一种靶向GOLPH3基因干扰小分子RNA及其抗胶质瘤迁移的用途.pdf

摘要
申请专利号：	CN201010531309.5	申请日：	2010.11.04
公开号：	CN102465125A	公开日：	2012.05.23
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 15/113申请公布日:20120523\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/113(2010.01)I; C12N15/10; A61K48/00; A61P35/04	主分类号：	C12N15/113
申请人：	上海生博医学生物技术有限公司
发明人：	叶思灵; 陈国泽; 殷姗; 夏清梅; 潘讴东
地址：	201203 上海市浦东新区张江高科园区蔡伦路781号A604
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内容摘要

本发明涉及一种靶向GOLPH3基因干扰小分子RNA、其制备方法及应用。该干扰小分子RNA为SEQNO.1所示的碱基序列。本发明设计对抑制胶质瘤迁移有作用的基因的干扰小分子RNA，应用胶质瘤细胞模型研究其对胶质瘤迁移的抑制作用，为胶质瘤的基因治疗提供了一种新方法。

权利要求书

1：一种靶向 GOLPH3 基因干扰小分子 RNA 及其抗胶质瘤迁移的用途，其特征在于该基因为 SEQ NO.1 所示的碱基序列。
2：一种制备根据权利要求 1 所述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA 的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据 MAGic 载体设计的具体要求，设计对应于 GOLPH3 基因 757-775 位，即 : GGT GAG ACA TGG AAT CCA T 的 shRNA 的寡核苷酸序列，各为 57bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的 shRNA 的寡核苷酸序列序列为： SEQ NO.1: Sense: 5’ -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATC TCG AGA TGG ATT CCA TGT CTC ACC TTT TTT g -3’ Anti-sense:5’ -AAT TCA AAA AAG GTG AGA CAT GGA ATC CAT CTC GAG ATG GAT TCC ATG TCT CAC C -3’ ；依据 pMAGic 载体设计的要求，将设计的 shRNA 序列和 MAGic 质粒进行连接，得到用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA。
3：根据权利要求 1 所述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA 及其在制取抗胶质瘤迁移药物中的应用。

