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1、(10)申请公布号 CN 103933613 A (43)申请公布日 2014.07.23 CN 103933613 A (21)申请号 201310021352.0 (22)申请日 2013.01.18 A61L 27/38(2006.01) A61L 27/22(2006.01) (71)申请人 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 地址 200031 上海市汾阳路 83 号 (72)发明人 倪玉苏 江毅 文建川 陈新 邵正中 于慧前 孙珊 李雯 李华伟 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人 吴桂琴 (54) 发明名称 一种丝素软骨复合体义耳及其。
2、制备方法 (57) 摘要 本发明属组织工程和医用材料领域， 具体涉 及一种丝素软骨复合体义耳及其制备方法和在耳 廓再造中应用。本发明采用丝素软骨复合体作为 支撑材料， 以丝素蛋白为涂层， 制成丝素软骨复合 体义耳。本发明的丝素软骨复合体义耳可进一步 用于在小耳畸形的耳廓再造。本发明利用丝素的 良好生物相容性和促进成细胞生长的作用， 能避 免自体取肋骨的伤害， 减少并发症， 又可以长期或 永久有效存活， 本发明丝的素软骨复合体义耳解 决了在耳廓再造方面其他生物材料造成的排斥问 题， 同时可以避免自体取肋骨造成的损伤， 为临床 耳廓再造及应用提供有意义的参考。 (51)Int.Cl. 权利要求书 。
3、1 页 说明书 5 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图7页 (10)申请公布号 CN 103933613 A CN 103933613 A 1/1 页 2 1. 一种丝素软骨复合体义耳， 其特征在于， 采用丝素复合物作支撑材料， 以软骨细胞作 为外层， 制成丝素软骨复合体义耳， 所述的丝素蛋白重量 / 体积浓度为 6-20。 2.按权利要求1所述的丝素软骨复合体义耳， 其特征在于， 所述的丝素蛋白重量/体积 浓度为 6-12。 3.按权利要求1所述的丝素软骨复合体义耳， 其特征在于， 所述的丝素蛋白重量/体积 浓度为 。
4、10。 4. 按权利要求 1 所述的丝素软骨复合体义耳， 其特征在于， 所述的丝素软骨复合体义 耳是正常耳廓结构。 5. 权利要求 1 所述的丝素软骨复合体义耳的制备方法， 其特征在于， 其包括步骤 ： 1) 制备丝素蛋白 采用废桑蚕生丝在NaHCO3水溶液中脱胶， 将脱胶丝溶于LiBr水溶液中， 溶解， 过滤， 除 去杂质， 得丝素蛋白盐溶液， 用去离子水透析除去溶液中的 LiBr， 得丝蛋白， 再浓缩， PEG 透 析， 丝素蛋白溶液离心去除杂质， 留上清液， 得重量 / 体积浓度为 6-20的丝素蛋白 ； 2) 制备丝素蛋白支架 用制得的丝素蛋白溶液与正丁醇混合， 搅拌后， 放入 -20。
5、冰箱 24 小时， 室温条件下， 制得丝素蛋白多孔支架 ； 去离子水清洗去除残存正丁醇， 制得不同孔径尺寸的多孔丝素蛋 白多孔支架 ； 3) 软骨细胞分离和细胞培养 采用获得的无菌成年雄性 SD 大鼠关节软骨， 先后采用胰蛋白酶 EDTA 消化 (GIBCO， 0.25 trypsin)， 用 II 型胶原酶消化后， 过滤， 离心， 重悬细胞， 最后接种于悬浮瓶中培养， 隔天换液 ； 4) 软骨细胞增殖和转染 传代软骨细胞进行慢病毒转染 ； 5) 丝素蛋白膜和软骨细胞体外培养 转染后， 软骨细胞进行培养和传代， 然后种植在多孔丝素蛋白上， 将丝素蛋白膜与软骨 细胞体外培养 4 周 ； 制得丝素。
