黄芩查尔酮合酶基因的启动子及其应用 【技术领域】
本发明涉及植物基因工程技术， 提供了用于控制植物中重组基因表达的 DNA 序列 和构建体， 即本发明提供了黄芩查尔酮合酶基因 (CHS) 的启动子序列。背景技术
植物基因工程技术需要使用调控序列用于调节转基因的表达， 调控序列包含启动 子、 强化子等， 这些序列调控了基因的表达， 进而影响蛋白质的生产。
启动子在遗传学中是指一段能使基因进行转录的 DNA 序列。启动子可以被 RNA 聚 合酶辨认， 并开始转录。RNA 聚合酶在进行转录时常需要一些辅助因子参与作用， 称为转录 因子。 转录因子对植物次生代谢的调节是通过与合成基因启动子上相应的顺式作用元件结 合而实现的， 合成基因启动子中均含有转录因子能够识别的顺式作用元件。启动子与转录 因子结合位点是影响真核基因表达的重要调控元件， 这种结合往往受到外界环境的影响。 尽管真核基因的表达在多层次受不同的因子协同调控， 但调控的主要环节在基因的转录水 平。
黄芩 CHS 的 cDNA 序列是已知的 (GeneBank 的登记号为 AB008748)， 但是黄芩 CHS 启动子序列没有公开。
序列的简要描述
SEQ ID No.1 是黄芩的一段 DNA 序列， 包括 CHS 启动子。
SEQ ID No.2 是黄芩的一段 DNA 序列， 包括 CHS 启动子。
SEQ ID No.3 是黄芩的一段 DNA 序列， 包括 CHS 启动子 发明内容 本发明一方面提供了与 CHS 启动子相应的或来源于 CHS 启动子的 DNA 分子。
本发明另一方面提供了 DNA 构建体， 该构建体包含从 5′到 3’ 方向操作性地连接 的： 1) 黄芩 CHS 启动子 ； 2) 目的基因 ； 3)3’ UTR。在优选的实施方式中， CHS 启动子包含 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.3 序列。
编码对 SEQ ID No.1 经添加、 取代、 插入或缺失一个或多个碱基且具有 SEQ ID No.1 功能的 DNA 序列。
本发明另一方面是提供一种转化植物， 该转化植物至少含有一个本发明 DNA 构建 体的植物细胞。
本发明涵盖了所有提供功能性植物启动子的任何 CHS 启动子缺失型突变体， 这种 启动子都属于 “SbCHS 启动子” 。
附图说明
图 1 植物表达载体 pSB 物理图谱。
图 2T0 代转基因烟草的 PCR 分析。M， lib DNA Ladder ； 1-10， 转基因烟草 ； 11， 非转基因烟草为负对照 ； 12， 质粒 p1301 为正对照。
图 3 转基因烟草 GUS 活性分析。 具体实施方式
实施例 1SbCHS 启动子的克隆
根 据 已 知 的 黄 芩 CHS cDNA 序 列 (GeneBank ： AB008748)，设 计 引 物 PC4 ： 5′ -CGCCGTGAAGTTGTCGTTCTCCT-3′， PC5 ： 5′ -CATTGTCGCCGGAGAAGGAGGTA-3′， PC6 ： 5′ -CTCCTCCATTCCATTCCATTCCATACA-3′， 由上海生工生物技术公司合成。以黄芩总 DNA 为模 板， 按照 Genomewalking 试剂盒 (Takara 公司 ) 说明书进行 PCR 扩增获得长度为 490bp 的 CHS 基因的启动子片段， 1％琼脂糖凝胶电泳， 回收纯化后连接到 pGEM-T 载体上， 筛选鉴定 后进行测定， 序列如序列表中 SEQ ID No.1 所示。
利用 Softbarry 软件对 SEQ ID No.1 进行生物信息学分析， 结果预测该序列是一 个植物启动子， 在该序列上发现 3 个调控元件， 分别为 CT-LB、 GA-5、 ERE 2。
实施例 2 植物表达载体的构建
根据 SEQ ID No.1 序列设计引物， 且在 5′端加上 PstI 酶切位点， 3′端加上 BglII 酶切位点， 由上海生工生物技术公司合成引物， 序列如下 ： C1 ： 5′ -CTGCAGCGTCGAGTGATATG AAAAAAGAAGA-3′， C2 ： 5′ -AGATCTTGTCGCCGGAGAAGGAGGTAATTGG-3′。以黄芩总 DNA 为模 板， 按常规方法进行 PCR 扩增获得 502bp 的目的片段， 电泳回收纯化， 连接到 pGEM-T 载体 上， 筛选鉴定后获得 SbCHS-T。