说明书

一种靶向 GOLPH3 基因干扰小分子 RNA 及其抗胶质瘤迁移的用途
    【技术领域】
     本发明涉及一种靶向 GOLPH3 基因干扰小分子 RNA、其制备方法及应用。背景技术 RNA 干扰 (RNA interference， RNAi) 是指由双链 RNA 介导的细胞内与其序列同源的 mRNA 发生特异性降解，从而导致基因表达沉默的现象，这是一种转录后水平的基因沉默机制。
     本发明的目的之一在于提供一种靶向 GOLPH3 基因干扰小分子 RNA。
     本发明的目的之二在于提供该干扰小分子 RNA 的制备方法。
     本发明的目的之三在于提供该干扰小分子 RNA 的应用。
     为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA，其特征在于该基因为 SEQ NO.1 所示的碱基序列。
     一种制备上述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA 的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据 MAGic 载体设计的具体要求，设计对应于 GOLPH3 基因 757-775 位，即: GGT GAG ACA TGG AAT CCA T 的 shRNA 的寡核苷酸序列，各为 57bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的 shRNA 的寡核苷酸序列为： SEQ NO.1: Sense: 5’ -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATC TCG AGA TGG ATT CCA TGT CTC ACC TTT TTT g -3’ Anti-sense:5’ -AAT TCA AAA AAG GTG AGA CAT GGA ATC CAT CTC GAG ATG GAT TCC ATG TCT CAC C -3’ ；根据 MAGic 载体设计的具体要求，将设计的 shRNA 的寡核苷酸序列引物和 MAGic 质粒进行连接，得到用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA。
     一种上述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子 RNA 在制备抗胶质瘤迁移的分泌药物中的应用。
     本发明设计对抗胶质瘤迁移有关联的基因的 RNAi，并应用胶质瘤细胞模型研究其对抗胶质瘤增殖并促其凋亡的促进作用，为 RNAi 在胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。
     附图说明图 1 为 shRNA 的寡核苷酸序列引物和 PMAGic 质粒的连接图。图 2（A）为正常 U251 细胞的迁移。图 2（B）转染过 GOLPH3-RNAi 细胞的迁移。
     具体实施方式：一、胶质瘤细胞的培养：胶质瘤细胞 U251 细胞系培养于 37℃， 5%CO2 恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，之后加入适量培养液并反复吹打以混匀细胞；将得到的细
     胞悬液移入 15ml 离心管中， 1500rpm 离心 3min ；去上清；用 5ml 无菌 1×PBS 将细胞悬起，吹打混匀；加约 1ml 细胞悬液于装有 5ml 新鲜培养基的新培养瓶中，放入 37℃， 5%CO2 培养箱中培养，约 2 天左右传代 1 次（主要查看细胞有无铺满培养瓶）。
     二、人脑胶质瘤细胞的分离：取人脑胶质瘤手术标本 , 浸入 4℃的 KRBB 溶液中 . 清洗二次 , 然后将标本剪成小块 , 转移至盛有 5mL 消化酶液的三角瓶中 , 于恒温摇床中 37 ℃保温 , 摇床转速 100r/min, 每 10min 玻璃管反复吹打一次 , 放置 30min。将该悬液离心 500-1000rpm， 5min, 最后剩下为胶质瘤细胞 . 用细胞培养液悬起沉淀，在黑背景的显微镜下观察可发现到呈圆形的胶质瘤细胞。
     三、 GOLPH3-RNAi 质粒的设计和转染：根据 RNAi 载体设计的具体要求，设计对应于 GOLPH3 基因 757-775 位，即 : GGT GAG ACA TGG AAT CCA T 的 shRNA 的寡核苷酸序列，各为 57bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的 shRNA 的寡核苷酸序列为： SMAD1-RNAi 对应的序列为： SEQ NO.1: Sense: 5’ -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATC TCG AGA TGG ATT CCA TGT CTC ACC TTT TTT g -3’ Anti-sense:5’ -AAT TCA AAA AAG GTG AGA CAT GGA ATC CAT CTC GAG ATG GAT TCC ATG TCT CAC C -3’ ；根据 MAGic 中载体设计的具体要求，将设计的 GOLPH3 -RNAi 的干扰片段和 MAGic 质粒连接，参见图 1，然后转染进胶质瘤细胞。
     GOLPH3-RNAi 质粒的转染：转染前一天，在含有 5ml 无抗生素的 DMEM 生长培养 6 基的 60-mm 培养皿里种上 2×10 个胶质瘤细胞。铺板后第二天准备转染：首先用 500μl 无血清的培养基（DMEM）溶解 8.0μg 的 SMAD1-RNAi 表达载体，用 500μl 培养基（DMEM 或 TM RPMI1640）溶解 Lipofectamine 2000(20μl)，轻轻地混匀，室温孵育 5 分钟。孵育后，为促 TM 使 shRNA 表达载体与 Lipofectamine 2000 充分结合，将它们轻轻混匀，室温孵育 20 分钟， TM TM 以形成 DNA-Lipofectamine 2000 的复合物。将 DNA-Lipofectamine 2000 复合物加入到 60mm 培养皿，之后将含有 DNA-LipofectamineTM2000 复合物的细胞培养皿放入 37℃， 5% CO2 培养箱内培养 6 小时，换上正常细胞培养液。
     四、实验分组与检测指标正常对照组：胶质瘤细胞 , 培养液为胶质瘤细胞培养液； RNAi 组：转染过 GOLPH3-RNAi 的胶质瘤细胞 , 培养液为胶质瘤细胞培养液。
     胶质瘤细胞迁移的检测：将贴壁细胞培养皿的定点拍照部位做好标记，用 1000μl tip 在底部轻轻划线（垂直 90 度，用力均匀），确保划线处无细胞。划线两侧间距为 average gaps（AGs）。连续两天倒置显微镜下 100× 下拍照，记录各组细胞的 AGs，即细胞的迁移情况。如图 2(A) 和图 2 （B）。
     图 2（A）正常 U251 细胞的迁移。实验结果表明，胶质瘤细胞 U251 的迁移的细胞数量和 AVGs 均呈时间依赖性。
     图 2（B）转染过 GOLPH3-RNAi 的 U251 细胞的迁移。实验结果表明，胶质瘤细胞 U251 的迁移随时间的延长和对照相比细胞迁移的数量和细胞迁移的 AVGs 均有所下降。图中标尺的长度为 500um。
     五、结果：转染过 GOLPH3-RNAi 干扰质粒的胶质瘤的细胞迁移数量减少，细胞的AVGs 减少。该实验结果表明，通过 RNAi 技术下调胶质瘤中的 GOLPH3 表达抑制了胶质瘤的迁移。