6、软骨复合体义耳材料。 6.按权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所属步骤1)的NaHCO3为0.5wt； 所述LiBr 水溶液为 9.3mol/L。 7. 按权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 所属步骤 2) 的丝素蛋白溶液与正丁醇以 1 1 混合。 8. 按权利要求 5 所述的方法， 其特征在于， 所属步骤 3) 的悬浮瓶中培养成分含有高糖 DMEM+15胎牛血清。 9. 权利要求 1 所述的丝素软骨复合体义耳在制备小耳畸形的耳廓再造材料中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103933613 A 2 1/5 页 3 一种丝素软骨复合体义耳及其制备方法 技术领域 0001 本发明属组。
7、织工程和医用材料领域， 具体涉及一种丝素软骨复合体义耳及其制备 方法和在耳廓再造中应用。 背景技术 0002 研究显示， 先天性小耳畸形是较为常见的头面部畸形， 据统计， 其发病率为 0.4 5.5/10000， 其临床主要表现为外耳形态改变， 外耳的基本结构消失或部分消失， 仅有残余 耳软骨及部分耳垂， 甚至没有上述结构， 而且常伴有外耳道闭锁、 中耳畸形和颌面部畸形等 症状。耳廓的畸形或缺少严重影响患者的容貌和心理健康。面对小耳畸形造成的压力， 很 多患者不能较好的适应社会， 研究显示， 小耳畸形患者的心理问题检出率明显高于健康正 常人， 因此， 治疗小耳畸形的首选方案是进行早期治疗。目前。
8、， 较好的治疗先天性小耳畸形 的方法是耳再造术。耳郭具有复杂的三维解剖结构， 理想的耳再造需再现出清晰的耳郭三 维立体结构， 因此耳再造术成为面部整形外科最困难和最富挑战性的手术之一。 0003 耳支架的选取在耳廓再造术中起着至关重要的作用。自 1920 年 Gilliesz 开创全 耳再造以来， 先后有多种组织材料充当耳支架， 如金属支架、 硅橡胶支架、 聚四氟乙烯支架、 同种异体肋软骨、 异种软骨、 自体软骨、 骨以及人造组织代用品等。就目前来看， 硅橡胶支 架、 金属支架因为覆盖组织薄， 易出现排斥反应等弊端， 已经被淘汰 ； 聚四氟乙烯支架较柔 软， 仅适合于部分耳缺损少的病例 ； 同。
9、种异体肋软骨易吸收变形， 致使手术成功率降低， 异 种肋软骨更易导致手术失败 ； 自体肋软骨仍是目前应用最广泛、 最为安全的支架材料， 但存 在取材痛苦， 并发症多等弊端。因此选用更合适的耳廓支架进行耳廓再造是尤为需要的。 0004 在众多的生物材料中， 丝素有良好的生物相容性， 无毒， 无刺激性， 在生物医用领 域得到了日益广泛的应用， 如医用丝素皮肤再生膜、 隐形眼镜、 细胞培养基及人工脑膜的实 验研究等等。但迄今为止， 国内外尚无丝素在耳廓再造方面应用的报道。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种丝素软骨复合体及其在耳廓再造中的应用， 尤其涉及提 供一种丝素软骨复合体义耳及其制备方。
10、法 ； 进一步的， 提供丝素蛋白复合体义耳在临床耳 廓再造中的应用。 0006 本发明采用丝素软骨复合体作为支撑材料， 以丝素蛋白为涂层， 制成丝素软骨复 合体义耳。本发明利用丝素的良好生物相容性和促进成细胞生长的作用， 能避免自体取肋 骨的伤害， 减少并发症， 又可以长期或永久有效存活。 0007 本发明丝素软骨复合体可用作临床小耳畸形耳廓再造， 能为探讨丝素软骨复合体 在临床重建耳廓提供有意义的参考。 0008 更具体的， 本发明的一种丝素软骨复合体义耳， 其特征在于， 采用丝素复合物作支 撑材料， 以软骨细胞作为外层， 制成丝素软骨复合体义耳， 所述的丝素蛋白重量 / 体积浓度 为 6-。
11、20； 本发明的实施例中， 优选所述的丝素蛋白重量 / 体积浓度为 6-12， 更优选的丝 说 明 书 CN 103933613 A 3 2/5 页 4 素蛋白重量 / 体积浓度为 10。 0009 本发明中， 所述的丝素软骨复合体义耳制成正常耳廓结构。 0010 本发明的丝素软骨复合体义耳通过下述方法制备， 其包括步骤 ： 0011 1) 制备丝素蛋白 0012 采用废桑蚕生丝在 NaHCO3 水溶液中脱胶， 将脱胶丝溶于 LiBr 水溶液中， 溶解， 过 滤， 除去杂质， 得丝素蛋白盐溶液， 用去离子水透析除去溶液中的 LiBr， 得丝蛋白， 再浓缩， PEG透析， 丝素蛋白溶液离心去除杂。
