技术领域
本发明涉及一种移植材料及其制备方法，具体涉及一种带软骨的胶原移植 材料及其制备方法。
背景技术
在骨肿瘤、人工关节置换或成形术中，尚无合适的移植材料，因此临床上 对该种类疾病并无理想的治疗方案。合适的移植材料需同时满足两部分要求： 骨支架及活性软骨组织。自体骨移植因来源有限并具有破坏性，难以广泛使用； 异体骨同时为抗原，移植后引起体内免疫反应，虽经各种方法处理，如射线照 射、冻干保存、深低温及术后应用免抑制剂等，可在一定程度上减轻排斥反应， 但随着时间的延长，移植关节均出现退行性变，甚至关节结构完全破坏而失去 功能。
软骨组织损伤后极难自行修复，组织工程软骨移植是目前治疗软骨缺损的 全新技术，但仍存在需要解决修复组织与正常软骨边界的整合、形成由软骨细 胞与支架材料复合生成的新生软骨组织并具备功能、以及对机械承重的耐受能 力等问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种带软骨的胶原 移植材料及其制备方法，该移植材料以骨胶原构成其支架且带有活性软骨组织， 既可促进新生软骨形成又利于骨组织生成。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种带软骨的胶原移植材料 的制备方法，包括以下步骤：
(1)取骨关节，用组织包埋介质封闭骨关节的关节软骨；
(2)将经步骤(1)处理的骨关节置于质量百分比浓度为8～12％的甲酸中，于 4～8℃浸泡3～4天，冲洗浸泡后的骨关节；
(3)去除组织包埋介质，清洗关节软骨，得到带软骨的胶原移植材料。
本发明带软骨的胶原移植材料的制备均在无菌条件下进行，制备过程中， 步骤(1)仅用组织包埋介质封闭骨关节的关节软骨，以保护软骨组织，使其保 持活性；骨关节的骨头部分外露不予保护。本发明步骤(2)中将骨关节置于甲 酸中，需使骨质完全软化；冲洗浸泡后的骨关节主要是为了去除甲酸以及软化 后骨关节骨髓腔中的杂质，降低移植材料的抗原性，消除免疫反应。本发明步 骤(3)中，去除组织包埋介质的方法为：轻轻剥离保护软骨的封闭介质。
按照本发明上述方法制备得到的带软骨的胶原移植材料，其骨质只保留胶 原成分，并暴露出凹凸不平的天然孔隙结构，有利于移植后骨髓基质细胞的迁 入与各种促生长因子的渗透，故利于骨组织生成。同时，所述带软骨的胶原移 植材料还带有活性软骨组织，可促进新生软骨形成。
作为本发明所述带软骨的胶原移植材料的制备方法的优选实施方式，所述 骨关节为兔桡骨近端骨关节。作为本发明所述带软骨的胶原移植材料的制备方 法的更优选实施方式，所述兔桡骨近端骨关节的长度为1.8～2.2厘米。
作为本发明所述带软骨的胶原移植材料的制备方法的优选实施方式，所述 组织包埋介质(Tissue Embedding Medium)含有石蜡成分(美国McCormick公司 产品)。
作为本发明所述带软骨的胶原移植材料的制备方法的优选实施方式，所述 步骤(1)中，用组织包埋介质封闭骨关节的关节软骨的方法为：加热组织包埋 介质至其熔化，将骨关节的带软骨一端浸入组织包埋介质中后迅速取出，自然 冷却凝固关节软骨表面的组织包埋介质以封闭关节软骨。
作为本发明所述带软骨的胶原移植材料的制备方法的优选实施方式，所述 步骤(2)中冲洗浸泡后的骨关节和所述步骤(3)中清洗关节软骨所使用的溶 液为磷酸盐缓冲溶液或生理盐水。更优选地，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为 7.4。
本发明还提供了一种带软骨的胶原移植材料，该移植材料以骨胶原构成其 支架，且带有活性软骨组织。
本发明的有益效果为：本发明方法制备得到的带软骨的胶原移植材料，其 包含构成移植材料支架的骨胶原成分，该骨胶原支架具有凹凸不平的天然孔隙 结构，有利于移植后骨髓基质细胞的迁入与各种促生长因子的渗透，从而利于 骨组织生成；同时，该移植材料还带有活性软骨组织，可促进新生软骨形成。