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1、10申请公布号CN102465125A43申请公布日20120523CN102465125ACN102465125A21申请号201010531309522申请日20101104C12N15/113201001C12N15/10200601A61K48/00200601A61P35/0420060171申请人上海生博医学生物技术有限公司地址201203上海市浦东新区张江高科园区蔡伦路781号A60472发明人叶思灵陈国泽殷姗夏清梅潘讴东54发明名称一种靶向GOLPH3基因干扰小分子RNA及其抗胶质瘤迁移的用途57摘要本发明涉及一种靶向GOLPH3基因干扰小分子RNA、其制备方法及应用。该干扰小。

2、分子RNA为SEQNO1所示的碱基序列。本发明设计对抑制胶质瘤迁移有作用的基因的干扰小分子RNA，应用胶质瘤细胞模型研究其对胶质瘤迁移的抑制作用，为胶质瘤的基因治疗提供了一种新方法。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图2页1/1页21一种靶向GOLPH3基因干扰小分子RNA及其抗胶质瘤迁移的用途，其特征在于该基因为SEQNO1所示的碱基序列。2一种制备根据权利要求1所述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA的方法，其特征在于该方法的具体步骤为根据MAGIC载体设计的具体要求，设计对应于GOLPH3基因75777。

3、5位，即GGTGAGACATGGAATCCAT的SHRNA的寡核苷酸序列，各为57BP，送华大基因研究中心进行合成；所述的SHRNA的寡核苷酸序列序列为SEQNO1SENSE5CCGGGGTGAGACATGGAATCCATCTCGAGATGGATTCCATGTCTCACCTTTTTTG3ANTISENSE5AATTCAAAAAAGGTGAGACATGGAATCCATCTCGAGATGGATTCCATGTCTCACC3；依据PMAGIC载体设计的要求，将设计的SHRNA序列和MAGIC质粒进行连接，得到用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA。3根据权利要求1所述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA及。

4、其在制取抗胶质瘤迁移药物中的应用。权利要求书CN102465125A1/3页3一种靶向GOLPH3基因干扰小分子RNA及其抗胶质瘤迁移的用途技术领域0001本发明涉及一种靶向GOLPH3基因干扰小分子RNA、其制备方法及应用。背景技术0002RNA干扰RNAINTERFERENCE，RNAI是指由双链RNA介导的细胞内与其序列同源的MRNA发生特异性降解，从而导致基因表达沉默的现象，这是一种转录后水平的基因沉默机制。0003本发明的目的之一在于提供一种靶向GOLPH3基因干扰小分子RNA。0004本发明的目的之二在于提供该干扰小分子RNA的制备方法。0005本发明的目的之三在于提供该干扰小分子。

5、RNA的应用。0006为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA，其特征在于该基因为SEQNO1所示的碱基序列。0007一种制备上述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA的方法，其特征在于该方法的具体步骤为根据MAGIC载体设计的具体要求，设计对应于GOLPH3基因757775位，即GGTGAGACATGGAATCCAT的SHRNA的寡核苷酸序列，各为57BP，送华大基因研究中心进行合成；所述的SHRNA的寡核苷酸序列为SEQNO1SENSE5CCGGGGTGAGACATGGAATCCATCTCGAGATGGATTCCATGTCTCACCTTTTTTG3ANTI。

6、SENSE5AATTCAAAAAAGGTGAGACATGGAATCCATCTCGAGATGGATTCCATGTCTCACC3；根据MAGIC载体设计的具体要求，将设计的SHRNA的寡核苷酸序列引物和MAGIC质粒进行连接，得到用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA。0008一种上述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA在制备抗胶质瘤迁移的分泌药物中的应用。0009本发明设计对抗胶质瘤迁移有关联的基因的RNAI，并应用胶质瘤细胞模型研究其对抗胶质瘤增殖并促其凋亡的促进作用，为RNAI在胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。0010附图说明图1为SHRNA的寡核苷酸序列引物和PMAGIC质粒的连接图。图2（。

