang Gung Med J)。
ESM是一种复合的富含双层蛋白质的纤维结构，其出现在鸟蛋的蛋清和蛋壳之间。研究已经显示，这种膜包含按重量计约90％的蛋白质(包括胶原、弹性蛋白、纤连蛋白肽生长因子、卵转铁蛋白、赖氨酰氧化酶(lysl oxidase)和溶菌酶)和锁链素、异锁链素和糖胺聚糖(例如硫酸皮肤素、硫酸软骨素和透明质酸)。这些蛋白质密切反映了脊椎动物的细胞外基质的组分。ESM可容易通过各种机械方式与蛋壳和蛋的内部组分分开，以生产基本上纯的ESM制品。该程序是简单和低成本的，产生充足供应的低成本产品。
当作为完整的片材放置在皮肤伤口上时，ESM发挥半透膜功能并且允许湿蒸汽传输并因此控制创面中的水分。其特征与合成材料比如BiobraneTM类似。但是，适合在伤口愈合背景下使用的尺寸完整的ESM难以以商业上可用的量制备。完整的ESM需要人工制备，以维持可用的尺寸和甚至其将需要作为单个膜的镶嵌图案来使用。在加工期间，易碎的材料需要与残留的结合钙和相关联的蛋白组分分开以及防腐处理或末端消毒。结果，在这种背景下用于制造医学产品足够的处理和质量控制在技术上或经济上是不可行。
也已经提议了100-500μm ESM的粉末用于经局部施用路径治疗某些伤口(WO 2004/080428)。该提议的基础尚不清楚，并且还没有提供成功治疗的证据。
也已经提议了100-500μm ESM的粉末用于经全身性，尤其口服施用路径治疗与关节炎和其他炎症病况相关的疼痛和炎症(US 8580315)。
US 3196075和US 3194732也描述了尺寸在微米范围的ESM的颗粒(纤维和非纤维)以及它们作为植皮手术的备选方案应用于伤口。
现已经令人吃惊地发现颗粒ESM可用于形成成本有效的干燥组织工程化支架的基础，该支架与现有干燥支架在结构上——例如从强度和柔韧性角度——和功能上——例如作为用于细胞迁移和增殖以及3D组织形成的表面——的表现相当。这种支架也具有止血特性和伤口渗出物管理能力。
因此，在第一方面中，本发明提供了三维(3D)、多孔、生物可降解的和生物相容的组织工程化支架，其中至少约25％w/w的支架是在其中基本上均匀分布的颗粒蛋壳膜(ESM)并且支架是基本上干燥的。
组织工程化支架可以可选地描述为人工结构，更具体地描述为细胞外基质，能够在接种有活细胞和/或植入宿主生物体之后支撑3D组织形成。本发明的支架可以是干燥海绵或泡沫。本发明的支架不是凝胶，尤其不是水凝胶或水胶体凝胶，也不是织造的、非织造的或针织的纤维片状结构，例如毡。
根据本发明的“三维”(3D)物体是高度/深度、宽度和长度的物体，其中这些尺寸的任一个都不小于最大尺寸的5％，例如小于最大尺寸的10％、15％、20％或25％。3D物体可描述为空间填充(或空隙填充或腔填充)的实体。这些术语根据本发明应解释为在组织工程化背景中遇到的空间、空隙和腔。换句话说，3D结构不是片材、薄膜、膜、层或涂层。在某些实施方式中，所有的三个尺寸是容易肉眼可见，例如最短尺寸是至少2mm，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25或30mm。
如本文使用的，生物可降解的指支架在其使用位置处降解，使用位置可以是体内的或体外的。通常，支架将被设计为具有利于其期望用途的降解速率。这可以是与组织形成，或至少原位形成细胞外基质的速率匹配的速率。
如本文使用的，生物相容的指支架和其在使用位置处以及在宿主生物体内的降解产物的生理学，例如毒物学和/或免疫学耐受性。换句话说，接触活体系统而不产生不利作用的能力。预期本发明的ESM和支架基本上，例如实质上是无毒的和基本上，例如实质上是非免疫原性的。特别是对于接触身体的医疗设备的生物相容性和毒性的标准试验和可接受的阈值在国际标准机构标准ISO10993(医疗设备的生物评估)和其辅助标准中提供。本发明的支架优选地基本上符合ISO10993。
如本文使用的“多孔”指支架中存在离散的孔、空隙或开孔(这些术语可互换使用)，其可渗透流体和气体，即至少一部分离散的孔是相互连接的。支架的孔的尺寸可基本上是均匀的，在这种指标下表面积和/或结构或可以使不同的。可能有利地控制这种指标，以针对其期望用途优化支架，例如通过优化其物理特性(强度、柔韧性、生物降解的速率)和/或功能特性(细胞增殖、迁移和/或ECM产生)。例如，这可以通过控制生产条件和组分材料而实现。
孔径大小(或适合的情况下，平均或模式孔径大小)的范围可以是1μm至1000μm，例如1至950μm、1至900μm、1至850μm、1至800μm、1至750μm、1至700μm、1至650μm、1至600μm、1至550μm、1至500μm、1至450μm、1至400μm、1至350μm、1至300μm、1至250μm、1至200μm、1至150μm、1至100μm、1至50μm、1至25μm、1至10μm、2至1000μm、2至950μm、2至900μm、2至850μm、2至800μm、2至750μm、2至700μm、2至650μm、2至600μm、2至550μm、2至500μm、2至450μm、2至400μm、2至350μm、2至300μm、2至250μm、2至200μm、2至150μm、2至100μm、2至50μm、2至25μm、2至10μm、5至1000μm、5至950μm、5至900μm、5至850μm、5至800μm、5至750μm、5至700μm、5至650μm、5至600μm、5至550μm、5至500μm、5至450μm、5至400μm、5至350μm、5至300μm、5至250μm、5至200μm、5至150μm、5至100μm、5至50μm、5至25μm、5至10μm、50μm至1000μm、50至950μm、50至900μm、50至850μm、50至800μm、50至750μm、50至700μm、50至650μm、50至600μm、50至550μm、50至500μm、50至450μm、50至400μm、50至350μm、50至300μm、50至250μm、50至200μm、50至150μm、50至100μm、100μm至1000μm、100至950μm、100至900μm、100至850μm、100至800μm、100至750μm、100至700μm、100至650μm、100至600μm、100至550μm、100至500μm、100至450μm、100至400μm、100至350μm、100至300μm、100至250μm、100至200μm、100至150μm、200μm至1000μm、200至950μm、200至900μm、200至850μm、200至800μm、200至750μm、200至700μm、200至650μm、200至600μm、200至550μm、200至500μm、200至450μm、200至400μm、200至350μm、200至300μm、200至250μm、300μm至1000μm、300至950μm、300至900μm、300至850μm、300至800μm、300至750μm、300至700μm、300至650μm、300至600μm、300至550μm、300至500μm、300至450μm、300至400μm、300至350μm、400μm至1000μm、400至950μm、400至900μm、400至850μm、400至800μm、400至750μm、400至700μm、400至650μm、400至600μm、400至550μm、400至500μm、400至450μm、500μm至1000μm、500至950μm、500至900μm、500至850μm、500至800μm、500至750μm、500至700μm、500至650μm、500至600μm、500至550μm、600μm至1000μm、600至950μm、600至900μm、600至850μm、600至800μm、600至750μm、600至700μm、600至650μm、700μm至1000μm、700至950μm、700至900μm、700至850μm、700至800μm、700至750μm、800μm至1000μm、800至950μm、800至900μm、800至850μm、900μm至1000μm或900至950μm。尤其考虑从任何这些端点值的组合可获得的任何和所有范围。
不同的组织工程化应用可能需要特定的孔径大小并且本领域技术人员将选择适合他/她特定的组织工程化应用的孔径大小。例如，对于使用基于胶原的支架的皮肤再生，已经显示10μm和125μm之间的孔径大小是最佳的(Yannas等，1989，PNAS，Vol 86，933-937)。对于骨修复，已经显示3D支架具有85μm至325μm的孔径大小是有功能的(Murphy&O’Brien，Cell AdhMigr 4，377-381；2010)。其他组织可以以不同范围的孔径大小最佳再生，并且Loh和Choong近来综述了有关孔径大小的文献(Tissue Engineering 19，485-502；2013，尤其表1)，其通过引用并入本文。
本发明3D支架的孔的尺寸可基本上是均匀的。例如，支架中小于25％，例如小于20％、15％、10％、5％或1％的孔具有选择的尺寸范围——例如上面叙述的那些——之外的尺寸。明确可选地，支架中至少75％，例如80％、85％、90％、95％或98％的孔的孔径大小与平均或模式孔径大小的差别不大于25％，例如不大于20％、15％、10％、5％或1％。
支架的孔隙率(或空隙分数)，即为空隙空间的支架体积的百分数，也可取决于使用支架的组织工程化的应用而改变(Loh和Choong，尤其表1(上文))。在某些实施方式中，本发明的支架的孔隙率可以是30％至99％，例如30％至95％、30％至90％、30％至85％、30％至80％、30％至75％、30％至70％、30％至65％、30％至60％、30％至55％、30％至50％、30％至45％、30％至40％、30％至35％、40％至99％、40％至95％、40％至90％、40％至85％、40％至80％、40％至75％、40％至70％、40％至65％、40％至60％、40％至55％、40％至50％、40％至45％、50％至99％、50％至95％、50％至90％、50％至85％、50％至80％、50％至75％、50％至50％、50％至65％、50％至60％、50％至55％、60％至99％、60％至95％、60％至90％、60％至85％、60％至80％、60％至75％、60％至70％、60％至65％、70％至99％、70％至95％、70％至90％、70％至85％、70％至80％、70％至75％、80％至99％、80％至95％、80％至90％、80％至85％、90％至99％、90％至95％或95％至99％。尤其考虑从这些端点值的任何组合可获得的任何和所有范围。
可通过扫描电子显微镜、微型计算机断层成像、汞孔隙度测量法、基于通透性的方法或毛细管流动孔隙测量来测量孔径大小。可通过比重方法、汞孔隙度测量法、液体替换法测量孔隙率。这些测量技术是常规的并且详细描述在Loh和Choong中(上文)。
本发明的支架是干燥的，即基本上，例如实质上，不含水的(不含水分的)。这可表达为水含量小于5％w/w，例如小于4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％或1％w/w，如通过干燥时的重量减轻或通过Karl Fischer方法化学测量(美国药典；欧洲药典)。本发明的支架优选地通过冷冻干燥(冻干)或通过真空来干燥。
根据本发明术语，“颗粒ESM”可以是下述的至少一种ESM颗粒，或可由下述的至少一种ESM颗粒形成：所述ESM颗粒的平均粒径为至多500μm，例如至多450、400、350、300、250、200、150、125或100μm。在某些实施方式中，颗粒ESM可以是下述的至少一种ESM颗粒，或可由下述的至少一种ESM颗粒形成：所述ESM颗粒的平均粒径小于100μm，例如小于95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或1μm，例如小于900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、10、5或1nm。
在某些其他实施方式中，颗粒ESM可以是下述的至少一种ESM颗粒，或可由下述的至少一种ESM颗粒形成：所述ESM颗粒的平均粒径等于或大于1nm，例如等于或大于5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950nm，或等于或大于1μm，例如等于或大于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、250、300、350、400或450μm。
尤其考虑从任何上述这些值的组合可获得的任何和所有范围端点。
ESM颗粒可以是任何形状。ESM颗粒可基本上是对称的或不对称的。ESM颗粒可基本上是球形的、三棱形的或圆柱形的。ESM颗粒可基本上是不规则的或规则的或具有这两种的区域。ESM颗粒可以是有尖角的、圆形的或锥形的或具有其区域。在某些实施方式中，ESM颗粒可具有一个长度维度显著大于其他长度维度，并且因此可称为，例如，杆形、针形或纤维状(棒、针或纤维)并且可作为圆柱形的或三棱形的(例如立方形的)，这取决于基本上与明显更大长度的维度垂直的横截面形状。
在某些实施方式中，ESM颗粒可具有的第一长度维度和与所述第一长度维度垂直设置的第二长度维度之间的纵横比是至少1.5(第一长度维度：第二长度维度)，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90或100。在其他实施方式中，ESM颗粒可具有的第一长度维度和布置为与其垂直的第二长度维度之间的纵横比不大于2(第一长度维度：第二长度维度)，例如不大于3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90或100。尤其考虑从任何这些值的组合可获得的任何和所有范围端点，例如ESM颗粒可具有的纵横比是5、6、7、8、9或10的任何至20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70的任何。
