黄芩查尔酮合酶基因的启动子及其应用.pdf

1、10申请公布号CN102465126A43申请公布日20120523CN102465126ACN102465126A21申请号201010533224022申请日20101105C12N15/113201001C12N5/10200601C12N15/63200601C12N15/82200601A01H5/0020060171申请人中国中医科学院中药研究所地址100700北京市东城区东直门内南小街16号72发明人黄璐琦袁媛刘允军54发明名称黄芩查尔酮合酶基因的启动子及其应用57摘要本发明公开了黄芩查尔酮合酶基因的启动子及其应用，本发明所提供的植物启动子SBCHS，是下列核苷酸序列之一1序列表

2、中SEQIDNO1的DNA序列；2序列表中SEQIDNO2的DNA序列；3序列表中SEQIDNO3的DNA序列；4与序列表中SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3限定的DNA序列具有99以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。SBCHS可作为植物转基因工程的工具启动子，可广泛用于培育单子叶或双子叶转基因植物。51INTCL权利要求书1页说明书3页序列表2页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页序列表2页附图1页1/1页21一种植物启动子，是下列核苷酸序列之一1序列表中SEQIDNO1的DNA序列；2序列表中SEQIDNO2的DNA序列；3

3、序列表中SEQIDNO3的DNA序列；4与序列表中SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3限定的DNA序列具有99以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。2根据权利要求1所述的植物启动子，其特征在于它的编码序列是序列表中的SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3。3含有权利要求1所述启动子的细胞系。4含有权利要求1所述启动子的表达载体。5权利要求1所述启动子在培育转基因植物中的应用。权利要求书CN102465126A1/3页3黄芩查尔酮合酶基因的启动子及其应用技术领域0001本发明涉及植物基因工程技术，提供了用于控制植物中重组基因表达的DNA序列和构建体，即本发明提供了

4、黄芩查尔酮合酶基因CHS的启动子序列。背景技术0002植物基因工程技术需要使用调控序列用于调节转基因的表达，调控序列包含启动子、强化子等，这些序列调控了基因的表达，进而影响蛋白质的生产。0003启动子在遗传学中是指一段能使基因进行转录的DNA序列。启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。RNA聚合酶在进行转录时常需要一些辅助因子参与作用，称为转录因子。转录因子对植物次生代谢的调节是通过与合成基因启动子上相应的顺式作用元件结合而实现的，合成基因启动子中均含有转录因子能够识别的顺式作用元件。启动子与转录因子结合位点是影响真核基因表达的重要调控元件，这种结合往往受到外界环境的影响。尽管真核基因的表

5、达在多层次受不同的因子协同调控，但调控的主要环节在基因的转录水平。0004黄芩CHS的CDNA序列是已知的GENEBANK的登记号为AB008748，但是黄芩CHS启动子序列没有公开。0005序列的简要描述0006SEQIDNO1是黄芩的一段DNA序列，包括CHS启动子。0007SEQIDNO2是黄芩的一段DNA序列，包括CHS启动子。0008SEQIDNO3是黄芩的一段DNA序列，包括CHS启动子发明内容0009本发明一方面提供了与CHS启动子相应的或来源于CHS启动子的DNA分子。0010本发明另一方面提供了DNA构建体，该构建体包含从5到3方向操作性地连接的1黄芩CHS启动子；2目的基因

6、；33UTR。在优选的实施方式中，CHS启动子包含SEQIDNO1和SEQIDNO3序列。0011编码对SEQIDNO1经添加、取代、插入或缺失一个或多个碱基且具有SEQIDNO1功能的DNA序列。0012本发明另一方面是提供一种转化植物，该转化植物至少含有一个本发明DNA构建体的植物细胞。0013本发明涵盖了所有提供功能性植物启动子的任何CHS启动子缺失型突变体，这种启动子都属于“SBCHS启动子”。附图说明0014图1植物表达载体PSB物理图谱。0015图2T0代转基因烟草的PCR分析。M，LIBDNALADDER；110，转基因烟草；11，非说明书CN102465126A2/3页4转基因

7、烟草为负对照；12，质粒P1301为正对照。0016图3转基因烟草GUS活性分析。具体实施方式0017实施例1SBCHS启动子的克隆0018根据已知的黄芩CHSCDNA序列GENEBANKAB008748，设计引物PC45CGCCGTGAAGTTGTCGTTCTCCT3，PC55CATTGTCGCCGGAGAAGGAGGTA3，PC65CTCCTCCATTCCATTCCATTCCATACA3，由上海生工生物技术公司合成。以黄芩总DNA为模板，按照GENOMEWALKING试剂盒TAKARA公司说明书进行PCR扩增获得长度为490BP的CHS基因的启动子片段，1琼脂糖凝胶电泳，回收纯化后连接到P

8、GEMT载体上，筛选鉴定后进行测定，序列如序列表中SEQIDNO1所示。0019利用SOFTBARRY软件对SEQIDNO1进行生物信息学分析，结果预测该序列是一个植物启动子，在该序列上发现3个调控元件，分别为CTLB、GA5、ERE2。0020实施例2植物表达载体的构建0021根据SEQIDNO1序列设计引物，且在5端加上PSTI酶切位点，3端加上BGLII酶切位点，由上海生工生物技术公司合成引物，序列如下C15CTGCAGCGTCGAGTGATATGAAAAAAGAAGA3，C25AGATCTTGTCGCCGGAGAAGGAGGTAATTGG3。以黄芩总DNA为模板，按常规方法进行PCR扩