附图说明
图1a为本发明所述带软骨的胶原移植材料的结构外观图；
图1b为本发明所述带软骨的胶原移植材料中软骨组织的扫描电镜图；
图1c为本发明所述带软骨的胶原移植材料中骨胶原支架的扫描电镜图；
图2a为本发明所述带软骨的胶原移植材料中骨胶原支架的激光扫描共聚焦 显微镜立体扫描图；
图2b为本发明所述带软骨的胶原移植材料中软骨组织的激光扫描共聚焦显 微镜立体扫描图；
图3a为正常兔桡骨关节的X线影像结果图；
图3b为本发明实施例5所述实验组新西兰大白兔植入带软骨的胶原移植材 料16周后的X线影像结果图；
图3c为本发明实施例5中，术后第16周所述对照组新西兰大白兔的X线 影像结果图；
图4a为本发明实施例5中，术后第16周观察植入带软骨的胶原移植材料 的新西兰大白兔骨关节缺损处组织生长情况的大体图；
图4b为本发明实施例5中，术后第16周，观察对照组新西兰大白兔骨关 节缺损处组织生长情况的大体图；
图5a为正常兔桡骨关节Safranin O染色分析的结果图；
图5b为本发明实施例5中，术后第16周，植入带软骨的胶原移植材料的 新西兰大白兔骨关节Safranin O染色分析的结果图；
图5c为本发明实施例5中，术后第16周，对照组新西兰大白兔骨关节 Safranin O染色分析的结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实 施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中，成年兔桡骨近端骨关节的制备方法为：(1)实验动物：从 广东省医用实验动物中心购得体重为2.5-3kg的普通级新西兰大白兔；(2)动物 麻醉：按照每千克大白兔予以0.5mL戊巴比妥钠麻醉剂的比例予以新西兰大白 兔浓度为3％的戊巴比妥钠进行静脉注射麻醉(该戊巴比妥钠麻醉剂用生理盐水 配制)，另予以0.5mL速眠新注射液肌注辅助麻醉；(3)骨关节取材：选择前臂 外侧纵切口，从肘关节延伸至前臂中段，长约3-4cm，逐层切开皮肤、皮下组织、 浅筋膜，将肘关节关节囊桡侧纵切0.5cm左右，暴露桡骨近端约2cm，将桡骨 近端1.8～2.2cm锯下,取出骨关节；(4)将取出的桡骨近端骨关节上附着的骨膜、 肌肉及肌腱等软组织清理干净，得到成年兔桡骨近端骨关节。
实施例中，制备带软骨的胶原移植材料时，骨关节置于质量百分比浓度为 8～12％的甲酸中3～4天，以致骨质完全软化；并且，下述带软骨的胶原移植材料 的制备过程均在无菌条件下进行，制得的带软骨的胶原移植材料贮存于4℃冰箱 中备用。
实施例中，所述组织包埋介质(Tissue Embedding Medium)含有石蜡成分(美 国McCormick公司产品)，其商品名为PARAPLAST。
实施例1
本发明带软骨的胶原移植材料及其制备方法的一种实施例，本实施例所述 带软骨的胶原移植材料采用下述方法制备而成：
(1)取1.8～2.2厘米长的成年兔桡骨近端骨关节，用pH值为7.4的磷酸盐 缓冲溶液将其清洗干净；然后，加热组织包埋介质至熔化(加热温度为56℃左 右)，将成年兔桡骨近端骨关节的关节软骨快速浸入组织包埋介质中后立即取 出，自然冷却凝固关节软骨表面的组织包埋介质以封闭关节软骨；
(2)将经步骤(1)处理的骨关节置于质量百分比浓度为8～12％的甲酸中， 于4～8℃浸泡3～4天直至骨质完全软化，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液冲洗 浸泡后的骨关节；
(3)轻轻剥离封闭关节软骨的组织包埋介质，用pH值为7.4的磷酸盐缓 冲溶液充分清洗，得到带软骨的胶原移植材料。
实施例2
本发明带软骨的胶原移植材料及其制备方法的一种实施例，本实施例所述 带软骨的胶原移植材料采用下述方法制备而成：