在这些实施方式中，第一长度维度是颗粒中最长的长度维度并且可称为纵向维度。相应地，第二长度维度可称为横向维度。第二长度维度是颗粒的最长的横向维度或横向维度的平均值。
在某些实施方式中，纵向维度是0.1μm至500μm，例如0.1μm至400μm、0.1μm至300μm、0.1μm至200μm、0.1μm至100μm、0.1μm至80μm、0.1μm至60μm、0.1μm至40μm、0.1μm至20μm、0.1μm至10μm、0.1μm至1μm、0.1μm至0.5μm、0.5μm至500μm、0.5μm至400μm、0.5μm至300μm、0.5μm至200μm、0.5μm至100μm、0.5μm至80μm、0.5μm至60μm、0.5μm至40μm、0.5μm至20μm、0.5μm至10μm、0.5μm至1μm、1μm至500μm、1μm至400μm、1μm至300μm、1μm至200μm、1μm至100μm、1μm至80μm、1μm至60μm、1μm至40μm、1μm至20μm、1μm至10μm、10μm至500μm、10μm至400μm、10μm至300μm、10μm至200μm、10μm至100μm、10μm至80μm、10μm至60μm、10μm至40μm、10μm至20μm、20μm至500μm、20μm至400μm、20μm至300μm、20μm至200μm、20μm至100μm、20μm至80μm、20μm至60μm、20μm至40μm、40μm至500μm、40μm至400μm、40μm至300μm、40μm至200μm、40μm至100μm、40μm至80μm、40μm至60μm、60μm至500μm、60μm至400μm、60μm至300μm、60μm至200μm、60μm至100μm、60μm至80μm、80μm至500μm、80μm至400μm、80μm至300μm、80μm至200μm、80μm至100μm、100μm至500μm、100μm至400μm、100μm至300μm、100μm至200μm、200μm至500μm、200μm至400μm、200μm至300μm、300μm至500μm、300μm至400μm或400μm至500μm。
在某些实施方式中，横向维度或其平均值是0.01μm至20μm，例如0.01μm至16μm、0.01μm至12μm、0.01μm至8μm、0.01μm至4μm、0.01μm至2μm、0.01μm至1.6μm、0.01μm至1.2μm、0.01μm至0.8μm、0.01μm至0.4μm、0.01μm至0.2μm、0.01μm至0.1μm、0.01μm至0.05μm，0.05μm至20μm、0.05μm至16μm、0.05μm至12μm、0.05μm至8μm、0.05μm至4μm、0.05μm至2μm、0.05μm至1.6μm、0.05μm至1.2μm、0.05μm至0.8μm、0.05μm至0.4μm、0.05μm至0.2μm、0.05μm至0.1μm、0.1μm至20μm、0.1μm至16μm、0.1μm至12μm、0.1μm至8μm、0.1μm至4μm、0.1μm至2μm、0.1μm至1.6μm、0.1μm至1.2μm、0.1μm至0.8μm、0.1μm至0.4μm、0.1μm至0.2μm、0.2μm至20μm、0.2μm至16μm、0.2μm至12μm、0.2μm至8μm、0.2μm至4μm、0.2μm至2μm、0.2μm至1.6μm、0.2μm至1.2μm、0.2μm至0.8μm、0.2μm至0.4μm、0.4μm至20μm、0.4μm至16μm、0.4μm至12μm、0.4μm至8μm、0.4μm至4μm、0.4μm至2μm、0.4μm至1.6μm、0.4μm至1.2μm、0.4μm至0.8μm、0.8μm至20μm、0.8μm至16μm、0.8μm至12μm、0.8μm至8μm、0.8μm至4μm、0.8μm至2μm、0.8μm至1.6μm、0.8μm至1.2μm、1.2μm至20μm、1.2μm至16μm、1.2μm至12μm、1.2μm至8μm、1.2μm至4μm、1.2μm至2μm、1.2μm至1.6μm、1.6μm至20μm、1.6μm至16μm、1.6μm至12μm、1.6μm至8μm、1.6μm至4μm、1.6μm至2μm、2μm至20μm、2μm至16μm、2μm至12μm、2μm至8μm、2μm至4μm、4μm至20μm、4μm至16μm、4μm至12μm或4μm至8μm。
尤其考虑上面公开的纵向和横向维度和其范围的任何和所有组合，尤其与任何和所有纵横比和其范围的组合。鉴于前述，可见本发明中使用的某些ESM颗粒是棒、针或纤维。
鉴于本发明关于ESM颗粒形状的普遍性，在基本上，例如实质上不是球形的ESM颗粒的背景下，提及ESM粒径因此也是提及等同的球形直径。在这些实施方式中，ESM颗粒具有由下述尺寸维度限定的形状，该尺寸维度将产生与在使用的颗粒大小测量技术中所述直径的相同物质组成的球相同的尺寸读数。在某些实施方式中，使用的尺寸维度是体积或表面积，优选体积。
平均(mean)(平均(average))直径，或等同球形直径，可通过任何方便的方式，例如电阻脉冲/Coulter法、沉积(重力或离心)、光学成像(例如SEM、静态图像分析、动态图像分析)、激光衍射或光散射来评估，但是出于本发明的目的，应当使用可调电阻脉冲感测形式的Coulter法或光学装置来测定颗粒大小。
认为具有高纵横比和上述尺寸的ESM颗粒，例如纤维、棒或针(取决于尺寸，其在本文可互换地称为微纤维、微棒和微针或纳米纤维、纳米棒和纳米针)相对于其他形式的ESM(例如WO 2004/080428的那些)，至少在本文所述的伤口愈合治疗的背景下，具有某些物理优势。尤其地，认为这种布置能够提供理想水平的表面积、周转率、湿润性、水分驻留、铺展性和尤其是MMP抑制。
上面定义的颗粒ESM通常是多个所述ESM颗粒，所述多个颗粒具有的模式粒径是至多500μm，例如至多450、400、350、300、250、200、150、125或100μm。在某些实施方式中，多个颗粒具有的模式粒径小于100μm，例如小于95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或1μm，例如小于900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、10、5或1nm。
在某些实施方式中，多个颗粒也具有的模式粒径等于或大于1nm，例如等于或大于5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950nm，或等于或大于1μm，例如等于或大于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、200、250、300、350、400或450μm。
尤其考虑从上述任何这些值的组合可获得的任何和所有范围端点。
在某些实施方式中，所述多个颗粒中小于25％，例如小于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的颗粒数量的平均粒径等于或大于模式粒径，例如平均粒径等于或大于500、450、400、350、300、250、200、150、125、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5或1μm，例如等于或大于900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、10、5或1nm。
在某些实施方式中，使用具有低分散度的多个ESM颗粒可能是有利的。在其他实施方式中，多个ESM颗粒基本上是单分散的。另一方面，在某些其他实施方式，可选择宽范围的ESM颗粒大小或多个更窄的颗粒大小范围，以实现本文所述的一种或多种不同的生理学作用。不希望被理论限制，本发明中使用的平均粒径在尺寸范围上端的ESM颗粒通过提供更大的支架作用可利于伤口细胞迁移，而本发明中使用的平均粒径在尺寸范围下端的ESM颗粒对于MMP和炎症可具有更大的抑制作用。可有利地选择不同尺寸范围，以便调整本发明中使用的ESM颗粒的生理学作用。
ESM是蛋中出现的鸟蛋的蛋清和蛋壳之间的纤维双层，所述鸟蛋例如禽类(斗鸡/陆禽(鸡形目)和水禽(雁形目))和家禽，尤其鸡、鸭、鹅、火鸡、珍珠鸡、鸵鸟、鸽子、野鸡、鹧鸪、松鸡或鸥的蛋。尤其优选泰和鸡(Gallus gallus domesticus)——家鸡——的蛋。根据本发明可使用双层的一层或两层。
优选地，颗粒ESM和支架整体上基本不含其他(非ESM)蛋组分(其相对于ESM可视为是“污染”物质)，例如蛋清、蛋黄和/或蛋壳(碳酸钙)。“基本上不含”意思是根据本发明使用的颗粒ESM(和包括的ESM颗粒)包含不大于5％w/w，例如不大于4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％w/w的非ESM蛋组分。
本发明的颗粒ESM的ESM可通过任何便利的方式与其他蛋组分分开。可分离ESM的蛋可以是受精的或未受精的。蛋可以是完整的，即孵化之前的，或可以是空的，即孵化之后或提取蛋内容物(蛋清和蛋黄)之后蛋的残留部分。适合的方式例如描述在WO 2004/080428和US 8580315中，其内容通过引用并入本文。优选地，通过WO 2015/058790公开的在商业蛋加工厂中的在线收获蛋壳膜方法制备ESM，其内容通过引用并入本文。简言之，WO 2015/058790提供了加工蛋壳残留物的方法，所述蛋壳残留物源于打蛋装置并且包括蛋壳部分以及膜部分，所述方法包括将来自打蛋装置的蛋壳残留物(例如颗粒大小是约0.5mm至约40mm并且湿基湿度是约3％至约40％)进料至由工艺气体驱动的旋风分离器，所述工艺气体的温度小于约85℃(优选地，小于约60℃)并且速度超过约60m/s(优选地，约70m/s和约340m/s之间)。在所述旋风分离器涡流中，蛋壳残留物的加工降低了颗粒大小并且将所述膜部分从所述蛋壳部分剥离，使得所述蛋壳部分与所述膜部分分开。通过所述旋风分离器的顶部出口，主要释放工艺气体、蒸汽和液滴的混合物，并且通过所述旋风分离器的底部出口，主要释放分离的蛋壳部分和膜部分的混合物。所述释放的混合物接着在分拣设备中被分成蛋壳部分和膜部分。所得的ESM部分可然后被进一步加工成如本文所描述的本发明的ESM颗粒，优选地没有中间步骤。
在某些实施方式中，制备ESM的方法包括通过相对于总的工艺气体进料速率调整蛋壳残留物进料速率控制将蛋壳残留物进料至所述旋风分离器和从所述旋风分离器释放所述混合物之间的时间的进一步步骤，例如间隔是约0.5s至约20s和优选地约1s至约5s。在某些实施方式中，该方法进一步包括将蛋壳残留物离心然后将它们进料至所述旋风分离器的步骤。在某些实施方式中，进料步骤是连续的。在其他实施方式中，分拣步骤包括将膜部分气动排出分拣筛并且离开分拣设备。方法也可包括干燥膜部分的最后步骤。
尺寸范围是约1mm2至约10mm2的薄片(flake)形式的ESM材料不能被重新构造或加工成与完整ESM相同结构特征的片材。
在某些实施方式中，本发明中使用的颗粒ESM(或至少其蛋白质组分)基本上获得自壳-膜分离过程。换句话说，本发明中使用的颗粒ESM与来自相应的鸟来源的天然存在的ESM相比，基本上是非化学改性的。
更具体地，本发明中使用的颗粒ESM与来自相应鸟来源的天然存在的ESM相比，是化学上基本上非降解的、非消化的(例如化学地或酶促地)和/或非变性的。“基本上非降解的”意思是小于20％，例如小于15％、10％、5％或1％的ESM组分与来自相应鸟来源的天然存在的ESM相比，将显示降解的迹象。应当相应地解释非消化的和非变性的。可通过测量ESM的相对溶解度和/或ESM中胶原纤维的相对尺寸或结构，评估ESM的降解/消化/变性的程度。这可通过包括免疫组织化学/免疫细胞化学技术的常规技术和/或生物分子(例如蛋白质)染色剂和染料而实现。
尤其地，在某些实施方式中，本发明中使用的颗粒ESM将不暴露于水解反应或二硫键还原反应——例如化学或酶促的，尤其是碱水解反应。换句话说，本发明中使用的颗粒ESM将基本上是非水解的，其意思是与来自相应鸟来源的天然存在的ESM相比，小于20％，例如小于15％、10％、5％或1％的ESM组分将显示水解的迹象。可通过测量ESM的相对溶解度和/或ESM中胶原纤维的相对尺寸和/或胶原交联的程度，评估ESM水解的程度。这可通过包括免疫组织化学/免疫细胞化学技术的常规技术和/或蛋白质染色剂和染料实现。
在其他实施方式中，本发明中使用的颗粒ESM将基本上，例如实质上在中性pH，例如pH 6.8-7.2下不溶于水。出于本发明的目的，不溶解的材料需要大于10L的溶剂来溶解1g溶质。
可通过任何方便的颗粒尺寸减小、微粉化、研磨、粉碎或碾磨技术方式，例如球磨、珠磨、喷射碾磨、涡流碾磨、刮刀碾磨、转子-定子分散，优选地随后尺寸选择，例如过筛和筛选，由ESM制备本发明中使用的颗粒ESM。可干燥或用液体媒介进行选择的颗粒尺寸减小方法，所述液体媒介可包括或不包括支架的其他组分。也可采用冷冻粉碎。在某些实施方式中，颗粒尺寸减小法，并且在某些实施方式中，之前的ESM制备法，是基于产生要求尺寸(例如如上述的)的ESM纤维进行选择。尤其地，就此而言，已经显示在ESM薄片悬浮液的刮刀碾磨和定子-转子分散中粉碎干燥ESM是有效的。
因此，根据本发明，制备本发明中使用的颗粒ESM的方法可包括提供ESM，例如如本文定义的，和使ESM进行微粉化过程。优选地，提供基本上不含非ESM蛋组分的ESM，并且更优选地提供基本上不含非ESM蛋组分的ESM包括从将ESM与非ESM蛋组分分开，如WO 2015/058790和上面所描述的，并且冲洗ESM，以获得弱酸溶液(该术语包括弱酸性溶液)，例如约0.1％盐酸或乙酸的水溶液，从而去除ESM中任何残留的碳酸钙。在其他实施方式中，用所述弱酸溶液冲洗微粉化的ESM。该弱酸冲洗，尤其用约0.1％HCl溶液处理，不但去掉ESM的矿物质，因此使ESM中无机盐的量最小化，而且也去除了传染原和/或使传染原灭活，该传染原是例如微生物(例如如本文所描述的)、朊病毒和病毒。