12、质， 留上清液， 得重量/体积浓度为6-20的丝素蛋白， 本发明的实施例中优选所述的丝素蛋白重量 / 体积浓度为 6-12， 更优选的丝素蛋白重量 / 体积浓度为 10 ； 0013 2) 制备丝素蛋白支架 0014 用制得的丝素蛋白溶液与正丁醇混合， 搅拌后， 放入 -20冰箱 24 小时， 室温条件 下， 制得丝素蛋白多孔支架 ； 去离子水清洗去除残存正丁醇， 制得不同孔径尺寸的多孔丝素 蛋白多孔支架 ； 0015 3) 软骨细胞分离和细胞培养 0016 采用获得的无菌成年雄性 SD 大鼠关节软骨 ( 由复旦大学动物实验中心提供 )， 先 后采用胰蛋白酶 EDTA 消化 (GIBCO， 0。
13、.25 trypsin)， 用 II 型胶原酶消化后， 过滤， 离心， 重 悬细胞， 最后接种于悬浮瓶中培养 (GIBCO， 高糖 DMEM+15胎牛血清 )， 隔天换液 ； 0017 4) 软骨细胞增殖和转染 0018 传 代 软 骨 细 胞 进 行 慢 病 毒 转 染 (6enechem 公 司，效 价 ： 2E+8TU/ml， pGC-FU-GFP-3FLAG) ； 0019 5) 丝素蛋白膜和软骨细胞体外培养 0020 转染后， 软骨细胞进行培养和传代， 然后种植在多孔丝素蛋白上， 将丝素蛋白膜与 软骨细胞体外培养 4 周 ； 制得丝素软骨复合体义耳材料。 0021 经检测， 结果显示。
14、 ： 0022 1) 软骨细胞形态学特点 0023 关节软骨消化后， 获得的软骨细胞在悬浮培养瓶中培养， 6 小时后， 部分细胞附着 ； 24 小时后， 大量细胞附着 ； 5 天后， 细胞间相互接触 ； 平均爬满时间为 7 天 ； 附着软骨细胞的 形态特点是拉伸成伪足多边形形状、 鹅卵石般均匀爬满培养瓶底部(如图2a所示)， 由于软 骨细胞内具有 II 型胶原蛋白， 因此在特定的折射率材料中能被观察到 ( 如图 2b 所示 ) ； 0024 通常情况下， 根据细胞质内的 II 型胶原蛋白蛋白抗原特点， 通过免疫荧光组织化 学检测可检测到细胞质内的 II 型胶原蛋白蛋白 ( 红色荧光标记 II 。
15、型胶原蛋白， 如图 3 所 示 )， 通过甲苯胺蓝染色， 细胞浆也可着色 ( 蓝色 )， 此即 II 类型胶原着色 ( 如图 4 所示 ) ； 0025 2) 检测转染效率 0026 收集两种转染细胞， 即 80000 细胞在 24 孔板， 或者 300000 细胞在 6 孔板中， 72 小 时后利用 GFP( 绿色荧光蛋白 ) 检测转染情况， 荧光倒置显微镜观察 GFP 表达情况， 所述的 GFP 代表细胞在不同浓度的慢病毒中的转染效率 ( 如图 5 所示 ) ； 0027 3) 免疫荧光组织化学分析丝素软骨复合体生物材料 0028 选用免疫荧光组织化学分析丝素软骨复合体生物材料， 细胞表面。
16、均匀分布在丝素 支架上， 软骨细胞优先种植在丝素支架的表面区域， 然后才是中心区域 ( 如图 6 所示 )， 4 周 说 明 书 CN 103933613 A 4 3/5 页 5 后， 支架的毛孔内布满结缔组织及细胞外基质 (ECM)， 经免疫荧光组织化学分析表明， II 型 胶原蛋白在各组均有表示， GFP 表达于部分软骨细胞 ( 图 7 显示了软骨细胞与周围组织联 系紧密 )， 大量的软骨细胞渗透并存活于丝素材料中 ( 如图 7A， B， C， D 所示 ) ； 0029 4) 激光共聚焦显微镜检测丝素软骨复合体材料 0030 激光共聚焦显微镜立体显示生物材料复合体， 即丝素软骨复合体， 。
17、细胞表面均匀 分布在丝素支架上， 软骨细胞优先种植在丝素支架的表面区域， 然后才是中心区域 ( 如图 6 所示 )， 4 周后， 支架的毛孔内布满结缔组织及细胞外基质 (ECM)， GFP 表达于部分软骨细胞 ( 如图 8， 9 所示 )， 不同的激光共聚焦可以部分显示软骨细胞附着与丝素支架上 ( 如图 10 所示 )。 0031 本发明的丝素软骨复合体义耳材料经检测， 结果显示， 软骨细胞可以在丝素支架 上附着、 生长， 其中， 丝素表面生长的软骨细胞优先种植在丝素支架的表面区域， 然后才是 中心区域， 且具有一定的极性、 层次和厚度， 但是在不同部位和不同面积的丝素表面厚度完 全不同。 0。