(1)取1.8～2.2厘米长的成年兔桡骨近端骨关节，用生理盐水将其清洗干 净；然后，加热组织包埋介质至熔化(加热温度为56℃左右)，将成年兔桡骨近 端骨关节的关节软骨快速浸入组织包埋介质中后立即取出，自然冷却凝固关节 软骨表面的组织包埋介质以封闭关节软骨；
(2)将经步骤(1)处理的骨关节置于质量百分比浓度为8～12％的甲酸中， 于4～8℃浸泡3～4天直至骨质完全软化，用生理盐水冲洗浸泡后的骨关节；
(3)轻轻剥离封闭关节软骨的组织包埋介质(即去除组织包埋介质)，用 PBS清洗关节软骨，得到带软骨的胶原移植材料。
实施例3
为了考察本发明带软骨的胶原移植材料的结构，我们将制得的带软骨的胶 原移植材料表面进行喷铂金处理，然后置于扫描电子显微镜下观察其软骨组织 和骨胶原支架的表面结构。本发明带软骨的胶原移植材料的结构外观如图1a所 示(图1a中的方框内所示为需要封闭保护的关节软骨部分)，其软骨组织的超 微结构见图1b，其骨胶原支架的超微结构见图1c。
结果表明，本发明带软骨的胶原移植材料的骨胶原支架具有凹凸不平的天 然空隙(具体见图1c)。
实施例4
为了证明本发明带软骨的胶原移植材料软骨组织的活性，我们通过吖碇橙 (Acridine Orange,AO)标记分析带软骨的胶原移植材料中的组织细胞 DNA/RNA的表达。
测定时，先将移植材料纵切，加入0.01％吖碇橙浸泡染色10min，再用PBS 洗涤，然后于激光扫描共聚焦显微镜(Confocal Laser Scaning Microscope,CLSM) (Zeiss LSM 510META system)下观察组织细胞形态标记情况。实验过程中， 控制图像采集的参数各组为同一条件，通过单通道荧光检测骨胶原支架，图像 采集所用激发波长为DNA 488nm、发射波长为DNA 520nm，在低倍镜下(× 35)观察骨胶原材料孔径及大体结构；软骨组织通过双通道荧光检测，从而观 察被保护的软骨组织细胞DNA/RNA的表达，图像采集所用激发波长分别为 DNA 488nm、RNA 453nm，发射波长分别为DNA 520nm、RA 615nm。实验 结果如图2a和图2b所示，其中，图2a为本发明带软骨的胶原移植材料中骨胶 原支架的激光扫描共聚焦显微镜立体扫描图；图2b为本发明带软骨的胶原移植 材料中软骨组织的激光扫描共聚焦显微镜立体扫描图。
由图2a可知，本发明带软骨的胶原移植材料的骨胶原材料具有正常骨小梁 组织的孔径，表层关节软骨排列整齐(箭头所示)；由图2b可见，箭头所示受 保护的表层关节软骨的软骨组织呈放射状排列，呈现特异性的DNA(绿色)/RNA (红色)标记，证实软骨层为具备活性的软骨组织(×70)。
实施例5
我们通过动物实验考察了本发明的带软骨的胶原移植材料在带关节的骨移 植中的应用，考察的方法如下：
(1)实验动物：从广东省医用实验动物中心购得体重为2.5-3kg的普通级 新西兰大白兔；
(2)动物麻醉：按照每千克大白兔予以0.5mL戊巴比妥钠麻醉剂的比例予 以新西兰大白兔浓度为3％的戊巴比妥钠进行静脉注射麻醉(该戊巴比妥钠麻醉 剂用生理盐水配制)，同时予以0.5mL速眠新注射液肌注辅助麻醉；
(3)动物模型建立：选择前臂外侧纵切口，从肘关节延伸至前臂中段，长 约3-4cm，逐层切开皮肤、皮下组织、浅筋膜，将肘关节关节囊桡侧纵切0.5cm 左右，暴露桡骨近端约2cm，将桡骨近端1.8～2.2cm锯下,取出骨关节；
(4)移植手术：将本发明的带软骨的胶原移植材料按其正常解剖关系植入 新西兰大白兔骨关节缺损处，移植材料用近端预弯成环的1#克氏针作内固定， 其弧度按正常桡骨弧度预弯，远端经骨髓腔至桡骨远端干骺端松质骨内；然后 冲洗伤口，按其正常的解剖关系逐层缝合关节囊、深筋膜、皮下及皮肤，最后 消毒包扎，肌注40万IU青霉素注射液，分笼饲养；经所述移植处理的新西兰 大白兔为实验组，同时，我们将未经移植处理的新西兰大白兔作为对照组，对 照组在缺损处不植入本发明的带软骨的胶原移植材料，不放置克氏针，其余处 理方法与实验组相同。我们每隔两周采用X线观察实验组与对照组新西兰大白 兔的骨关节，并于术后16周对其进行组织学分析，实验结果如下：