如此制备的ESM的微粉化产生的ESM纤维的长度是10-100μm并且厚度是1-5μm(即微纤维和纳米纤维)。在微粉化过程之前、所述过程期间或所述过程之后，可包括本发明的支架的另外组分。本发明的支架中包含通过所述方法获得的或可获得的颗粒的微粉化的ESM的用途是本发明的进一步的方面。
至少约25％w/w的本发明的支架是颗粒蛋壳膜(ESM)。支架的剩余含量，即剩余的％w/w至多至100％w/w由进一步支架材料提供，其基本上是惰性赋形剂和/或进一步治疗活性剂，优选地是其他支架材料和/或惰性赋形剂和更优选地是其他支架材料。在某些实施方式中，并且如在实施例中显示，支架可以基本上由颗粒ESM组成。
在某些实施方式中，支架包括至少30％w/w的颗粒ESM，例如至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％w/w或100％w/w。
在其他实施方式中，支架包括小于100％w/w的颗粒ESM，例如不大于95％w/w，例如不大于90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％w/w。
尤其考虑从上述任何这些值的组合可获得的任何和所有范围端点。
“％w/w”(或“按重量计的重量百分数”)是固体中化合物的量的常用表达。1％w/w相当于每100g固体1克化合物，2％w/w相当于每100g固体2g化合物等等。因此，％w/w可以表达为g/100g，克每100克和g 100g-1。1％w/w还相当于每1千克固体10克化合物。技术人员将理解，通过合适的标度计算，％w/w可以根据任何SI质量单位急性表达。转化为浓度的非标准量度也是可能的，并且对技术人员来说是常规的。当参考本发明的支架的内容时，这是对支架干重——即以其基本上干燥形式——的参考。
在某些实施方式中，支架包括颗粒ESM并且至少一种进一步支架材料(或由其组成或基本上由其组成)。在这些实施方式中，它可以有利的以下述的比例提供颗粒ESM和进一步支架材料(一种或多种)：1:3至20:1，例如1:3至15:1、1:3至10:1、1:3至6:1、1:3至5:1、1:3至3:1、1:3至2:1、约1:1、1:1至20:1、1:1至15:1、1:1至10:1、1:1至6:1、1:1至5:1、1:1至3:1、1:1至2:1、2:1至20:1、2:1至15:1、2:1至10:1、2:1至6:1、2:1至5:1、2:1至3:1、3:1至20:1、3:1至15:1、3:1至10:1、3:1至6:1、3:1至5:1、5:1至20:1、5:1至15:1、5:1至10:1、5:1至6:1、6:1至20:1、6:1至15:1、6:1至10:1、10:1至20:1、10:1至15:1、或15:1至20:1(ESM：进一步支架材料)。尤其考虑由任何这些端点值的组合可获得的任何和全部范围。
精确的比例将尤其由颗粒ESM的颗粒大小、进一步支架材料(一种或多种)的同一性、支架的期望用途和/或支架的形式指示。例如，如实施例中显示的，由颗粒ESM和胶原组成的海绵支架可以以1:1和3:1的ESM与胶原比形成。
进一步支架材料可以是除颗粒ESM以外的任何适合的支架材料。在某些实施方式中，进一步支架材料将不是片状或薄片状ESM，或实际上任何形式的固体ESM，或由ESM源材料或组分(例如，ESM水解产物或与ESM分离的蛋白质和/或多糖)制备。本发明的支架的生物可降解性质意思是支架不包含作为整体要素的宏观金属组分。
适合的支架材料可以是天然的或合成的，并且通常为如此聚合物，其能够形成3D布置且提供适合的和足够的配体以促进细胞迁移、黏着、增殖和/或新生细胞外基质产生。更具体的实例包括天然(纤维状)蛋白质和多糖，例如细胞外基质(胶原(包括全部类型和形式，优选地胶原I或明胶)、纤维蛋白、角蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖(例如透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸类肝素和乙酰透明质酸))和藻酸盐、果胶、脱乙酰壳多糖、纤维素(包括氧化再生纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素的全部形式)和纤连蛋白中的那些。人工支架材料包括PLA(聚乳酸)、聚乙醇酸(PGA)和聚己酸内酯(PCL)，聚二烷酮(PDS)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(PEOT)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(可互换地称为PVA、PVOH或PVAI)和聚(对苯二甲酸丁二醇酯)(PBT)、氮化硅和其共聚物，例如聚丙交酯-共-乙交酯(PLAGA)和PEOT/PBT、羟基磷灰石和磷酸钙(Ca-P)和其衍生物，例如硅酸盐化的磷酸钙和β-磷酸三钙(β-TCP)。值得注意的是胶原(包括全部类型和形式，优选地胶原I或明胶)和纤维素(包括氧化再生纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素的全部形式)。胶原和氧化再生纤维素的组合作为进一步支架材料可能是尤其有效的。在这种实施方式中，胶原与氧化再生纤维素的比将是70:30至30:70，例如65:35至35:65、60:40至40:60、55:45至45:55，优选地55:45。在骨组织工程化的背景中，将羟基磷灰石和磷酸钙(Ca-P)和其衍生物，例如硅酸盐化的磷酸钙和β-磷酸三钙(β-TCP)并入本发明的支架，特别是与胶原组合，可能是有利的。
参考藻酸盐包括藻酸，除非上下文另外指出。藻酸盐可以是藻酸、二价金属离子藻酸盐、三价金属离子藻酸盐和/或一价金属离子藻酸盐，例如上述的那些，具体而言分别为Ca2+和/或Na+藻酸盐。藻酸盐将通常为例如至少35kDa的聚合物，或不同大小的多种聚合物，尽管更小的低聚物可以替代所述聚合物或与所述聚合物组合使用。在某些实施方式中，进一步支架材料不是藻酸盐，并且因此本发明的支架不包含足够量的用作支架材料的藻酸盐。在某些实施方式中，本发明的支架不包含藻酸盐。
使用胶原和/或明胶作为唯一进一步支架材料(一种或多种)是尤其优选的。上述的各种比例运用必要的变通至这类实施方式。在某些实施方式中，本发明的支架由颗粒ESM与胶原和/或明胶优选地胶原组成，或基本上由其组成。在这些实施方式中，ESM与胶原和/或明胶优选地以1:3至20:1的比例存在，例如如上所述，优选地约1:3、约1:1或约3:1，即25％w/w的ESM比75％w/w的胶原和/或明胶，50％的ESM比50％的胶原和/或明胶，和75％的ESM比25％的胶原和/或明胶。
使用PEG，尤其是交联或聚合的PEG作为唯一进一步支架材料(一种或多种)是尤其优选的。上述的各种比例运用必要的变通至这类实施方式。在某些实施方式中，本发明的支架由颗粒ESM和一种或多种PEG组成，或基本上由其组成。在这些实施方式中，ESM和PEG优选地以1:3至20:1的比例存在，例如如上所述，优选地约1:3、约1:2、约1:1或约3:1，即25％w/w的ESM比75％w/w的PEG、33％w/w的ESM比67％的PEG、50％的ESM比50％的PEG和75％的ESM比25％的PEG。如以下所讨论，可以以非交联或非聚合的前体形式提供使用的PEG并且在交联或聚合之前与ESM结合。
使用聚乙烯醇(PVA)作为唯一进一步支架材料是尤其优选的。上述的各种比例运用必要的变通至这类实施方式。在某些实施方式中，本发明的支架由颗粒ESM和PVA组成，或基本上由其组成。在这些实施方式中，ESM和PVA优选地以1:3至20:1的比例存在，例如如上所述，优选地约1:3、约1:2、约1:1或约3:1，即25％w/w的ESM比75％w/w的PEG、33％w/w的ESM比67％的PEG、50％的ESM比50％的PEG和75％的ESM比25％的PEG。
在某些实施方式中，进一步支架材料的单个分子可以彼此交联，并且在进一步的实施方式中也与ESM的颗粒交联。可以使用适合形式的交联进一步支架材料的任何方便手段。交联剂的具体实例包括水溶性的碳二亚胺交联剂例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和戊二醛，但是某些支架材料(例如胶原)的交联可以通过暴露于某些物理条件(例如干热(dehydrothermal)技术)和/或适合的催化剂(例如氧化还原引发剂(例如过硫酸铵(APS)或N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和光引发剂(例如苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)次膦酸锂(LAP))来实现。
可以并入本发明的支架的进一步治疗活性剂可以包括但不限于临床上有用的抗微生物剂(例如抗生素、消毒剂、抗微生物表面活性剂、抗真菌剂、抗病毒剂)、生长因子或抗炎药(如果使用的ESM颗粒已经具有这种特性，则其可以被称为“进一步抗微生物剂”、“进一步生长因子”或“进一步抗炎药”)。这种试剂可以以小于25％w/w，例如小于20％、15％、10％、5％或1％w/w的量存在于支架中。
代表性抗生素包括但不限于氨基糖苷类(例如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、链霉素、妥布霉素)；碳头孢烯类(carbecephems)(例如氯碳头孢)；第一代头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄)；第二代头孢菌素类(例如头孢克洛、头孢孟多、头孢氨苄、头孢西丁、头孢罗齐、头孢呋辛)；第三代头孢菌素类(例如头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢氧哌唑、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松)；第四代头孢菌素类(例如头孢吡肟)；大环内酯类(例如阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、三乙酰竹桃霉素)；单环内酰胺类(例如氨曲南)；青霉素类(例如阿莫西林、氨苄西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、替卡西林)；多肽抗生素(例如杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B)；喹诺酮(例如环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星)；磺酰胺类(例如磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺二甲基异唑、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异唑)；四环素类(例如去甲金霉素、强力霉素、米诺环素、土霉素、四环素)；碳青霉烯类(例如亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多利培南、帕尼培南/倍他米隆、比阿培南、PZ-601)；氯霉素；克林霉素、乙胺丁醇；磷霉素；异烟肼；利奈唑胺；甲硝唑；呋喃妥因；吡嗪酰胺；喹奴普丁/达福普丁；利福平；大观霉素；和万古霉素。
代表性消毒剂包括但不限于氯漂白剂(次氯酸钠)、季铵化合物(例如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、西吡氯铵)、过氧化氢、酚化合物(例如TCP三氯生)、醇类(例如乙醇)、VirkonTM、碘化合物(例如聚维酮-碘)、银、铜、铁、铅、锌、铋、金和铝化合物(例如元素银、铜、铁、铅、锌、铋、金和铝纳米粒/微粒)。
抗微生物表面活性剂是另一类消毒剂。这些是破坏微生物细胞膜和其他结构组分并且因此抑制微生物的生长和/或活力的化合物。本领域熟知抗微生物表面活性剂和其在抗微生物组合物中的用途，如果需要进一步指导“Preservative-free and self-preserving cosmetics and drugs-Principles and practice”,Ed.Kabara and Orth,Marcel Dekker,NY,NY,1997中抗微生物表面活性剂的讨论通过参考以其整体被明确并入。抗微生物表面活性剂可以是阴离子、阳离子、非离子或两性的。抗微生物阴离子表面活性剂的实例包括但不限于十二烷基硫酸钠(月桂基硫酸钠)、十二烷基氨基丙酸钠、蓖麻油酸钠、胆酸、烷基芳基磺酸盐、Grillosan DS7911、十一碳烯酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸二钠。抗微生物剂阳离子表面活性剂的实例包括但不限于季铵化合物、胺化酰亚胺和氯己定化合物。抗微生物非离子表面活性剂的实例包括但不限于脂肪酸的单酯、烷基二羟基苯甲酸的聚乙二醇单酯、葡糖胺衍生物和N-月桂酰二肽的二乙醇酰胺。抗微生物两性表面活性剂的实例包括但不限于烷基甜菜碱、烷基酰胺丙基甜菜碱、烷基氨基丙酸盐、烷基亚氨基二丙酸盐和烷基咪唑啉。