分别用 PstI 和 BglII 双酶切 SbCHS-T 和 p1301 质粒 (GeneBank ： AF234297)， 37℃， 2 小时后用 1.0％琼脂糖凝胶电泳， 分别回收 502bp 和约 10000bp 片段， 纯化后将两个回收 产物用 T4DNA 连接酶连接， 连接体系共 20μL ： T4DNA 连接酶， 1μL ； 10× 连接 buffer， 2μL ； p1301 片段， 3μL ； SbCHS， 14μL。然后按 CaCl2 法转化 DH5α， 进行卡那抗生素筛选， 提取重 组阳性质粒， 用 PstI 和 BglII 双酶切进行重组质粒结构验证， 获得植物表达载体 pSB， 见图 1。
实施例 3 烟草转化和转基因烟草的后代分析
将植物表达载体 pSB 通过农杆菌转化导入烟草。烟草转化采用叶盘法， 转化外植 体取生长于培养基的无菌烟草植株顶部较幼嫩的叶片。共培养三天后， 转至分化培养基进 行见光分化， 约两周以后即可看到愈伤组织产生， 而大部分转化体则可以直接分化出抗性 芽。抗性芽生长至 2 ～ 3cm 时， 转到生根培养基中诱导生根， 约两周后即可生出细嫩小根， 逐渐成苗。成苗后移栽到花盆中。
对 T0 代 转 基 因 烟 草 植 株 进 行 PCR 检 测。 提 取 转 基 因 烟 草 T0 代 再 生 植 株 叶 片 总 DNA，用 GUS 基 因 引 物 (GUS1 ： 5 ′ -GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG-3 ′， GUS2 ： 5′ -GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA-3′ ) 进行 PCR 扩增。反应条件为 ： 94℃变性 30sec， 61℃退 火 1min， 72℃延伸 2min， 30 个循环后， 72℃保温 5min。部分植株的 PCR 检测结果见图 2。转 基因植株扩增出 1.2kb 的目的条带， 而未转化烟草植株则没有相应大小的产物。 PCR 检测结 果表明， 获得转基因阳性株。
实施例 4SbCHS 启动子转录活性分析
将 T1 代转基因烟草种子放在 1/2MS 培养基上萌发， 分别于萌发小苗长至 4 片叶后的 0， 5， 10， 15， 20 天后开始取样， 提取烟草叶片中的总蛋白， 并进行 GUS 活性定量检测。以 非转基因烟草作为对照， 结果表明转基因烟草中的 GUS 活性为 31.4nmol/min/g FW， 显著高 于对照， 说明 SbCHS 具有启动子转录活性， 详见图 3。
烟草中总蛋白提取方法 ： 取 5 克烟草叶片， 加液氮在研钵中碾磨成粉末状， 将 粉 末 转 移 到 一 个 50ml 离 心 管 中， 加 20ml 蛋 白 提 取 液 (50mMNa2CO3， 100mMNaCl， 0.05 ％ Tritonx-100， 0.05 ％ Tween-20， 1uM 亮 异 酶 肽， pH9.5)。 放 置 几 小 时， 充 分 提 取 蛋 白。 4,000rpm， 4℃离心 20 分钟， 取上清。
GUS 活性的定量测定方法 ： 取 100mg 烟草叶片， 加 400μL GUS 蛋白提取缓冲液 (100mg/ml x-Gluc， 400mmol/l 的磷酸钠缓冲液 (pH 7.0)， 5mmol/L 铁氰化钾、 5mmol/L 亚铁 氰化钾和 PH 8.0 的 0.1mol/lEDTA) 在 Eppendorf 管中研磨成匀浆。离心后吸取 10μL 上 清液， 加底物 4-methylumbelliferone-β-D-glucuronide 混匀， 37℃保温 30min 后终止反 应， 用 UARIAN 型荧光分光光度计测定 E365/450 荧光值。GUS 活性以 MU 的纳摩尔数与总蛋 白含量及时间的比值 nmol MU·mg-1protein·min-1 表示。按照考马斯亮兰 G250 法测定 叶片中可溶性蛋白的浓度。