(a)X线观察
术后2周，实验组新西兰大白兔移植处未见显影，其周围见大片骨痂生长 并连接宿主骨；术后第4周，其移植处显示出模糊骨影象，骨痂从远端向近端 生长包裹移植骨；术后第8周，移植处明显新生骨生成，初具正常骨关节形态， 截骨面与宿主骨接合处已融合；术后第12-16周，实验组新西兰大白兔移植处的 新生骨关节通过塑形呈现基本正常形态骨关节形态，而对照组新西兰大白兔直 到第16周仍未见新生骨生长。
术后第16周，X线观察实验组与对照组新西兰大白兔骨关节的结果如图3a～ 图3c所示(图中，NC为正常兔桡骨关节，DOAA为移植本发明带软骨的胶原 移植材料后的新生骨关节；UG为不移植骨对照组)；其中，正常兔桡骨关节的 X线影像结果见图3a；实验组新西兰大白兔的X线影像结果见图3b，对照组新 西兰大白兔的X线影像结果见图3c。
实验结果表明：术后第16周，植入本发明带软骨的胶原移植材料的实验组 新西兰大白兔骨关节缺损处出现新生骨关节(见图3b，箭头所示)，通过塑形， 呈现基本正常形态；对照组新西兰大白兔骨关节缺损处未见骨痂生长(见图3c， 箭头所示)，桡骨断端变尖变硬，未见新生骨关节形成。
(b)大体观察及组织学检测
大体观察及组织学检测的步骤如下：
(1)标本处理：静脉注射25％苯巴比妥钠1ml过量麻醉动物行安乐死，标本 采用10％中性福尔马林固定24h后，用10％甲酸脱钙1～2周；
(2)纵切样本，大体观察骨关节缺损处组织生长情况；
(3)组织包埋介质包埋按常规方法，切片5μm备用，作Safranin O特殊染 色检测分析。
术后第16周，观察植入本发明带软骨的胶原移植材料的新西兰大白兔骨关 节缺损处组织生长情况的大体图如图4a所示，观察对照组新西兰大白兔骨关节 缺损处组织生长情况的大体图如图4b所示。图4a表明，实验组新西兰大白兔 原植骨区已经长出新骨，并形成关节软骨层(新生关节软骨层如箭头所示)，类 似正常关节结构；图4b表明，对照组新西兰大白兔原手术区域缺少骨及软骨组 织生成。
术后，Safranin O染色分析的结果为：移植后早期(第2-4周)，实验组新 西兰大白兔仅于骨小梁间出现少量不规则红染；术后8周，其部分关节软骨被 较厚的新生软骨组织替代，新生软骨团块产生大量糖胺多糖，形成大小不等的 团块状红染区域；术后12-16周，团块状红染区域增多，颜色加深，新生软骨组 织继续爬行替代关节软骨，骨小梁继续被吸收塑形，新生骨关节基本形成。
术后第16周，组织学Safranin O染色分析的结果(×50)如图5a-图5c所 示(图中，NC为正常兔桡骨关节，DOAA为移植本发明带软骨的胶原移植材料 后的新生骨关节；UG为不移植骨对照组)，其中，正常兔桡骨关节Safranin O 染色分析的结果见图5a；植入本发明带软骨的胶原移植材料的新西兰大白兔骨 关节Safranin O染色分析的结果见图5b；对照组新西兰大白兔骨关节Safranin O 染色分析的结果见图5c。图5a表明，正常兔桡骨关节，软骨层呈现浓重的红染 现象，有大量糖胺多糖的分泌；软骨下骨为少量、散在和不规则红染的正常结 构；图5b表明，植入本发明带软骨的胶原移植材料16周后，新西兰大白兔骨 小梁中新生软骨细胞团块出现大量的红染现象，提示有大量糖胺多糖的分泌， 新生软骨细胞具备正常生理功能，处于软骨形成与骨重塑阶段；图5c表明，未 进行移植的对照组，骨缺损区内由大量纤肉芽组织不规则红染现象。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。