代表性抗真菌剂包括但不限于多烯类(例如游霉素、龟裂霉素、菲律宾菌素、制菌霉素、两性霉素B、坎底辛；咪唑类(例如咪康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、联苯苄唑、布康唑、芬替康唑、异康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑)；三唑类(例如氟康唑、伊曲康唑、艾沙康唑、雷夫康唑、泊沙康唑、伏立康唑、特康唑)；烯丙胺类(例如特比奈芬、阿莫罗芬、萘替芳、布替萘芬)；和棘白菌素类(例如阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净)。
代表性抗病毒剂包括但不限于阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦、阿比朵尔、阿扎那韦、立普妥、波普瑞韦、西多福韦、可比韦、地瑞纳韦、地拉夫定、地达诺新、二十二醇、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦地、恩替卡韦、泛昔洛韦(famciclovir)、福米韦生、福沙那韦、膦甲酸(foscarnet)、膦乙酸(fosfonet)、更昔洛韦、伊巴他滨、异丙肌苷(imunovir)、碘苷、咪喹莫特、印地那韦(indinavir)、肌苷、干扰素III型、干扰素II型、干扰素I型、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉维若(maraviroc)、吗啉胍、奈非那韦、奈韦拉平、多吉美(nexavir)、奥司他韦、喷昔洛韦、帕拉米韦、普可那利、鬼臼毒素、雷特格韦、病毒唑、金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、司他夫定、泰诺福韦、替诺福韦酯(tenofovir disoproxil)、替拉那韦、三氟尿苷、三协唯、醋胺金刚胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、马拉维若(vicriviroc)、阿糖腺苷、韦拉米啶(viramidine)、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。
代表性生长因子包括但不限于血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性和酸性成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(hGF)、生长激素(GH)、骨形态发生蛋白质2和7(BMP2和BMP7)、胰岛素样生长因子I和II(IGF-I、IGF-II)、转化生长因子(TGF-β1、TGF-β2)、角质细胞生长因子(KGF)、迁移-刺激因子(MSF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)。
代表性抗炎药包括但不限于抗炎类固醇(例如皮质激素)、NSAID或抗炎细胞因子。代表性NSAID包括但不限于水杨酸盐类(例如阿司匹林(乙酰水杨酸)、三水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、双水杨酯、丙酸衍生物(例如布洛芬、右布洛芬、右酮洛芬、非诺洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、洛索洛芬萘普生、奥沙普秦)、乙酸衍生物(例如乙酰氯芬酸、双氯芬酸、依托度酸、吲哚美辛、酮咯酸、萘丁美酮、托美丁、舒林酸)、烯醇酸衍生物(例如屈昔康(droxicam)、伊索昔康、氯诺昔康、美洛昔康、吡罗昔康、替诺昔康)、邻氨基苯甲酸衍生物(例如氟芬那酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、托芬那酸)和选择性COX-2抑制剂(昔布类(Coxibs)；例如塞来昔布、依托昔布、罗美昔布、帕瑞昔布、罗非昔布、伐地昔布)。丙酸衍生物(例如布洛芬、右布洛芬、右酮洛芬、非诺洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、洛索洛芬萘普生、奥沙普秦)是优选的，布洛芬是最优选的。代表性抗炎细胞因子包括(IL)-1受体拮抗剂、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11和IL-13。
适合的赋形剂的实例是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、黄蓍胶、硅酸钙、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油或脂肪物质比如硬脂或其适合的混合物。赋形剂可另外地包括润滑剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。在某些实施方式中，赋形剂将不是片状或薄片状ESM、或实际上任何形式的固体ESM、或由ESM源材料或组分(例如ESM水解产物或与ESM分离的蛋白质和/或多糖)制备。
通过“均匀分布”意思是本发明的支架的颗粒ESM在支架的任何部分不以任何显著程度积聚。即，从本发明的支架获取的选定大小的任何样品将与来自支架的另一部分的相同大小的第二样品具有基本上相同量的颗粒ESM(例如测量为％w/w)。换言之，支架的多个(例如10)宏观部分(例如具有约5mm3的体积的部分)将与整个支架平均(average)(平均(mean))地包含基本上相同比例的颗粒ESM。
在进一步实施方式中，本发明提供了如本文限定的接种有细胞的支架，所述细胞可以是从支架的靶宿主收获的细胞或源自供体的那些细胞。用于接种本发明的支架的典型细胞包括干细胞(多潜能干细胞、全能干细胞、多能干细胞或单能干细胞)、诱导的多能干细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、上皮细胞、角质细胞、破骨细胞、成骨细胞、基底膜细胞。
在进一步实施方式中，本发明提供了如本文限定的适用于伤口愈合背景的支架，所述支架以可渗透蒸汽的或不可渗透蒸汽的屏障覆盖在一侧，以控制伤口中的水分，保护伤口并且提供抗微生物屏障。
在进一步实施方式中，本发明提供了如本文限定的用于骨软骨缺陷的再生和修复(软骨修复)的支架，所述支架作为不同梯度孔/纤维结构的多个支架层的一层。该排列优选地设计为模拟生理学骨软骨组织的组成和/或结构，例如关节软骨的浅层至深层和下方的软骨下骨。对于骨修复，支架已经显示孔径大小为85μm至325μm是有作用的(Murphy&O’Brien，Cell AdhMigr 4，377-381；2010)。
本发明的支架也可提供为对于修复跨越解剖学结构的特定组织类型而优化的双层或多层结构的至少一层。实例是US7780994“Composite biomaterials comprising calcium phosphate materials,collagen and glycosaminoglycans”中描述的双层胶原支架。这种支架可用于桥连关节软骨和骨头，在一侧具有占主导的非钙化多孔结构并且在另一侧具有占主导的钙化多孔结构。因此，该支架被优化用于在一侧上骨生长和在另一侧上软骨再生。
可通过任何方便的方式制备本发明的支架。为了实现均匀分布，在形成支架之前，将颗粒ESM与其他支架组分(如果存在的话)结合可能是有利的，例如通过冷冻干燥(冻干)、冷冻消融或蒸发混合物。取决于支架的组分，最佳的制造方法可选自熔融沉积、电纺、立体光刻、相分离、成气、选择性激光烧结、盐析(salt leaching)、3D印刷、冷冻消融和冷冻干燥。这些方法是常规的并且进一步由Loh和Choong(上文)和Hwang，H.等，J.Mater.Chem.，2010，20，345-351)描述。
在具体实施方式中，提供了用于制备海绵形式的如本文限定的本发明的支架的方法，所述方法包括
(i)以足以在支架中获得至少25％w/w颗粒ESM的量在水性悬浮液中提供颗粒ESM和任何其他支架组分——如果存在，和
(ii)冷冻干燥悬浮液，任选地在模具中，从而获得所述支架。
任何其他支架组分可以悬浮和/或溶解在颗粒ESM悬浮液中。
在某些实施方式中，在水性悬浮液中提供颗粒ESM和任何其他支架组分——如果存在——的步骤(i)包括在水性悬浮液中提供片状或薄片形式的ESM和任何其他支架组分——如果存在，并且对所述悬浮液应用ESM尺寸减小技术，例如本文描述的那些。转子-定子分散机的使用可能是有利的。
在其他实施方式中，在水性悬浮液中提供颗粒ESM和任何其他支架组分——如果存在——的步骤(i)包括提供颗粒ESM和所述其他支架组分，并且与水性液体结合以形成所述悬浮液。这可以包括使一种或多种其他支架组分与所述颗粒ESM的水性悬浮液结合，或使所述颗粒ESM与一种或多种其他支架组分的水溶液或水性悬浮液结合，或使所述颗粒ESM的水性悬浮液与一种或多种其他支架组分的水溶液或水性悬浮液结合。进一步尺寸减小可以在任意点处进行。
模具可以具有适合于其期望用途的大小和形状(或近似形状)，例如将应用支架的位置(例如伤口、关节、骨缺损)的大小和形状或支架将形成基础的器官、组织或其部分的大小和形状。在其他实施方式中，选择模具的大小和形状以形成可以切割至应有尺寸的产品。
模具可以完全地封闭悬浮液或至少一面将保持开放。通过完全地封闭悬浮液，可以限制在冷冻干燥期间海绵的膨胀，并且从而可以控制孔隙率、孔径大小和其他结构特征。
在这些方面中，其他支架组分可以是任何的本文公开的那些，并且优选的特征等的所附讨论运用必要的变通至这些方面。
在某些实施方式中，以足以在支架中获得至少30％w/w，例如至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％w/w或100％w/w的颗粒ESM的量，在水性悬浮液中提供颗粒ESM和任何其他支架组分——如果存在。
在其他实施方式中，以足以在支架中获得小于100％w/w例如不大于95％w/w，例如不大于90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％w/w的颗粒ESM的量在水性悬浮液中提供颗粒ESM和任何其他支架组分——如果存在。
尤其考虑从任何上述这些值的组合可获得的任何和所有范围端点。
在某些实施方式中，其他支架组分将包括胶原和/或明胶优选地胶原，例如基本上胶原和/或明胶优选地胶原组成或由胶原和/或明胶优选地胶原组成。在这些实施方式中，颗粒ESM与胶原和/或明胶组分的重量比将是1:3至20:1，例如1:3至15:1、1:3至10:1、1:3至6:1、1:3至5:1、1:3至3:1、1:3至2:1或约1:1。本文描述了进一步的比例。
在某些实施方式中，其他支架组分将包括PVA，例如基本上由PVA组成或由PVA组成。在这些实施方式中，颗粒ESM与PV组分的重量比将是1:3至20:1，例如1:3至15:1，1:3至10:1，1:3至6:1，1:3至5:1，1:3至3:1，1:3至2:1或约2:1或约1:1。本文描述了进一步的比例。
在某些实施方式中，该方法包括如此步骤，其中在步骤(i)中提供的颗粒ESM的ESM已经接触一定浓度的酸或接触一定浓度的酸，并且持续足以使ESM水合的时间(并且优选地使存在的任何胶原和/或明胶溶解)，例如在约0.5M的浓度下的乙酸(例如0.1至1M、0.3至0.7M或0.4至0.6M)。可以使用可选的酸，但是酸的选择可以影响支架的孔径大小和机械特性(Ratanavaraporn J等，J BiomaterSciPolym Ed 19，945-952；2008)。乙酸对于优化胶原支架的制备是优选的。
冷冻干燥(冻干)可以通过任何方便的方式实现，并且可以调节其参数以控制干燥支架的特性。作为实例，冷冻干燥可包括以约1℃/分钟的速率使悬浮液冷却至约‐40℃，保持在约‐40℃持续至少约1小时，以约1℃/分钟的速率加热至0℃，并且施加约200m托(0.266mbar)的真空持续至少约17小时。
在另一具体实施方式中，提供用于制备海绵形式的如本文限定的本发明的支架的另一方法，所述方法包括
(i)(a)以足以在支架中获得至少25％w/w颗粒ESM的量在水性悬浮液中提供颗粒ESM连同一种或多种其他支架组分，和适合的聚合或交联的引发剂，其中所述其他支架组分是可聚合的或可交联的支架组分，和
(i)(b)使颗粒ESM悬浮液的温度维持在低于悬浮液的冰点的温度下——任选地在模具中——持续一段时间，并且在足以允许聚合或交联发生的条件下，和
(i)(c)干燥步骤(i)(b)的聚合或交联产物，从而获得所述支架；或
(ii)(a)以足以在支架中获得至少25％w/w颗粒ESM的量在水性悬浮液中提供颗粒ESM连同一种或多种其他支架组分，其中所述其他支架组分是可聚合的或可交联的支架组分，
(ii)(b)使所述颗粒ESM悬浮液与适合的聚合或交联的引发剂结合，
(ii)(c)使悬浮液的温度维持在低于悬浮液的冰点的温度下——任选地在模具中——持续一段时间，并且在足以允许聚合或交联发生的条件下，和
(ii)(d)干燥步骤(ii)(c)的聚合或交联产物，从而获得所述支架；或
(iii)(a)以足以在支架中获得至少25％w/w颗粒ESM的量在水性悬浮液中提供颗粒ESM连同一种或多种其他支架组分，其中所述其他支架组分是可聚合的或可交联的支架组分，
(iii)(b)使悬浮液的温度维持在低于悬浮液的冰点的温度下——任选地在模具中，
(iii)(c)使所述ESM悬浮液与适合的聚合或交联的引发剂结合持续一段时间，并且在足以允许聚合或交联发生的条件下，和
(iii)(d)干燥步骤(iii)(c)的聚合或交联产物，从而获得所述支架。
其他支架组分和/或适合的引发剂可以悬浮和/或溶解在颗粒ESM的悬浮液中。
在某些实施方式中，在水性悬浮液中提供颗粒ESM连同一种或多种其他支架组分和适合的聚合或交联的引发剂——其中所述其他支架组分是可聚合的或可交联的支架组分——的步骤(i)(a)包括在水性悬浮液中提供片状或薄片形式的ESM连同一种或多种其他支架组分和引发剂，并且对所述悬浮液应用ESM尺寸减小技术例如本文描述的那些。转子-定子分散机的使用可能是有利的。