7、A）为正常U251细胞的迁移。图2（B）转染过GOLPH3RNAI细胞的迁移。0011具体实施方式一、胶质瘤细胞的培养胶质瘤细胞U251细胞系培养于37，5CO2恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，之后加入适量培养液并反复吹打以混匀细胞；将得到的细说明书CN102465125A2/3页4胞悬液移入15ML离心管中，1500RPM离心3MIN；去上清；用5ML无菌1PBS将细胞悬起，吹打混匀；加约1ML细胞悬液于装有5ML新鲜培养基的新培养瓶中，放入37，5CO2培养箱中培养，约2天左右传代1次（主要查看细胞有无铺满培养瓶）。0012二、人脑胶质瘤细胞的分离取人脑胶质瘤手术标本,浸入4的。

8、KRBB溶液中清洗二次,然后将标本剪成小块,转移至盛有5ML消化酶液的三角瓶中,于恒温摇床中37保温,摇床转速100R/MIN,每10MIN玻璃管反复吹打一次,放置30MIN。将该悬液离心5001000RPM，5MIN,最后剩下为胶质瘤细胞用细胞培养液悬起沉淀，在黑背景的显微镜下观察可发现到呈圆形的胶质瘤细胞。0013三、GOLPH3RNAI质粒的设计和转染根据RNAI载体设计的具体要求，设计对应于GOLPH3基因757775位，即GGTGAGACATGGAATCCAT的SHRNA的寡核苷酸序列，各为57BP，送华大基因研究中心进行合成；所述的SHRNA的寡核苷酸序列为SMAD1RNAI对应的。

9、序列为SEQNO1SENSE5CCGGGGTGAGACATGGAATCCATCTCGAGATGGATTCCATGTCTCACCTTTTTTG3ANTISENSE5AATTCAAAAAAGGTGAGACATGGAATCCATCTCGAGATGGATTCCATGTCTCACC3；根据MAGIC中载体设计的具体要求，将设计的GOLPH3RNAI的干扰片段和MAGIC质粒连接，参见图1，然后转染进胶质瘤细胞。0014GOLPH3RNAI质粒的转染转染前一天，在含有5ML无抗生素的DMEM生长培养基的60MM培养皿里种上2106个胶质瘤细胞。铺板后第二天准备转染首先用500L无血清的培养基（DMEM）溶。

10、解80G的SMAD1RNAI表达载体，用500L培养基（DMEM或RPMI1640）溶解LIPOFECTAMINETM200020L，轻轻地混匀，室温孵育5分钟。孵育后，为促使SHRNA表达载体与LIPOFECTAMINETM2000充分结合，将它们轻轻混匀，室温孵育20分钟，以形成DNALIPOFECTAMINETM2000的复合物。将DNALIPOFECTAMINETM2000复合物加入到60MM培养皿，之后将含有DNALIPOFECTAMINETM2000复合物的细胞培养皿放入37，5CO2培养箱内培养6小时，换上正常细胞培养液。0015四、实验分组与检测指标正常对照组胶质瘤细胞,培养液。

11、为胶质瘤细胞培养液；RNAI组转染过GOLPH3RNAI的胶质瘤细胞,培养液为胶质瘤细胞培养液。0016胶质瘤细胞迁移的检测将贴壁细胞培养皿的定点拍照部位做好标记，用1000LTIP在底部轻轻划线（垂直90度，用力均匀），确保划线处无细胞。划线两侧间距为AVERAGEGAPS（AGS）。连续两天倒置显微镜下100下拍照，记录各组细胞的AGS，即细胞的迁移情况。如图2A和图2（B）。0017图2（A）正常U251细胞的迁移。实验结果表明，胶质瘤细胞U251的迁移的细胞数量和AVGS均呈时间依赖性。0018图2（B）转染过GOLPH3RNAI的U251细胞的迁移。实验结果表明，胶质瘤细胞U251的迁移随时间的延长和对照相比细胞迁移的数量和细胞迁移的AVGS均有所下降。图中标尺的长度为500UM。0019五、结果转染过GOLPH3RNAI干扰质粒的胶质瘤的细胞迁移数量减少，细胞的说明书CN102465125A3/3页5AVGS减少。该实验结果表明，通过RNAI技术下调胶质瘤中的GOLPH3表达抑制了胶质瘤的迁移。说明书CN102465125A1/2页6图1说明书附图CN102465125A2/2页7图2（A）图2（B）说明书附图CN102465125A。

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