18、032 本发明采用丝素复合体义耳材料作为支撑材料， 既可以利用丝素的良好生物相容 性和促进细胞生长的作用， 能避免自体取肋骨的伤害， 减少并发症， 又可以长期或永久有效 存活。 0033 本发明的丝素软骨复合体义耳可进一步用于在小耳畸形的耳廓再造。 0034 本发明采用丝素软骨复合体义耳用于耳廓再造， 解决了在耳廓再造方面其他生物 材料造成的排斥问题， 同时可以避免自体取肋骨造成的损伤 ； 其中的丝素尤其具有如下优 点 ： 可以促进上皮爬行， 避免术后植入体排除， 预期可获得满意的效果， 具有理想气管替代 物的五个标准， 包括 ： 具有高度生物相容性的合成材料 ； 血管适宜在移植物内生长 ； 。
19、具上皮 组织或适宜于上皮组织生长 ； 有充分的长度以满足不同程度的缺损修复 ； 具有足够硬度以 对抗负压。 0035 为了便于理解， 以下将通过具体的附图和实施例对本发明的一种丝素软骨复合体 义耳及其制备方法进行详细地描述。 需要特别指出的是， 具体实例和附图仅是为了说明， 显 然本领域的普通技术人员可以根据本文说明， 在本发明的范围内对本发明做出各种各样的 修正和改变， 这些修正和改变也纳入本发明的范围内。 附图说明 0036 图 1 ： 不同孔隙大小的多孔丝素膜， 0037 其中的 A， B， C， D， 分别显示不同孔隙大小的多孔丝素膜， 标度为 100m。 0038 图 2 ： 显示了。
20、经过 7 天的培养， 软骨细胞在培养瓶中形成伪多边形的形状， 径向拉 伸， 鹅卵石均匀地分布在底部的 (A， B)， 可以看出在细胞内某些具有折光性的物质 (B)， 荧 光倒置显微照相表明部分软骨细胞表达 GFP(C， D)。 0039 图3 ： 显示了免疫组织化学检测细胞质内II型胶原蛋白表达阳性(荧光标记的II 型胶原蛋白 )， 部分软骨细胞表达 GFP。 0040 图 4 ： 显示了甲苯胺蓝染色， 细胞的细胞质中被染色， 即是 II 型胶原蛋白的着色。 0041 图 5 ： 显示了在多孔丝素膜内的活细胞 GFP 表达。 0042 图 6 ： 免疫组织化学分析显示， 在细胞接种 4 周后，。
21、 软骨细胞上在表面区域比中心 说 明 书 CN 103933613 A 5 4/5 页 6 区域更丰富， DAPI 染色结果显示多孔丝素蛋白支架 ( 在一个不规则的网状浅色 )， 核仁 ( 圆 形或椭圆形， A 图 )， 大多数毛孔都充满了组织， 孔隙内填充细胞外基质， II 型胶原蛋白表达 (C 图 )， 部分的软骨细胞中发现 GFP 的表达 (B 图 )， 图 A， B， C 合并为 D。 0043 图 7 ： 高倍视野观察免疫组织化学分析图像， 0044 DAPI 染色结果显示多孔丝素蛋白支架 ( 在一个不规则的网状浅色 )， 核仁 ( 圆形 或椭圆形， A 图 )， 孔隙内填充细胞外基。
22、质， II 型胶原蛋白表达 (C 图 )， 部分的软骨细胞中发 现 GFP 的表达 (B 图 )， 图 A， B， C 合并为 D。 0045 图 8 ： 激光共聚焦扫描三维成像显示共培养软骨细胞紧紧地与周围组织相连 ( 前 视图 )， 0046 DAPI染色结果显示多孔丝素蛋白支架(不规则的网格状淡色)和核仁(圆形或椭 圆形， A 图 )， 软骨细胞渗透生长入材料中并且存活 ( 图 C， D)， 在丝素支架上所有软骨细胞 表达功能性蛋白 II 型胶原。 0047 图 9 ： 激光共聚焦扫描三维成像显示共培养软骨细胞紧紧地与周围材料组织 ( 丝 素支架 ) 相连 ( 斜侧视图 )。 0048 。
23、图 10 ： 共焦激光扫描部分显示软骨细胞的功能性蛋白 ( 胶原 II 型 ) 的表达， 和与 丝素蛋白细胞支架的关系， 部分软骨细胞中发现 GFP 表达 (B 图 )， 图 A， B， C 合并为 D。 0049 图 11 ： 用人耳廓取模制得的耳廓型丝素义耳。 具体实施方式 0050 实施例 1 0051 1) 制备丝素蛋白 0052 采用废桑蚕生丝在 NaHCO3(0.5wt ) 水溶液中脱胶， 将脱胶丝溶于 9.3mol/L 的 LiBr 水溶液中， 搅拌至蚕丝完全溶解， 过滤， 除去未溶解的蚕丝及杂质， 得丝素蛋白盐溶液， 用去离子水透析除去溶液中的 LiBr， 得浓度为 4的丝蛋白。