在其他实施方式中，在水性悬浮液中提供颗粒ESM连同一种或多种其他支架组分和引发剂的步骤(i)(a)包括提供颗粒ESM，所述一种或多种其他支架组分和所述引发剂，它们处于其天然状态或在其水溶液或水性悬浮液中，并且将这些形式以任何顺序或同时结合。例如，这可包括使一种或多种其他支架组分与包含引发剂的所述颗粒ESM的水性悬浮液结合，或使所述颗粒ESM与一种或多种其他支架组分和引发剂的水溶液或水性悬浮液结合，或使所述颗粒ESM的水性悬浮液与一种或多种其他支架组分的水溶液或水性悬浮液和引发剂的水溶液或水性悬浮液结合。进一步的尺寸减小可以在任意点处进行。
在某些实施方式中，在水性悬浮液中提供颗粒ESM连同一种或多种其他支架组分的步骤(ii)(a)和步骤(iii)(a)包括在水性悬浮液中提供片状或薄片形式的ESM连同一种或多种其他支架组分并且对所述悬浮液应用ESM尺寸减小技术，例如本文描述的那些。转子-定子分散机的使用可能是有利的。
在其他实施方式中，在水性悬浮液中提供颗粒ESM连同一种或多种其他支架组分的步骤(ii)(a)和步骤(iii)(a)包括提供颗粒ESM和所述一种或多种其他支架组分并且结合水性液体，以形成所述悬浮液。这可包括使一种或多种其他支架组分与所述颗粒ESM的水性悬浮液结合，或使所述颗粒ESM与一种或多种其他支架组分的水溶液或水性悬浮液结合，或使所述颗粒ESM的水性悬浮液与一种或多种其他支架组分的水溶液或水性悬浮液结合。进一步尺寸减小可在任意点处进行。
模具可以具有适合其期望用途的大小和形状(或近似形状)，例如将应用支架的位置(例如，伤口、关节、骨缺损)的大小和形状或支架将形成基础的器官、组织或其部分的大小和形状。在其他实施方式中，选择模具的大小和形状，以形式可以切割至应有尺寸的产品。
模具可以完全地封闭悬浮液或至少一面将保持开放。通过完全封闭悬浮液，可以限制冷冻期间海绵的膨胀，并且从而可控制孔隙率、孔径大小和其他结构特征。
在某些实施方式中，以足以在支架中获得至少30％w/w，例如至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％w/w或100％w/w的颗粒ESM的量，在水性悬浮液中提供颗粒ESM。
在其他实施方式中，以足以在支架中获得小于100％w/w，例如不大于95％w/w，例如不大于90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％w/w的颗粒ESM的量，在水性悬浮液中提供颗粒ESM。
尤其考虑从任何上述这些值的组合可获得的任何和所有范围端点。
在某些实施方式中，其他支架组分包括PEG，例如基本上由PEG组成，或由PEG组成。在这些实施方式中，颗粒ESM与PEG组分的重量比是1:3至20:1，例如1:3至15:1、1:3至10:1、1:3至6:1、1:3至5:1、1:3至3:1、1:3至2:1或约1:2或约1:1。本文描述了进一步的比例。
如上述的，在某些实施方式中，该方法包括如此步骤：其中步骤(i)(a)、(ii)(a)和/或(iii)(a)中提供的颗粒ESM的ESM已经接触一定浓度的酸或接触一定浓度的酸，并且持续足以使ESM水合的时间。
通过本发明的所述方法获得或可获得的组织工程化支架是本发明的进一步方面。
预期本发明的组织工程化支架能够具有用作需要生物可降解的、生物相容的支架的任何组织工程化应用中的支架的能力。
因此，本发明提供了组织工程化的体内方法，所述方法包括提供本发明的组织工程化支架并且将足够量的所述支架应用于受试者需要再生、修复或再造的组织中或组织上或应用于需要组织置换或新生组织构建的位置处。在应用之前，支架可接种有能够形成所述组织的细胞，更优选地在应用之前，在有利于组织形成的条件下培养接种的支架。
本发明进一步提供了本发明的组织工程化支架用于体内组织工程化的方法，例如本文描述的那些。
本发明进一步提供了本发明的组织工程化支架在制造用于体内组织工程化的方法——例如本文描述的那些——的药物中的用途。
在本发明的这些方面中，支架可视为是药物组合物(或药物)，其包括至少约25％w/w的颗粒蛋壳膜(ESM)，其为基本上干燥的、三维(3D)、多孔、生物可降解的和生物相容的组织工程化支架的形式，其中所述颗粒ESM基本上均匀地分布在其中。
本发明也提供了组织工程化的离体方法，所述方法包括提供本发明的组织工程化支架并且将足够量的所述支架应用于从受试者分离的需要再生、修复或再造的组织或应用于需要组织置换或新生组织构建的所述分离的组织中或组织上的位置处。在应用之前，支架可接种有能够形成所述组织的细胞，更优选地在应用之前，在有利于组织形成的条件下培养接种的支架。
本发明也提供了组织工程化的体外方法，所述方法包括提供足够量的本发明的所述组织工程化支架，用能够形成所述组织的细胞接种所述支架并且在有利于组织形成的条件下培养支架和细胞。如此形成的组织可植入受试者中。
组织可选自肾上腺、肝脏、心脏、肾、胰腺、垂体、甲状腺、免疫、卵巢、睾丸、前列腺、子宫内膜、眼睛、乳腺、脂肪、上皮、内皮、神经、肌肉、结缔(例如韧带和软骨)、肺、内胚层、表皮和骨组织，优选肌肉、结缔(例如软骨)、骨和神经组织。
提及组织工程化包括工程化器官、四肢和身体部分，或包括所述组织的其部分或局部或组成部分，所述组织例如肾上腺、肝、心脏、肾、胰腺、垂体腺、甲状腺、骨髓、卵巢、睾丸、前列腺、子宫内膜、眼睛、乳房、脂肪层、上皮、内皮、神经、脑、肌肉、韧带、软骨、肺、内胚层、表皮和骨，优选表皮、肌肉、软骨、骨和神经。
因此，在某些实施方式中，本发明的体内方法可以表皮、肌肉、骨、软骨或神经再生、修复或再造、置换或新生产生的方法。在这些实施方式中，本发明的支架将应用于需要其的器官/组织。在这些实施方式中，待接种的细胞是适合需要其的器官/组织的那些。
因此，在某些其他实施方式，本发明的体外方法可以是组织或器官构建的方法，尤其用于构建表皮、肌肉、骨、软骨或神经和器官、四肢和身体部分，或其部分、局部或其组成部分的体外方法。
颗粒ESM和携带所述颗粒ESM的本发明的支架的性质使得本发明的支架尤其用于管理伤口，尤其是慢性伤口。预期本发明的支架由于它们的3D和多孔结构，具有止血特性，并且尤其当干燥应用时，具有伤口渗出物管理能力。由于它们的3D和多孔结构，支架也能够提供空间填充效果并且用作伤口中适合组织生长的支撑，同时抑制不当的组织生长，例如手术黏连。颗粒ESM的化学和物理性质也在伤口背景下提供有功能的优势，例如MMP抑制、促进细胞迁移进入伤口和/或伤口组织细胞的增殖或分化和/或新生组织形成、抗微生物效果和抗炎作用。
因此，在某些具体实施方式中，本发明提供了促进伤口愈合的方法，其中如本文限定的本发明的组织工程化支架以足以促进伤口愈合的量应用于所述伤口。
可选地，本发明的该方面提供了如本文限定的本发明的组织工程化支架用于促进伤口愈合。
仍可选地，本发明的该方面提供了如本文限定的本发明的组织工程化支架在制造用于促进伤口愈合的药物中的用途。
接种有来自受伤组织的细胞或促进细胞迁移进入伤口和/或伤口组织细胞的增殖或分化和/或新生组织形成的细胞的支架可以是尤其有利的。
在本发明的这些方面中，支架可视为是药物组合物(或药物)，其包括至少约25％w/w的颗粒蛋壳膜(ESM)，其为基本上干燥的、三维(3D)、多孔、生物可降解的和生物相容的组织工程化支架的形式，其中所述颗粒ESM基本上均匀分布在其中。
本发明的支架可独自(至少起初在伤口的接触点)或作为复合敷料或支架涂布的可植入医疗设备的一部分使用(应用或施加至伤口)。可植入医疗设备包括但不限于产生伤口的任何类型的经皮设备和/或管线(例如具有套囊的导管，例如Dacron或胶原套囊)；人工设备例如心脏瓣膜、人工关节；和软组织植入物(例如乳房、臀和唇植入物)；支架和起搏器。“可植入”医疗设备可包括如此设备，该设备的任何部分包含在身体中，即设备可整体或部分植入。在下面的描述中，提及本发明的支架也是提及如本文所描述的复合敷料或支架涂布的可植入医疗设备，除非上下文另外指出。
促进伤口愈合意思是用如本文限定的本发明的组织工程化支架治疗伤口加速了所讨论的伤口的愈合过程(即通过三个可识别的愈合过程阶段(即炎症阶段、增殖阶段和/或重塑阶段)伤口进展)。愈合过程的加速可表现为通过一个、两个或所有愈合阶段的进展速率的增加。如果伤口是在一个愈合阶段停止的慢性伤口，则加速可表现为在停止之后重新开始线性、顺序愈合过程。换句话说，治疗将伤口从非愈合状态转换为伤口开始进展通过愈合阶段的状态。重新开始之后的进展与通常急性伤口愈合的速率相比可为正常速率或甚至更慢的速率。促进伤口愈合也可视为相当于防止所讨论伤口的愈合过程的减速。愈合过程的减速可表现为通过一个、两个或所有愈合阶段的进展速率的下降。如果伤口是在停止之后以线性、顺序愈合过程重新开始的慢性伤口，则减速可表现为回到停止在一个愈合阶段。换句话说，治疗防止伤口从愈合状态转换至非愈合状态。促进伤口愈合可进一步视为相当于治疗现有伤口或防止现有伤口和/或现有愈合伤口的生长变成差的愈合或慢性伤口。
在该方面，用如本文限定的本发明的组织工程化支架治疗伤口以便促进愈合可降低MMP在伤口中针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的活性，或至少可降低MMP活性的总体水平或至少可降低ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子降解的水平。因此，本发明可视为包括促进伤口愈合的方法，其中MMP在伤口中针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的活性被降低或限制，其中如本文限定的本发明的组织工程化支架应用于所述伤口，其量足以降低或限制MMP在伤口中针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的活性。
更一般地，本发明可视为包括促进伤口愈合的方法，其中MMP在伤口中的活性的总体水平被降低或限制，其中如本文限定的本发明的组织工程化支架应用于所述伤口，其量足以降低或限制MMP在伤口中的活性的总体水平。
也更一般地，本发明可视为包括促进伤口愈合的方法，其中伤口中的ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子降解被降低或限制，其中如本文限定的本发明的组织工程化支架应用于所述伤口，其量足以降低或限制伤口中的ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的降解。
MMP-2(也称为72kDa IV型胶原酶或明胶酶A)、MMP-8(也称为嗜中性粒细胞胶原酶或PMNL胶原酶)和/或MMP-9(也称为92kDa IV型胶原酶、92kDa明胶酶或明胶酶B)通常出现在伤口，尤其慢性伤口中，并且在优选的实施方式中，降低了这些MPP特异性针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的活性。
在某些实施方式中，MMP在伤口中针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的活性被降低或限制至对于进行治疗的伤口的愈合过程无害的水平。该降低可观察为伤口(或伤口流体)中ECM蛋白质(例如胶原和弹性蛋白)和/或肽生长或分化因子片段的水平的降低，其接着指示这些蛋白质的降解，并且其可由包括免疫组织化学/免疫细胞化学技术的常规技术和/或生物分子(例如蛋白质)染色剂和染料或通过用色谱技术分析伤口流体而检测。限制可观察为这种水平的保持。
每个伤口需要针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的不同(例如降低)水平的MMP活性并且甚至随着时间的推移相同伤口对于此的需要可能不同。尽管在必要时这可由本领域技术人员不过度负担的情况下确定，但是本文公开的包含颗粒ESM的组织工程化支架的关键优势是实现有效水平的MMP抑制相对容易并且因此按常规的繁琐的剂量优化不是必须的。事实上，在大部分情况下，本文的限定的包含颗粒ESM的组织工程化支架造成的MMP活性的任何降低将有效促进伤口愈合。
在将本发明的支架应用于进行治疗的伤口之后，数值表达的针对伤口中ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的MMP活性(或总体ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子降解)优选地降低至少5％，例如至少10％、15％、20％、25％、30％。在某些实施方式中，可能必须维持一些水平的针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的MMP活性(或总体ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子降解)，并且在这种实施方式中针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的MMP活性的下降(或总体ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子降解)不大于90％，例如不大于80％、70％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。尤其考虑从任何这些值的组合可获得的任何和所有范围端点。
不希望被理论所束缚，针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的MMP活性(或总体ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子降解或总体MMP活性)的降低或限制可基于许多机制。这可包括但不限于直接抑制伤口MMP、吸收和减活伤口MMP、通过提供可选的/过多的底物滴定出(titrate out of)伤口MMP、抑制参与伤口MMP激活的酶(例如丝氨酸蛋白酶，其包括纤溶酶，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和肥大细胞糜酶)、上调伤口中MMP的内源性抑制剂(例如TIMP；金属蛋白酶的组织抑制剂)、抑制伤口细胞和/或炎症细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞表达和/或分泌MMP。本领域技术人员利用常规的分析技术——其一些是商业上可获得的——能够测量伤口中的这类作用而没有过度的负担。上面叙述的降低百分比在这些背景中适用。