实施例 5SbCHS 启动子调控元件的功能研究 分 别 利 用 引 物 C3 ： 5 ′ -ctgcagCTGAACGGTATCGGGAGC-3 ′、 C4 ： 5′ -ctgcagCTTTGAGTCTACCGTGGCG-3′和 C2 通过 PCR 方法扩增得到 2 个不同长度的黄芩 CHS 基因启动子 5’ 端缺失片段， 命名为缺失启动子 1、 缺失启动子 2。缺失启动子 1 序列如 序列表中 SEQ ID No.2 所示。缺失启动子 2 序列如序列表中 SEQ ID No.3 所示。分别将缺 失启动子 1、 缺失启动子 2 克隆到 p1301 载体位于 GUS 基因的上游的 Pst I/Bgl II 酶切位 点中， 获得系列植物表达载体。 具体方法同实施例 2。 采用叶盘法将含有缺失载体的根癌农 杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 分别转化烟草 (Nicotiana tabacum)， 具体方法同实施 例 3。共获得了 23 个转基因烟草株系。
提取转基因烟草的总蛋白， 并分析 GUS 的活性， 具体方法同实施例 4。结果表明缺 失启动子 2 的转录活性显著高于 SbCHS 启动子， 而缺失启动子 1 的转录活性与 SbCHS 启动 子没有显著差异。详见图 3。
实施例 6SbCHS 启动子的突变
根据 SEQ ID No.1 序列设计突变引物， 且在 5′端加上 PstI 酶切位点， 3′端加上 BglII 酶切位点， 由上海生工生物技术公司合成引物， 序列如下 ： C5 ： 5′ -CTGCAGCGTCGAGTG AAATGAATAAACAAGA-3′， 和 C2 通过 PCR 方法扩增得到 1 个含有 3 个碱基突变的黄芩 CHS 基 因启动子， 命名为突变启动子。 将突变启动子克隆到 p1301 载体位于 GUS 基因的上游的 Pst I/Bgl II 酶切位点中， 获得系列植物表达载体。 具体方法同实施例 2。 采用叶盘法将含有缺 失载体的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 分别转化烟草 (Nicotiana tabacum)， 具体方法同实施例 3。共获得了 6 个转基因烟草株系。提取转基因烟草的总蛋白， 并分析 GUS 的活性， 具体方法同实施例 4。结果表明突变启动子的转录活性与 SbCHS 启动子没有显 著差异。
本发明涉及植物基因工程技术， 提供了用于控制植物中重组基因表达的 DNA 序列 和构建体， 即本发明提供了黄芩查尔酮合酶基因 (CHS) 的启动子序列。背景技术
植物基因工程技术需要使用调控序列用于调节转基因的表达， 调控序列包含启动 子、 强化子等， 这些序列调控了基因的表达， 进而影响蛋白质的生产。
启动子在遗传学中是指一段能使基因进行转录的 DNA 序列。启动子可以被 RNA 聚 合酶辨认， 并开始转录。RNA 聚合酶在进行转录时常需要一些辅助因子参与作用， 称为转录 因子。 转录因子对植物次生代谢的调节是通过与合成基因启动子上相应的顺式作用元件结 合而实现的， 合成基因启动子中均含有转录因子能够识别的顺式作用元件。启动子与转录 因子结合位点是影响真核基因表达的重要调控元件， 这种结合往往受到外界环境的影响。 尽管真核基因的表达在多层次受不同的因子协同调控， 但调控的主要环节在基因的转录水 平。
黄芩 CHS 的 cDNA 序列是已知的 (GeneBank 的登记号为 AB008748)， 但是黄芩 CHS 启动子序列没有公开。
序列的简要描述
SEQ ID No.1 是黄芩的一段 DNA 序列， 包括 CHS 启动子。
SEQ ID No.2 是黄芩的一段 DNA 序列， 包括 CHS 启动子。
SEQ ID No.3 是黄芩的一段 DNA 序列， 包括 CHS 启动子 发明内容 本发明一方面提供了与 CHS 启动子相应的或来源于 CHS 启动子的 DNA 分子。
本发明另一方面提供了 DNA 构建体， 该构建体包含从 5′到 3’ 方向操作性地连接 的： 1) 黄芩 CHS 启动子 ； 2) 目的基因 ； 3)3’ UTR。在优选的实施方式中， CHS 启动子包含 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.3 序列。
编码对 SEQ ID No.1 经添加、 取代、 插入或缺失一个或多个碱基且具有 SEQ ID No.1 功能的 DNA 序列。
本发明另一方面是提供一种转化植物， 该转化植物至少含有一个本发明 DNA 构建 体的植物细胞。