24、， 再浓缩， PEG 透析， 所得丝素蛋 白溶液离心去除杂质， 留上清液， 所得的丝素蛋白浓度为 10， 置 4冰箱保存备用 ； 0053 2) 制备丝素蛋白支架 0054 用制得的丝素蛋白溶液与正丁醇 1 1 混合， 搅拌 5 分钟 (25 )， 放入一个 5cm5cm聚苯乙烯磁盘， 然后放入-20冰箱24小时， 室温条件下， 丝素蛋白多孔支架制备 完成 ； 然后用去离子水清洗去除残存正丁醇， 最后丝素蛋白多孔支架被切割成所需的大小 (1cm1cm1mm)， 图 1A， B， C， D 显示了本发明构建的不同孔径尺寸的多孔丝素蛋白膜 ； 0055 3) 软骨细胞分离和细胞培养 0056 采用。
25、成年雄性 SD 大鼠 (200-250 克 )( 由复旦大学动物实验中心提供 )， 常规处理 获得无菌关节软骨， 先用胰蛋白酶 EDTA 消化 30 分钟 (GIBCO， 0.25 trypsin)， 接着用 II 型胶原酶消化 8 小时 (Invitrogen)， 然后过滤， 离心， 重悬细胞， 最后接种于悬浮瓶中培养 (GIBCO， 高糖 DMEM+15胎牛血清 )， 隔天换液 ； 0057 4) 软骨细胞增殖和转染 0058 当软骨细胞爬满瓶底， 添加5毫升PBS， 轻摇， 吸出PBS。 添加2ml胰蛋白酶EDTA， 消 化 5 分钟， 终止消化， 再次接种于悬浮瓶中培养， 传代软骨细胞。
26、进行慢病毒转染 (Genechem 公司， 效价 ： 2E+8TU/ml， pGC-FU-GFP-3FLAG) ； 具体转染方法即用转染 80000 细胞放入 24 孔 说 明 书 CN 103933613 A 6 5/5 页 7 版或 300000 细胞放入 6 孔板， 慢病毒加入高糖有血清培养基培养 24 小时， 72 小时后用 GFP 荧光评价转染效率 ； 0059 5) 丝素蛋白膜和软骨细胞体外培养 0060 转染后， 软骨细胞进行培养和传代， 然后被种植在多孔丝素蛋白上， 将丝素蛋白膜 与软骨细胞体外培养 4 周 ； 制得丝素软骨复合体义耳材料。 0061 制得丝素软骨复合体义耳材料。
27、进行检测， 结果显色， 细胞表面均匀分布在丝素支 架上， 软骨细胞优先种植在丝素支架的表面区域， 然后才是中心区域 ( 如图 6 所示 )， 4 周 后， 支架的毛孔内布满结缔组织及细胞外基质 (ECM)， 免疫荧光组织化学分析表明， II 型胶 原蛋白在各组均有表示， GFP表达于部分软骨细胞软骨细胞与周围组织联系紧密(如图7所 示 )， 大量的软骨细胞渗透并存活于丝素材料中 ； 进一步， 本发明中使用人耳廓取模制备得 到耳廓型丝素义耳 ( 如图 11 所示 )。 说 明 书 CN 103933613 A 7 1/7 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103933613 A 8 2/7 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 103933613 A 9 3/7 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103933613 A 10 4/7 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 103933613 A 11 5/7 页 12 图 7 说 明 书 附 图 CN 103933613 A 12 6/7 页 13 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103933613 A 13 7/7 页 14 图 10 图 11 说 明 书 附 图 CN 103933613 A 14 。