进行治疗的伤口中总体MMP活性的降低或保持，可反映针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的MMP活性的降低或限制。总体MMP活性是针对所有伤口底物的所有MMP活性的量度。可利用常规的分析技术——其一些是商业上可获得的——测量总体MMP活性而没有过度的负担。在将本发明的支架应用于进行治疗的伤口之后，数值表达的伤口中总体MMP活性将优选地降低至少约5％，例如至少约10％、15％、20％、25％、30％。
在某些实施方式中，可能必须维持一些水平的总体MMP活性，和尤其是针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的MMP活性，并且在这种实施方式中，总体MMP活性，尤其是针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的MMP活性的降低不大于约90％，例如不大于约80％、70％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。尤其考虑从任何这些值可获得的范围端点的任何和所有组合。
在其他实施方式中，考虑具体MMP，例如MMP-2、MMP-8和/或MMP-9的总体活性。在这些实施方式中，总体MMP活性是所讨论的具体MMP针对所有伤口底物的活性。
在一个实施方式中，本发明该方面的方法可包括其中受试者被诊断为具有下述伤口的步骤：所述伤口处在不适当的，即过多水平的针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的MMP活性(或总体MMP活性的水平)的风险下或将从使针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的MMP活性(或总体MMP活性水平)下降或限制(例如保持)受益。在其他实施方式中，本发明的该方面的方法可包括其中受试者被诊断为具有下述伤口的步骤：所述伤口处在不适当的，即过多水平的ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子降解的风险下。
在进一步的实施方式中，本发明该方面的方法在将本发明的支架应用于伤口之后可包括下述步骤：其中监测ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的降解，和/或监测针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子的MMP活性和/或监测总体MMP活性。在其他实施方式中，一般而言，MMP 2、8和/或9视为代替MMP。
可选地或另外地，本发明的方法在将本发明的包含颗粒ESM的组织工程化支架应用于伤口之后可包括下述步骤：其中监测伤口的临床指征(例如伤口尺寸(深度和/或面积)、愈合时间、伤口或周围组织的一般性不适或疼痛)。这些监测步骤可包括就在将支架应用于伤口之前或在受试者的治疗中甚至更早的另一点比较相同的指标。
在该方面中，“足够(或有效)量”的本发明的支架是该量的如本文限定的支架产生上述对MMP活性和ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子降解的作用，并且从而促进伤口愈合。基于常规的剂量响应方案和通常地上面讨论的用于评估MMP活性和ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子降解的常规技术，本领域技术人员能够容易确定有效(足够)量的本发明的支架是什么。在其他实施方式中，“足够(或有效)量”的本发明的支架是该量的如本文限定的支架对于上述伤口的临床指征产生积极的作用。
通常的伤口愈合过程包括增殖阶段，其中伤口组织的细胞迁移进入伤口和/或增殖而形成新生组织，但是在一些情况下愈合过程停在之前的阶段。
因此，可促进伤口组织的细胞的活力和/或生长的伤口愈合治疗将是尤其有利的。
在该方面中，用如本文限定的本发明的组织工程化支架治疗伤口以便促进愈合可促进伤口组织的细胞的活力和/或生长。所以本发明可视为包括促进伤口愈合的方法，其中伤口组织的细胞的活力和/或生长被促进，其中如本文限定的本发明的组织工程化支架以足以促进伤口组织的细胞的活力和/或生长的量应用于所述伤口。
上面讨论的术语“活力和/或生长”应解释为与在微生物背景(下方)下所讨论的一致，但是在该情况下生长也可包括伤口组织的细胞的分化。
“促进伤口组织的细胞的生长”意思是增加或至少维持或防止降低伤口组织的细胞的可测量的生长(例如复制和/或分化)或其速率。优选地伤口组织的细胞的可测量的生长(例如复制和/或分化)或其速率，增加至少5％，更优选地至少10％、20％、30％或40％，例如至少50％。
在一个实施方式中，本发明的该方面的方法可包括其中受试者被诊断为具有下述伤口的步骤：所述伤口将从使伤口组织细胞的活力和/或生长得到促进中获益。
在进一步的实施方式中，本发明的该方面的方法在将本发明的支架应用于伤口之后可包括下述步骤：其中监测伤口组织的细胞的活力和/或生长，和/或新生组织形成。这些监测步骤可包括就在将本发明的支架应用于伤口之前或在受试者的治疗中甚至更早的另一点比较相同的指标。
所以，可促进伤口组织的细胞迁移进入伤口的伤口愈合治疗也是尤其有利的。
在该方面中，用如本文限定的本发明的支架治疗伤口以便促进愈合可以促进伤口组织的细胞迁移进入伤口。所以，本发明可视为包括促进伤口愈合的方法，在该方法中促进了伤口组织的细胞迁移进入伤口，其中如本文限定的本发明的支架以足以促进伤口组织的细胞迁移进入伤口的量应用于所述伤口。
“促进迁移”意思是增加或至少维持或防止降低伤口组织的细胞可测量的迁移进入伤口，或其速率。优选地，伤口组织的细胞的可测量的迁移，或其速率，增加至少5％，更优选地至少10％、20％、30％或40％，例如至少50％。
在一个实施方式中，本发明的该方面的方法可包括其中受试者被诊断为具有下述伤口的步骤：所述伤口将从使伤口组织的细胞迁移进入伤口得到促进中获益。
在进一步的实施方式中，本发明的该方面的方法在将本发明的支架应用于伤口之后可包括下述步骤，其中监测伤口组织的细胞迁移进入伤口的程度，和/或新生组织形成。这些监测步骤可包括就在将本发明的支架应用于伤口之前或在受试者的治疗中甚至更早的另一点比较相同的指标。
促进迁移和/或增殖和/或分化可促进新生组织形成。可通过显微镜分析伤口或其样品监测和量化伤口组织的细胞迁移进入伤口、其增殖和分化和伤口中新生组织形成。这种分析可包括化学和/或免疫化学染色，以检测伤口组织和/或伤口中新生组织的细胞上的分子标记物。
在这些实施方式中，在将支架应用于伤口之后，伤口细胞接触本发明的支架。更具体地，伤口细胞将接触有效量的本发明的支架，所述支架有效促进伤口组织的细胞的活力和/或生长，促进伤口组织的细胞迁移进入伤口或促进新生组织形成。
在这些实施方式中，“有效量”的如本文限定的支架是该量的支架产生上述促增殖或促迁移作用，或促进新生组织形成，并且从而进一步促进伤口愈合。基于常规剂量响应方案和通常地上面讨论的用于评估上述伤口细胞活力、生长和迁移的常规技术，本领域技术人员能够容易确定有效(足够)量的支架是什么。
伤口是感染，尤其是慢性感染的理想环境，这是由于它们缺少上皮屏障和用于微生物附着和定殖的基底和表面的可用性。问题是，伤口的感染通常通过增加伤口和周围伤口组织中的炎症和坏死而延迟愈合，并且因此使得该伤口更容易遭受确立的(慢性)感染。难以愈合的许多伤口包括感染并且因此也可处理伤口中感染(所谓的伤口的生物负载)的伤口愈合治疗将是尤其有利的。
在该方面中，用如本文限定的本发明的组织工程化支架治疗伤口以便促进愈合可抑制伤口中存在的微生物的活力和/或生长并且从而抵抗伤口中存在的微生物感染。所以，本发明可视为包括促进伤口愈合的方法，其中抑制伤口中存在的微生物的活力和/或生长，或其中抵抗伤口中的微生物感染，其中如本文限定的本发明的组织工程化支架以足够抑制微生物的活力和/或生长，或抵抗微生物感染的量应用于所述伤口。
如本文使用的术语“微生物”包括为微观的——即太小而肉眼不可见的——任何微生物生物体。具体而言，如本文使用的，该术语包括通常认为是微生物的细胞生物体，尤其是细菌、真菌、古细菌、藻类和原生生物。微生物可以是原核的或真核的，并且可来自微生物的任何纲、属或种。微生物可以是需氧的或厌氧的。微生物可以是病原性的或非病原性的，或可以是腐败微生物或指示微生物。微生物可以是耐药(即抗微生物药物，例如抗生素或抗真菌的药物)或耐多药的。在尤其优选的实施方式中，该微生物能够定殖伤口并且延迟伤口愈合。
细菌或真菌表示优选类型的微生物并且因此本发明的支架可优选地视为具有抗细菌或抗真菌活性(例如杀菌或抑菌或杀真菌或抑真菌)。
认为，本发明的支架没必要募集生理学系统或机构(例如免疫系统)，来赋予它们杀微生物或抑微生物(例如它们的细胞毒性或抑制细胞)作用。相反地，本发明的支架(或至少支架的颗粒ESM)直接作用于微生物。
优选地细菌选自下述属：无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、放线杆菌属(Actinobacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、交替单胞菌属(Alteromonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、巴尔通氏体属(Bartonella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、包特氏菌属(Bordetella)、布鲁氏菌属(Brucella)、伯克氏菌属(Burkholderia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、心杆菌属(Cardiobacterium)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、色杆菌属(Chromobacterium)、金黄杆菌属(Chyseobacterium)、华丽单胞菌属(Chryseomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、柯克斯氏体属(Coxiella)、神秘杆菌属(Cryptobacterium)、爱德华菌属(Edwardsiella)、艾肯菌属(Eikenella)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、金氏杆菌属(Kingella)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、军团菌属(Legionella)、细螺旋体属(Leptospira)、纤毛菌属(Leptotrichia)、明串珠菌属(Leuconostoc)、李斯特菌属(Listeria)、利斯顿氏菌属(Listonella)、动弯杆菌属(Mobiluncus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、摩根氏菌属(Morganella)、分支杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、诺卡氏菌属(Nocardia)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、泛生菌属(Pantoea)、副衣原体属(Parachlamydia)、巴斯德菌属(Pasteurella)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、变形菌属(Proteus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、立克次氏体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、希瓦氏菌属(Shewenella)、志贺氏杆菌属(Shigella)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、链杆菌属(Streptobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、密螺旋体属(Treponem)和耶尔森菌属(Yersinia)。
因此，细菌可以是革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，或实际上革兰氏不确定的细菌(Gram-indeterminate bacteria)。革兰氏阴性细菌是重要的。在革兰氏阴性菌中，肠杆菌科和革兰氏阴性菌非发酵菌是尤其值得注意的。