本发明涵盖了所有提供功能性植物启动子的任何 CHS 启动子缺失型突变体， 这种 启动子都属于 “SbCHS 启动子” 。
附图说明
图 1 植物表达载体 pSB 物理图谱。
图 2T0 代转基因烟草的 PCR 分析。M， lib DNA Ladder ； 1-10， 转基因烟草 ； 11， 非转基因烟草为负对照 ； 12， 质粒 p1301 为正对照。
图 3 转基因烟草 GUS 活性分析。 具体实施方式
实施例 1SbCHS 启动子的克隆
根 据 已 知 的 黄 芩 CHS cDNA 序 列 (GeneBank ： AB008748)，设 计 引 物 PC4 ： 5′ -CGCCGTGAAGTTGTCGTTCTCCT-3′， PC5 ： 5′ -CATTGTCGCCGGAGAAGGAGGTA-3′， PC6 ： 5′ -CTCCTCCATTCCATTCCATTCCATACA-3′， 由上海生工生物技术公司合成。以黄芩总 DNA 为模 板， 按照 Genomewalking 试剂盒 (Takara 公司 ) 说明书进行 PCR 扩增获得长度为 490bp 的 CHS 基因的启动子片段， 1％琼脂糖凝胶电泳， 回收纯化后连接到 pGEM-T 载体上， 筛选鉴定 后进行测定， 序列如序列表中 SEQ ID No.1 所示。
利用 Softbarry 软件对 SEQ ID No.1 进行生物信息学分析， 结果预测该序列是一 个植物启动子， 在该序列上发现 3 个调控元件， 分别为 CT-LB、 GA-5、 ERE 2。
实施例 2 植物表达载体的构建
根据 SEQ ID No.1 序列设计引物， 且在 5′端加上 PstI 酶切位点， 3′端加上 BglII 酶切位点， 由上海生工生物技术公司合成引物， 序列如下 ： C1 ： 5′ -CTGCAGCGTCGAGTGATATG AAAAAAGAAGA-3′， C2 ： 5′ -AGATCTTGTCGCCGGAGAAGGAGGTAATTGG-3′。以黄芩总 DNA 为模 板， 按常规方法进行 PCR 扩增获得 502bp 的目的片段， 电泳回收纯化， 连接到 pGEM-T 载体 上， 筛选鉴定后获得 SbCHS-T。
分别用 PstI 和 BglII 双酶切 SbCHS-T 和 p1301 质粒 (GeneBank ： AF234297)， 37℃， 2 小时后用 1.0％琼脂糖凝胶电泳， 分别回收 502bp 和约 10000bp 片段， 纯化后将两个回收 产物用 T4DNA 连接酶连接， 连接体系共 20μL ： T4DNA 连接酶， 1μL ； 10× 连接 buffer， 2μL ； p1301 片段， 3μL ； SbCHS， 14μL。然后按 CaCl2 法转化 DH5α， 进行卡那抗生素筛选， 提取重 组阳性质粒， 用 PstI 和 BglII 双酶切进行重组质粒结构验证， 获得植物表达载体 pSB， 见图 1。
实施例 3 烟草转化和转基因烟草的后代分析
将植物表达载体 pSB 通过农杆菌转化导入烟草。烟草转化采用叶盘法， 转化外植 体取生长于培养基的无菌烟草植株顶部较幼嫩的叶片。共培养三天后， 转至分化培养基进 行见光分化， 约两周以后即可看到愈伤组织产生， 而大部分转化体则可以直接分化出抗性 芽。抗性芽生长至 2 ～ 3cm 时， 转到生根培养基中诱导生根， 约两周后即可生出细嫩小根， 逐渐成苗。成苗后移栽到花盆中。
对 T0 代 转 基 因 烟 草 植 株 进 行 PCR 检 测。 提 取 转 基 因 烟 草 T0 代 再 生 植 株 叶 片 总 DNA，用 GUS 基 因 引 物 (GUS1 ： 5 ′ -GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG-3 ′， GUS2 ： 5′ -GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA-3′ ) 进行 PCR 扩增。反应条件为 ： 94℃变性 30sec， 61℃退 火 1min， 72℃延伸 2min， 30 个循环后， 72℃保温 5min。部分植株的 PCR 检测结果见图 2。转 基因植株扩增出 1.2kb 的目的条带， 而未转化烟草植株则没有相应大小的产物。 PCR 检测结 果表明， 获得转基因阳性株。
实施例 4SbCHS 启动子转录活性分析