9、增获得502BP的目的片段，电泳回收纯化，连接到PGEMT载体上，筛选鉴定后获得SBCHST。0022分别用PSTI和BGLII双酶切SBCHST和P1301质粒GENEBANKAF234297，37，2小时后用10琼脂糖凝胶电泳，分别回收502BP和约10000BP片段，纯化后将两个回收产物用T4DNA连接酶连接，连接体系共20LT4DNA连接酶，1L；10连接BUFFER，2L；P1301片段，3L；SBCHS，14L。然后按CACL2法转化DH5，进行卡那抗生素筛选，提取重组阳性质粒，用PSTI和BGLII双酶切进行重组质粒结构验证，获得植物表达载体PSB，见图1。0023实施例3烟草转

10、化和转基因烟草的后代分析0024将植物表达载体PSB通过农杆菌转化导入烟草。烟草转化采用叶盘法，转化外植体取生长于培养基的无菌烟草植株顶部较幼嫩的叶片。共培养三天后，转至分化培养基进行见光分化，约两周以后即可看到愈伤组织产生，而大部分转化体则可以直接分化出抗性芽。抗性芽生长至23CM时，转到生根培养基中诱导生根，约两周后即可生出细嫩小根，逐渐成苗。成苗后移栽到花盆中。0025对T0代转基因烟草植株进行PCR检测。提取转基因烟草T0代再生植株叶片总DNA，用GUS基因引物GUS15GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG3，GUS25GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA3进行PCR扩增。

11、反应条件为94变性30SEC，61退火1MIN，72延伸2MIN，30个循环后，72保温5MIN。部分植株的PCR检测结果见图2。转基因植株扩增出12KB的目的条带，而未转化烟草植株则没有相应大小的产物。PCR检测结果表明，获得转基因阳性株。0026实施例4SBCHS启动子转录活性分析0027将T1代转基因烟草种子放在1/2MS培养基上萌发，分别于萌发小苗长至4片叶后说明书CN102465126A3/3页5的0，5，10，15，20天后开始取样，提取烟草叶片中的总蛋白，并进行GUS活性定量检测。以非转基因烟草作为对照，结果表明转基因烟草中的GUS活性为314NMOL/MIN/GFW，显著高于对

12、照，说明SBCHS具有启动子转录活性，详见图3。0028烟草中总蛋白提取方法取5克烟草叶片，加液氮在研钵中碾磨成粉末状，将粉末转移到一个50ML离心管中，加20ML蛋白提取液50MMNA2CO3，100MMNACL，005TRITONX100，005TWEEN20，1UM亮异酶肽，PH95。放置几小时，充分提取蛋白。4,000RPM，4离心20分钟，取上清。0029GUS活性的定量测定方法取100MG烟草叶片，加400LGUS蛋白提取缓冲液100MG/MLXGLUC，400MMOL/L的磷酸钠缓冲液PH70，5MMOL/L铁氰化钾、5MMOL/L亚铁氰化钾和PH80的01MOL/LEDTA在E

13、PPENDORF管中研磨成匀浆。离心后吸取10L上清液，加底物4METHYLUMBELLIFERONEDGLUCURONIDE混匀，37保温30MIN后终止反应，用UARIAN型荧光分光光度计测定E365/450荧光值。GUS活性以MU的纳摩尔数与总蛋白含量及时间的比值NMOLMUMG1PROTEINMIN1表示。按照考马斯亮兰G250法测定叶片中可溶性蛋白的浓度。0030实施例5SBCHS启动子调控元件的功能研究0031分别利用引物C35CTGCAGCTGAACGGTATCGGGAGC3、C45CTGCAGCTTTGAGTCTACCGTGGCG3和C2通过PCR方法扩增得到2个不同长度的黄芩

14、CHS基因启动子5端缺失片段，命名为缺失启动子1、缺失启动子2。缺失启动子1序列如序列表中SEQIDNO2所示。缺失启动子2序列如序列表中SEQIDNO3所示。分别将缺失启动子1、缺失启动子2克隆到P1301载体位于GUS基因的上游的PSTI/BGLII酶切位点中，获得系列植物表达载体。具体方法同实施例2。采用叶盘法将含有缺失载体的根癌农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENS分别转化烟草NICOTIANATABACUM，具体方法同实施例3。共获得了23个转基因烟草株系。0032提取转基因烟草的总蛋白，并分析GUS的活性，具体方法同实施例4。结果表明缺失启动子2的转录活性显著高于S

15、BCHS启动子，而缺失启动子1的转录活性与SBCHS启动子没有显著差异。详见图3。0033实施例6SBCHS启动子的突变0034根据SEQIDNO1序列设计突变引物，且在5端加上PSTI酶切位点，3端加上BGLII酶切位点，由上海生工生物技术公司合成引物，序列如下C55CTGCAGCGTCGAGTGAAATGAATAAACAAGA3，和C2通过PCR方法扩增得到1个含有3个碱基突变的黄芩CHS基因启动子，命名为突变启动子。将突变启动子克隆到P1301载体位于GUS基因的上游的PSTI/BGLII酶切位点中，获得系列植物表达载体。具体方法同实施例2。采用叶盘法将含有缺失载体的根癌农杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENS分别转化烟草NICOTIANATABACUM，具体方法同实施例3。共获得了6个转基因烟草株系。提取转基因烟草的总蛋白，并分析GUS的活性，具体方法同实施例4。结果表明突变启动子的转录活性与SBCHS启动子没有显著差异。说明书CN102465126A1/2页600010002序列表CN102465126A2/2页7序列表CN102465126A1/1页8图1图2图3说明书附图CN102465126A