优选地，细菌可选自下述属：假单胞菌属、不动杆菌属、伯克氏菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、链球菌属、肠球菌属、普罗威登斯菌属、莫拉氏菌属、葡萄球菌属，例如铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、伯克氏菌属某些种、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)、多噬伯克氏菌(Burkholderia multivorans)、鼻疽伯克氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)、司氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifacien)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)、栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)、卡他莫拉氏菌(Moraxallacatarrhalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如MRSA)。
微生物也可以是真菌或来自真菌，包括例如可能或可能已经被分类为原生生物的真菌，例如来自假丝酵母属、曲霉属、肺囊虫属(Pneumocystis)、青霉菌属和镰刀菌属(Fusarium)的真菌。代表性真菌种类包括但不限于白假丝酵母、杜氏假丝酵母(Candida dubliniensis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplama capsulatum)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigates)、粗球孢子菌(Coccidiodes immitis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidiodes brasiliensis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermitidis)、卡氏肺孢菌(Pneomocystis carnii)、马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffi)、链格孢菌(Alternaria alternate)
微生物可以在生物膜中，或换句话说，微生物可以为生物膜中生长模式。“生物膜”意思是特征在于固着细胞(sessile cell)占主导的微生物的团体，所述固着细胞连接至基底或界面或彼此连接(也可存在一些游动细胞)和嵌入细胞外聚合物的基质(更具体地是它们产生的细胞外聚合物)，其特征在于该菌落的微生物相对于生长速率和基因转录展示改变的表型(例如与它们的“非生物膜”或自由漂浮或浮游对应物相比)。“生物膜中”意思是微生物(完全或部分)在生物膜的聚合物基质中或其上或与其关联。换句话说，“不在生物膜中”的微生物是分离的例如浮游的微生物，或如果在多个微生物的聚集中，该聚集是无条理的和/或没有生物膜的基质特征。在每种情况下，个体微生物不展示在它们的生物膜居住(dwelling)对应物中观察到的改变的表型。
术语“微生物的活力”意思是微生物在给定条件下，例如在伤口中存活的能力。存活可等同视为保持活的。本发明的支架可通过杀微生物效果降低微生物的活力。可使用下面为测量微生物细胞死亡(和活力)而详述的技术进行微生物活力的测定。
因此，“抑制微生物的活力”可包括降低微生物的活力，或使得其较不可能存活，或不能生活的任何作用。尤其该术语包括杀死或破坏微生物。
术语“杀死微生物”指使得微生物停止存活即死亡的动作。如果当置于通常支持该微生物生长的培养基中时，其可被诱导复制和/或生长，或至少显示形态学改变，和/或微生物代谢养分以释放能量来支持细胞功能，则微生物被视为是活的。典型地，如果细胞膜完整性丧失，则微生物可视为是死的。
可使用许多常规试验，以确定微生物是否是活的(活着的)或死的。一种选择是将微生物置于通常支持该微生物生长的条件下并且通过适合的标准方式监测微生物的生长，例如通过监测微生物的尺寸、微生物的形态、随着时间的推移菌落中微生物的数量、培养基中养分的消耗等。另一种选择是评估微生物的细胞死亡的形态学特征，例如坏死或细胞凋亡体、膜起泡、核凝聚和DNA切割成规则尺寸的片段、破裂的细胞壁或细胞膜和细胞内容物泄漏进入细胞外环境。其他方法使用死微生物中细胞膜完整性的特征性丢失。不可渗透膜的染料(例如台盼蓝和碘化丙啶)惯常地用于评估细胞膜完整性。仍进一步的选择是测量微生物的代谢。这可以许多方式惯常地实现。例如可以测量ATP的水平。
“微生物的生长”意思是微生物的尺寸的增加或微生物的组成成分的量和/或体积(例如核酸的量、蛋白质的量、细胞核的数量、细胞器的数量或尺寸、细胞质的体积)的增加和微生物的数量的增加，即微生物的复制的增加。
“抑制微生物的生长”意思是微生物的可测量的生长(例如复制)，或其速率下降。优选地，微生物的可测量的生长(例如复制)，或其速率下降至少50％，更优选地至少60％、70％、80％或90％，例如至少95％。优选地，可测量的生长(例如复制)停止。从微生物尺寸增加或扩张等角度的生长可独立于复制被抑制并且反之亦然。本发明的支架可通过抑微生物作用和/或杀微生物作用而抑制微生物的活力。
也可见本发明的这些方面提供如本文限定的本发明的组织工程化支架用于抵抗，和尤其治疗伤口中的微生物感染，或如本文限定的本发明的组织工程化支架在制备用于抵抗，和尤其治疗伤口中微生物感染的药物中的用途。该方面中可见，可通过抑制受试者中微生物的生长和/或活力而抵抗感染。该感染可以是生物膜感染。
“抵抗感染”可视为治疗或预防感染，例如包括预防或抑制感染的形成、减少或消除感染、减少构成感染的菌落中微生物的数量、降低或停止感染和/或其中微生物的生长速率、降低或停止感染中微生物数量的扩张速率。“抵抗生物膜”包括预防性和保守(reactionary)措施或处理。所以，抵抗生物膜包括预防或抑制生物膜的形成、消除或减少生物膜、减小生物膜尺寸、减少生物膜菌落中微生物的数量、降低或停止生物膜的生长速率、降低或停止生物膜菌落中微生物数量的扩张速率、降低生物膜的物理完整性、增加生物膜菌落中微生物对抗微生物剂或宿主免疫防御机制的敏感性和增加生物膜对抗微生物剂或宿主免疫防御机制的通透性。
在这些实施方式中，在将支架应用于伤口之后，微生物将接触如本文限定的本发明的组织工程化支架。术语“接触”包括将支架直接应用于已经存在于伤口中或伤口上的微生物，或将支架应用于稍后接触微生物的伤口。
在这些实施方式中，“足够(或有效)量的”本发明的支架是该量的支架产生上述杀微生物或抑微生物作用，或有效抵抗感染，并从而促进伤口愈合。基于常规剂量响应方案和通常地如上所讨论的用于评估微生物死亡或生长抑制等的常规技术，本领域技术人员能够容易确定有效(足够)量的支架是什么。可通过使用本领域技术人员熟知的常规体外系统评估本发明的支架(更具体地其中包含的颗粒ESM)的直接效果，所述常规体外系统没有可干扰杀微生物或抑微生物作用的评估的完整的生理学系统或机构(例如简单的细胞培养系统、分离的细胞/病毒系统)。
在一个实施方式中，本发明的该方面的方法可包括其中受试者被诊断为具有下述伤口的步骤：所述伤口处在发展感染的风险下或将从使其中感染得到治疗受益。
在进一步的实施方式中，本发明的该方面的方法在将如本文限定的本发明的组织工程化支架应用于伤口之后可包括下述步骤，其中监测伤口中微生物的生长和/或活力或感染程度。这些监测步骤可包括就在将本发明的支架应用于伤口之前或在受试者的治疗中甚至更早的另一点比较相同的指标。
通常的伤口愈合过程包括炎症阶段，但是在一些情况下愈合过程停在该炎症阶段并且炎症反应变得过度。因此，也可处理伤口中过度炎症反应的伤口愈合治疗将是尤其有利的。
在该方面中，用如本文限定的本发明的组织工程化支架治疗伤口，以便促进愈合可降低或限制伤口中的炎症。所以，本发明可视为包括促进伤口愈合的方法，在该方法中伤口中的炎症被降低或限制，其中以足以降低或限制其中炎症的量将如本文限定的本发明的组织工程化支架应用于所述伤口。
伤口中的炎症可见为红斑、肿胀、局部温热、水肿和/或脓。炎症的一种或多种这些征兆的解剖学程度和/或强度的减少归相当于炎症的减少。保持炎症的一种或多种这些征兆的解剖学程度和/或强度或防止其增加相当于炎症的限制。
可选地或另外地，可例如在伤口组织的样品中和/或来自伤口内部的样品中测量伤口中促炎和/或抗炎标记物——例如细胞因子和趋化因子——和/或免疫细胞的水平。更具体而言，可测量TNFα、IL-1、IL-6、NF-κB、ROS、组胺、巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞和/或嗜中性粒细胞的水平。这可，例如，通过伤口样品的免疫试验或流式细胞术或适合的活性试验进行。
伤口样品中一种或多种促炎标记物和/或免疫细胞的水平的下降可视为相当于伤口中炎症的减少。类似地，伤口样品中一种或多种抗炎标记物的增加可视为相当于伤口中炎症的减少。保持一种或多种促炎标记物和/或免疫细胞的水平或防止其增加，或保持伤口样品中一种或多种抗炎标记物的水平或防止其下降可视为相当于伤口中炎症的限制。
该方面中，“足够(或有效)量”的本发明的支架是该量的支架产生对上述的伤口中的炎症的作用，尤其产生对于促炎和/或抗炎标记物水平或活性和/或免疫细胞水平或活性的作用，并且从而进一步促进伤口愈合。基于常规剂量响应方案和通常地如上所讨论的用于评估伤口炎症的常规技术，本领域技术人员能够容易确定有效(足够)量的支架是什么。
在一个实施方式中本发明的该方面的方法可包括其中受试者被诊断为具有下述伤口的步骤：所述伤口处在发展炎症的风险下或将从使其中炎症得到治疗(即减少的或限制)受益。
在进一步的实施方式中，本发明的该方面的方法在将本发明的支架应用于伤口之后可包括其中监测伤口中炎症的程度的步骤。这些监测步骤可包括就在将本发明的支架应用于伤口之前或在受试者的治疗中甚至更早的另一点比较相同的指标。
在某些实施方式中，本发明的方法实现了用两种或更多种或所有上述伤口作用促进了伤口愈合：例如抑制ECM和/或肽生长或分化因子的降解(尤其抑制针对ECM和/或肽生长或分化因子的MMP活性)和一种或多种上述上述伤口作用，尤其是促进伤口组织的细胞的增殖、迁移和/或分化和/或新生组织形成，以及抗微生物作用和/或抗炎作用。
在某些实施方式中，本发明的方法通过如下实现了促进伤口愈合：(i)抑制ECM和/或肽生长或分化因子的降解(尤其抑制针对ECM和/或肽生长或分化因子的MMP活性)和一种或多种或所有上述另外伤口作用，尤其是抗微生物作用和/或抗炎作用；或(ii)减少伤口中的炎症和一种或多种或所有上述另外伤口作用，尤其是抗微生物作用和/或MMP抑制作用。
伤口可出现在受试者中或受试者上。术语“受试者中”在本文广义地用于包括受试者内或受试者上的位置或部位，例如外部身体表面，并且可包括，尤其是包含可植入医疗设备的伤口。
因此，伤口所以可出现在皮肤中或皮肤上或出现在下述中任何易受影响的表面中或表面上：口腔(例如齿龈、龈缝、牙周袋)、生殖道(例如宫颈、子宫、输卵管)、腹膜、胃肠道、耳朵、眼睛、前列腺、尿路、血管系统、呼吸道、心脏、肾、肝、胰腺、神经系统或脑。应相应地解释“伤口组织的细胞”。优选地，伤口是皮肤(皮肤的)伤口，换句话说，皮肤或皮肤病学伤口，其包括表皮和/或真皮和下层组织的任何深度的伤口。
可植入医疗设备包括但不限于任何种类的产生伤口的经皮设备和/或管线(例如中心静脉导管，尤其具有套囊的导管，例如Dacron或胶原套囊)、人工设备，例如，心脏瓣膜、人工关节、牙科植入物和软组织植入物(例如乳房、臀和唇植入物)、支架、起搏器和气管造口术管。“可植入”医疗设备可包括其任何部分包含在身体中的设备，即设备可全部或部分植入。
通过如下可外科地造成伤口：物理损伤(例如机械损伤；热损伤，例如由过热或过冷造成的那些；电损伤，例如接触电源造成的那些；和例如，通过延长的强烈暴露于红外、紫外或电离辐射造成的辐射损伤)或通过自发形成的损伤比如皮肤溃疡(例如静脉性溃疡、糖尿病溃疡或压迫性溃疡)、肛裂、口腔溃疡和寻常痤疮。外科移植的组织被视为是伤口。
伤口通常定义为急性的或慢性的。急性伤口是如下伤口：其在止血之后顺序经历三个公认的愈合过程阶段(即炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段)，而不拖延时程。慢性伤口定义为不能愈合的那些或具有过多皮肤损失比如由于烧伤的那些。这种伤口不完成愈合过程的有序顺序的生物化学事件，这是因为伤口停在一个愈合阶段。通常，慢性伤口停在炎症阶段。慢性伤口是患者发病率的主要原因。
根据本发明的具体方面，慢性伤口是在预期的时间量内没有愈合的伤口，例如愈合比预期的长至少5、10、15、20或30天。这可以考虑为在至少30天、至少40天、具体至少50天、更具体至少60天、最具体至少70天内没有愈合的伤口。
也尤其注意的是烧伤伤口。任何烧伤——尤其是严重烧伤——对于受试者的上皮和/或内皮屏障的完整性具有显著影响并且这种创伤的愈合通常是漫长的过程。因此，本发明的方法可视为用于促进烧伤愈合的方法。
典型的致烧伤因素是极端温度(例如火和在极端温度下的液体和气体)、电、腐蚀性化学品、摩擦和辐射。暴露的程度和持续时间连同因素的强度/烈度造成不同严重度的烧伤。烫伤(即与高温液体和/或气体相关联的创伤)被视为烧伤。
在某些实施方式中，伤口是处在针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子不适当的，即过多水平的MMP，例如MMP-2、MMP-8和/或MMP-9活性的风险下的伤口，或针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子存在不适当的，即过多水平的MMP，例如MMP-2、MMP-8和/或MMP-9活性的伤口。在其他实施方式中，伤口是处在不适当的，即过多水平的总体MMP活性的风险下的伤口，或存在不适当的，即过多水平的总体MMP活性的伤口。在其他实施方式中，伤口是处在不适当的，即过多水平的ECM和/或肽生长或分化因子降解的风险下的伤口，或存在不适当的，即过多水平的ECM和/或肽生长或分化因子降解的伤口。一般而言，具有这些特征的伤口可由上述用于测量ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子降解或用于监测针对ECM蛋白质和/或肽生长或分化因子或伤口底物的总体或特定MMP活性的方法而鉴定。