将 T1 代转基因烟草种子放在 1/2MS 培养基上萌发， 分别于萌发小苗长至 4 片叶后的 0， 5， 10， 15， 20 天后开始取样， 提取烟草叶片中的总蛋白， 并进行 GUS 活性定量检测。以 非转基因烟草作为对照， 结果表明转基因烟草中的 GUS 活性为 31.4nmol/min/g FW， 显著高 于对照， 说明 SbCHS 具有启动子转录活性， 详见图 3。
烟草中总蛋白提取方法 ： 取 5 克烟草叶片， 加液氮在研钵中碾磨成粉末状， 将 粉 末 转 移 到 一 个 50ml 离 心 管 中， 加 20ml 蛋 白 提 取 液 (50mMNa2CO3， 100mMNaCl， 0.05 ％ Tritonx-100， 0.05 ％ Tween-20， 1uM 亮 异 酶 肽， pH9.5)。 放 置 几 小 时， 充 分 提 取 蛋 白。 4,000rpm， 4℃离心 20 分钟， 取上清。
GUS 活性的定量测定方法 ： 取 100mg 烟草叶片， 加 400μL GUS 蛋白提取缓冲液 (100mg/ml x-Gluc， 400mmol/l 的磷酸钠缓冲液 (pH 7.0)， 5mmol/L 铁氰化钾、 5mmol/L 亚铁 氰化钾和 PH 8.0 的 0.1mol/lEDTA) 在 Eppendorf 管中研磨成匀浆。离心后吸取 10μL 上 清液， 加底物 4-methylumbelliferone-β-D-glucuronide 混匀， 37℃保温 30min 后终止反 应， 用 UARIAN 型荧光分光光度计测定 E365/450 荧光值。GUS 活性以 MU 的纳摩尔数与总蛋 白含量及时间的比值 nmol MU·mg-1protein·min-1 表示。按照考马斯亮兰 G250 法测定 叶片中可溶性蛋白的浓度。
实施例 5SbCHS 启动子调控元件的功能研究 分 别 利 用 引 物 C3 ： 5 ′ -ctgcagCTGAACGGTATCGGGAGC-3 ′、 C4 ： 5′ -ctgcagCTTTGAGTCTACCGTGGCG-3′和 C2 通过 PCR 方法扩增得到 2 个不同长度的黄芩 CHS 基因启动子 5’ 端缺失片段， 命名为缺失启动子 1、 缺失启动子 2。缺失启动子 1 序列如 序列表中 SEQ ID No.2 所示。缺失启动子 2 序列如序列表中 SEQ ID No.3 所示。分别将缺 失启动子 1、 缺失启动子 2 克隆到 p1301 载体位于 GUS 基因的上游的 Pst I/Bgl II 酶切位 点中， 获得系列植物表达载体。 具体方法同实施例 2。 采用叶盘法将含有缺失载体的根癌农 杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 分别转化烟草 (Nicotiana tabacum)， 具体方法同实施 例 3。共获得了 23 个转基因烟草株系。
提取转基因烟草的总蛋白， 并分析 GUS 的活性， 具体方法同实施例 4。结果表明缺 失启动子 2 的转录活性显著高于 SbCHS 启动子， 而缺失启动子 1 的转录活性与 SbCHS 启动 子没有显著差异。详见图 3。
实施例 6SbCHS 启动子的突变
根据 SEQ ID No.1 序列设计突变引物， 且在 5′端加上 PstI 酶切位点， 3′端加上 BglII 酶切位点， 由上海生工生物技术公司合成引物， 序列如下 ： C5 ： 5′ -CTGCAGCGTCGAGTG AAATGAATAAACAAGA-3′， 和 C2 通过 PCR 方法扩增得到 1 个含有 3 个碱基突变的黄芩 CHS 基 因启动子， 命名为突变启动子。 将突变启动子克隆到 p1301 载体位于 GUS 基因的上游的 Pst I/Bgl II 酶切位点中， 获得系列植物表达载体。 具体方法同实施例 2。 采用叶盘法将含有缺 失载体的根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 分别转化烟草 (Nicotiana tabacum)， 具体方法同实施例 3。共获得了 6 个转基因烟草株系。提取转基因烟草的总蛋白， 并分析 GUS 的活性， 具体方法同实施例 4。结果表明突变启动子的转录活性与 SbCHS 启动子没有显 著差异。
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