在某些实施方式中，伤口是处在不适当的，即不足水平的伤口组织细胞迁移进入伤口和/或伤口组织细胞的增殖或分化和/或新生组织形成的风险下的伤口，或存在不适当的，即不足水平的伤口组织细胞迁移进入伤口和/或伤口组织细胞的增殖或分化和/或新生组织形成的伤口。
在某些实施方式中，伤口是处在微生物感染——例如本文公开的那些——的风险下的伤口，或包含微生物感染——例如本文公开的那些——的伤口。感染可以是急性的，或可选地是慢性的，例如持续至少5或至少10天，具体地至少20天，更具体地至少30天，最具体地至少40天的感染。
在某些实施方式中，伤口是处在发炎的风险下的伤口，或发炎的伤口，例如包含免疫细胞(例如巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞和/或嗜中性粒细胞)和/或不适当的，即过多水平的促炎标记物(例如本文公开的那些)和/或不适当的，即不足水平的抗炎标记物(例如本文公开的那些)的伤口。
在仍进一步实施方式中，伤口具有两个或更多个或所有上述伤口特征，例如MMP过度活性(尤其针对ECM和生长因子)或过度ECM和生长因子降解和一个或多个其他上述伤口特征，尤其是不足水平的伤口组织细胞迁移进入伤口和/或伤口组织细胞的增殖或分化和/或新生组织形成，以及抗微生物作用和/或抗炎作用。
在仍进一步实施方式中，靶伤口具有(i)MMP过度活性(尤其针对ECM和生长因子)或过度ECM和生长因子降解和一个或多个其他上述伤口特征，尤其是微生物感染和炎症；或(ii)过度炎症和一个或多个其他上述伤口特征，尤其是微生物感染和MMP过度活性(尤其针对ECM和生长因子)或过度ECM和生长因子降解。
受试者可以是任何人或非人动物受试者，但是更具体可以是人或非人脊椎动物，例如选自哺乳动物、鸟、两栖动物、鱼和爬行动物的非人动物。优选哺乳动物受试者。非人动物可以是牲畜或家用动物或具有商业价值的动物，包括实验室动物或动物园或狩猎公园中的动物。所以，代表性非人动物包括狗、猫、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠、马、猪、绵羊、山羊、母牛、小鸡、火鸡、珍珠鸡、鸭子、鹅、鹦鹉、虎皮鹦鹉、鸽子、鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲤科鱼、澳洲肺鱼、石斑鱼、胭脂鱼、琥珀鱼、黄花鱼、南亚野鲮、虾虎鱼、鳕鱼、黑线鳕、海鲈鱼和鲤鱼。因此覆盖本发明的兽医用途。受试者可视为患者。优选地，受试者是人。
根据本发明，“治疗”当关于治疗受试者中的医学病况(例如伤口)或感染时，在本文广义地用于包括任何疗效，即对病况或关于感染的任何有益的作用。因此，不仅仅包括根除或消除病况/感染，或治愈病况/感染的受试者，而且也包括改善受试者的感染/病况。因此包括例如，改善感染/病况的任何症状或征兆，或任何临床上接受的感染/病况的指征(例如伤口尺寸(深度和/或面积)的减小、愈合时间的加速、本文所述的一个或多个伤口作用，或大体上减轻伤口或周围组织的不适或疼痛)。因此，治疗包括例如先前存在的或诊断的感染/病况的根治疗法和姑息疗法，即保守治疗。
如本文使用的，“预防”指任何预防性或防范性作用。因此，其包括例如相对于预防性治疗之前的病况/感染或症状或指征，延迟、限制、减轻或防止病况(例如增加伤口的尺寸或慢性或差的愈合伤口的发展)或感染或病况/感染的出现，或其一个或多个症状或指征。因此，预防明确包括绝对预防病况/感染的发生或发展，或其症状或指征，和任何延迟病况/感染或症状或指征的出现或发展，或降低或限制病况/感染或症状或指征的发展或进展。
具体而言，如本文限定的本发明的组织工程化支架可用作预防性治疗，例如预防伤口感染，或至少使伤口感染的风险最小化，或预防伤口尺寸的增加或差的愈合或慢性伤口的发展，或至少使伤口尺寸的增加或差的愈合或慢性伤口的发展的风险最小化。
将参考下述非限制性实施例进一步描述本发明，其中：
图1显示了对实施例3中的胶原:颗粒ESM支架的压缩测试的结果。
图2显示了实施例7的700-PEG/ESM(30/10)晶胶(cryogel)内侧(A)和其表面(B)的SEM图像。2和20μm之间的相互连接孔是可见的。
实施例
实施例1：100％w/w颗粒ESM的支架
通过酸提取(0.1M HCL)纯化原始ESM薄片并且随后水冲洗以将pH恢复至大致中性。然后干燥材料并且具有结块的薄片的外观。
接着，将纯化的ESM材料以2％w/v悬浮在0.5M乙酸中。乙酸将胶原部分溶解并且将ESM水合，这使得更容易产生悬浮液。接着，使用Turrax匀化器以14,000RPM剪切混合物。该剪切导致撕裂和颗粒大小减小，并且产生稳定的悬浮液。接着，将悬浮液倾倒进12cm×12cm托盘并且冷冻干燥。在该过程中，形成冰晶并且接着将ESM浓缩并且在冰滴周围沉淀。接着，在干燥循环中，升华冰晶，使得形成具有开放、连接的孔结构的稳定海绵。
实施例2：80％w/w颗粒ESM和20％w/w胶原的支架
通过酸提取(0.1M HCL)纯化原始ESM薄片并且随后水冲洗以将pH恢复至大致中性。然后干燥材料并且具有结块的薄片的外观。
接着，在2％w/v胶原下，将纯化的ESM材料悬浮在0.5M乙酸的溶液中，以产生80％ESM和20％胶原的相对固体含量。接着，使用Turrax匀化器以14,000RPM剪切混合物。接着，将所得悬浮液倾倒进12cm×12cm托盘并且冷冻干燥，使得形成80％w/w颗粒ESM和20％w/w胶原，具有开放、连接的孔结构的稳定海绵。
该海绵比纯ESM海绵更柔韧并且可具有更柔性海绵可能有利的应用，例如应用于具有复杂表面轮廓的较大伤口中。
实施例3：颗粒ESM和胶原以及颗粒ESM和明胶的支架
通过冷冻干燥作为ESM载体的胶原和明胶产生支架，在冷冻干燥之前其以不同的重量比(1:1‐1:3胶原:ESM，10:3明胶:ESM)添加至蛋白溶液。在冷冻干燥之后使用干热处理(105℃，24小时)而交联的支架和没有交联的支架之间进行比较。发现所得到的交联的支架结构稳定，当水合时，压缩模量是206-232Pa。这些性质与形成Intergra’s Dermal Regeneration Template的基础的基于胶原的海绵的性质类似。
制备胶原-颗粒ESM悬浮液：首先使用叶片研磨机将蛋壳膜研磨成细颗粒。通过添加1或2g胶原至200mL的0.5M乙酸(即0.5或1wt％悬浮液)制备胶原悬浮液。使用上方的掺混机(设定3,UltraTurrax,IKAWorks)在冷却(7℃)的反应容器中混合这些悬浮液。然后将ESM粉末(2-12g，即0.5-6wt％)添加至悬浮液，并且混合进一步15分钟。
制备明胶-颗粒ESM悬浮液：如上描述制备蛋壳膜。通过添加20g明胶至200mL的0.5M乙酸(10wt％悬浮液)制备明胶悬浮液，其在热板上被加热至40℃并且使用磁力搅拌器搅拌20分钟。然后将ESM粉末(6g，3wt％)添加至悬浮液并且混合进一步15分钟。
冷冻干燥：将4、7.5和15mL的胶原-ESM悬浮液/明胶-ESM悬浮液吸取至61x61mm不锈钢模具(产生高度大约1、2和4mm的支架)。然后将模具放置在冷冻干燥器(Genesis,VirTis)中并且通过冷却以1℃/分钟从20℃冷冻至‐40℃，并且保持在该温度下1小时。在此之后，使温度增加至0℃，并且抽(pull)200m托真空(0.266mbar)以使样品干燥17小时。然后在打开冷冻干燥室之前使架子升温至20℃以防止湿气在支架之上冷凝。
干热交联：将支架放置在铝箔包中并且抽真空(0.05bar)。然后使温度增加至105℃并且保持24小时，然后冷却至室温。
机械测试：使用皮革打孔器从冷冻干燥的片材将9.5mm直径样品钻孔(core)。然后将这些样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中水合1小时。然后使用配备5-N负载元件的机械试验机(Z050,Zwick/Roell，德国)进行无侧限压缩测试。用不可渗透的、未润滑的压板进行测试。以10％/分钟的应变速率进行测试。模量被限定为在2-5％应变内线性拟合为应力-应变曲线的斜率，避免了应力-应变曲线的较不刚性的脚趾区域(toe region)。
从接种的胶原-ESM支架细胞迁移：将3T3成纤维细胞系细胞(初始细胞密度：25,000个细胞/cm2，培养基：DMEM+10％FBS+Pen/Strep)施加至胶原-ESM支架的顶部，并且在第1天和第7天用核特异性荧光探针染色。荧光显微镜(Axiotech显微镜；ZEISS)用于在这些时间点在支架上和支架中使细胞可视化。
结果：
胶原-ESM悬浮液的冷冻干燥产生高度均匀的支架，在胶原：ESM重量比的范围中观察到均匀性没有改变。DHT交联处理改善了在磷酸盐缓冲盐水中的水合作用之后的稳定性。
对于1:1和1:3胶原：ESM重量比支架，4mm厚样品的机械测试揭示支架的压缩模量的范围从232‐206kPa。这些值是一致的，用于伤口愈合的商业的基于胶原的海绵的模量，具有大约500kPa的压缩模量。明胶：ESM悬浮液的冷冻干燥产生更脆弱的支架。通过制造条件的改变可以改进明胶：ESM支架的柔韧性。明胶具有优于胶原的成本优势，并且可能更适合于更成本敏感的应用。
在第1天和第7天在支架中和支架上检测到细胞(数据未显示)，指示细胞保留在支架中，而没有迁移出支架。
实施例4：用于EDC交联的方案
1.从冰箱取出EDC瓶并且使其置于室温30分钟，以防止湿气在瓶内冷凝。2.在无菌培养罩中，使用圆形钻孔机(12.7mm直径)切割支架样品并且放置在24孔平板中，每个孔具有1mL PBS，以使支架水合(将支架放置在PBS中皮肤侧朝上)。3.确定样品中胶原的质量。对于12.7mm直径支架，1％的标准胶原浓度给出8mg。4.使用下式计算和测量每克胶原/支架具有6mmol EDC所需要的EDC的量：EDC(g)＝胶原的重量(g)×0.006mol EDC/g胶原×191.7g EDC/mol EDC。5.计算和测量5:2摩尔比的EDC:NHS的N‐羟基琥珀酰亚胺(NHS)。6.在50mL离心管中每个支架添加2mL ddH2O。7.向管中添加EDC和NHS并且涡流混合。8.在无菌培养罩中，使用注射器滤器无菌过滤EDC/NHS溶液。9.向24孔平板的新孔中添加2mL EDC溶液。10.将支架从PBS转移至EDAC溶液中并且在室温下孵育2小时。11.在PBS孔中漂洗支架并且转移至50mL管。12.向容器添加25-30mL的PBS。13.在定轨振荡器中以30rpm在室温下孵育30分钟。14.更换PBS并且重复漂洗步骤另外30分钟。15。立即使用或存储容器在冰箱(4℃)中持续上至1周。
实施例5：用于消毒和细胞接种的方案
1.将支架放置在包含70％乙醇的50mL管中(每管10-15个支架)。将管牢固地放置在定轨摇杆中，并且轻轻摇动(30rpm)它们1小时。改变管中的乙醇并且重复该步骤一次。2.将包含支架的管放置在无菌培养罩中并且再一次更换乙醇溶液。给管加帽，并且在定轨摇杆中轻轻摇动另外1小时。支架现在是无菌的，并且可在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中水合。3.将包含支架的管放入无菌培养罩中并且用PBS更换乙醇溶液，加帽并且摇动10分钟。为了确保从水凝胶中完全去除乙醇，在无菌PBS中冲洗它们总共3次。4.将支架放入无菌6孔平板中(1‐3个支架/孔)。5.制备107个细胞/mL溶液。用100μL接种支架的顶面并且静置20分钟。该接种密度是为4mm厚的12.7mm直径样品优化的。6.轻弹支架并且用100μL接种底面，并且在培养箱中静置20分钟(总共2×106个细胞/支架)。7.向每个孔中添加5mL的培养基。
实施例6：PVA/ESM支架-冻干PVA/ESM悬浮液
将75ml的10％w/v医药级聚乙烯醇(PVA)(7.5g)与3.75g的<100μm的HCl-冲洗的ESM颗粒(pH 4.8)混合。将该混合物放入模具中并且如上述冷冻干燥。
PVA/ESM混合物的冷冻干燥产生具有封闭孔结构的软垫。
实施例7：通过冷冻消融制备的PEG/ESM支架
如表1中描述，组合不同浓度的700-聚乙二醇-二丙烯酸酯(700-PEG-DA)、<100μm的HCl-冲洗的ESM颗粒(pH 4.8)和光引发剂LAP(苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)次膦酸锂)溶液。在不同直径的硅模具中-20℃下冷冻混合物3至24小时。冷冻之后，立即在室温下，在365nm下UV照射样品5至15分钟，由此PEG-DA大胞球的甲基丙烯酸化的末端基团交联。使冰晶融化并且用蒸馏水冲洗晶胶数次以及在真空中干燥过夜。结果显示在表1中。
表1：用不同浓度的700-PEG-DA、ESM和LAP制备的不同晶胶。
包含10％w/v ESM的水中20至30％w/v 700-PEG-DA的混合物(源自分别包括33％ESM和67％PEG w/w的支架或包括25％ESM和75％PEG w/w的支架的混合物)似乎更利于作为深伤口的护理支架，这是因为它们是稳定的、柔性样泡沫橡胶并且ESM颗粒均匀分布在样品中。支架中较低量的颗粒ESM产生支架中不均匀分布的颗粒。图2显示具有2和20μm之间相互连接孔的700-PEG/ESM(30/10)晶胶的SEM图像。因为使用的ESM颗粒大小的范围是10至100μm，因此它们有时与晶胶孔重叠。
测试上面制备的PEG/ESM支架和游离颗粒ESM造成的粘附3T3细胞中的细胞毒性。将3T3细胞(初始细胞密度：25,000个细胞/cm2，培养基：DMEM+10％FBS+Pen/Strep)小心滴在样品上。第1和4天之后，小心地去除去除培养基并且由Live/Dead染色溶液(30μg/ml荧光素二乙酸(FDA)，PBS中的2×GelRed)取代。通过来自ZEISS的Axiotech显微镜拍摄荧光染色。
在治疗组中都没有可见的死细胞(数据未显示)，这显示PEG/ESM支架对于3T3细胞不是细胞毒性的。