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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711155573.1 (22)申请日 2017.11.20 (71)申请人 吉林大学 地址 101149 北京市通州区梨园新村66号 楼351 (72)发明人 宋春莉 (74)专利代理机构 重庆创新专利商标代理有限 公司 50125 代理人 付继德 (51)Int.Cl. A61L 31/10(2006.01) A61L 31/08(2006.01) A61L 31/02(2006.01) A61L 31/14(2006.01) A61L 31/16(2006.01) (。
2、54)发明名称 一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架及 其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种担载药物/基因纳米粒的 镁合金支架及其制备方法， 所述制备方法包括： 将乙醇和硅烷偶联剂混合， 制得偶联剂混合液； 将镁合金试片浸入偶联剂混合液中， 得到改性镁 合金试片； 将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳 聚糖溶液中， 烘干后得到担载药物纳米颗粒的镁 合金支架； 或将改性镁合金试片浸入microRNA- 130a/壳聚糖溶液中， 烘干后得到担载基因纳米 颗粒的镁合金支架。 解决了目前常用的DES多为 永久性支架， 载体材料多为不锈钢、 镍钛合金和 钴钛合金等， 无法在体内降解的问题。 同时本发 。
3、明制备的镁合金支架通过担载药物/基因纳米 粒， 可以降低支架内再狭窄及血栓形成的发生风 险。 权利要求书1页 说明书5页 CN 107875457 A 2018.04.06 CN 107875457 A 1.一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法包 括： （1） 将乙醇和硅烷偶联剂混合， 制得偶联剂混合液； （2） 将镁合金试片浸入偶联剂混合液中， 得到改性镁合金试片； （3） 将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液中， 烘干后得到担载药物纳米颗粒的 镁合金支架； 或 将改性镁合金试片浸入microRNA-130a/壳聚糖溶液中， 烘干后得到担载基因纳米。
4、颗粒 的镁合金支架。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其中， 偶联剂混合液的体积分数为4-6%。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其中， 步骤 （1） 中混合的时间为8-12s。 4.根据权利要求1所述的制备方法， 其中， 依维莫司/壳聚糖溶液的配制方法为： 将 0.1mg/mL的依维莫司溶液和1mg/mL的壳聚糖溶液按照体积比为0.8-1.2:10的比例进行混 合。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其中， microRNA-130a/壳聚糖溶液的配制方法为： 将0.1mg/mL的microRNA-130a溶液和1mg/mL的壳聚糖溶液按照体积比为0.8-1.2:10的比例 进行混。
5、合。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 其中， 将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶 液中后， 以4-6cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片， 提拉次数为3-5次。 7.根据权利要求1所述的制备方法， 其中， 将改性镁合金试片浸入microRNA-130a/壳聚 糖溶液中后， 以4-6cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片， 提拉次数为3-5次。 8.根据权利要求1所述的制备方法， 其中， 烘干的条件包括： 温度为35-45， 时间为22- 26h。 9.根据权利要求1所述的制备方法， 其中， 所述制备方法包括： 镁合金试片需利用金相 砂纸由800目打磨到2000目， 依次用。
6、丙酮、 无水乙醇除去表面油污， 后在去离子水中超声清 洗， 晾干备用。 10.一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架， 其特征在于， 所述担载药物/基因纳米粒 的镁合金支架由权利要求1-9中任意一项所述的制备方法制得。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107875457 A 2 一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及镁合金支架， 具体地， 涉及一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架及 其制备方法。 背景技术 0002 冠心病即冠状动脉粥样硬化性心脏病， 是最常见的心血管疾病， 发病急、 病死率 高。 主要症状表现为冠状动脉粥样硬化后产生斑块， 造。
7、成血管狭窄， 斑块破裂后形成急性血 栓， 并伴随冠状动脉痉挛， 进而导致冠状动脉血流急剧减少或中止， 最终导致心肌供血不 足。 经皮冠状动脉支架置入术是目前治疗冠状动脉疾病的重要手段。 目前常用的DES多为永 久性支架， 载体材料多为不锈钢、 镍钛合金和钴钛合金等， 无法在体内降解。 表面药物涂层 耗尽后， 这些永久性支架可能造成长期血管内膜功能失调、 血管内皮化过程延迟、 致栓塞反 应、 永久性机械牵拉或损伤、 慢性炎症反应、 直接置入部分与非支架置入部分血管运动不协 调及由此引发的冠脉血管瘤等风险。 支架永久存在与无法适应血管生长变化的矛盾也会大 大增加日后再行外科血运重建手术的难度。 冠。
8、脉支架置入术后患者需长期服用双重或三重 抗血小板药物， 增加了患者的医疗费用和长期双重或三重抗血小板治疗的出血风险。 此外， 长期内皮修复不完全， 会刺激内膜增生导致再狭窄。 基于以上永久性DES的缺点和可能诱发 的远期风险， 需对DES重新评价和优化， 并开发新型完全生物可降解支架。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架及其制备方法， 解 决了目前常用的DES多为永久性支架， 载体材料多为不锈钢、 镍钛合金和钴钛合金等， 无法 在体内降解的问题。 同时本发明制备的镁合金支架通过担载药物/基因纳米粒， 可以降低支 架内再狭窄及血栓形成的发生风险。 0004。
9、 为了实现上述目的， 本发明提供了一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架的制 备方法， 所述制备方法包括： （1） 将乙醇和硅烷偶联剂混合， 制得偶联剂混合液； （2） 将镁合金试片浸入偶联剂混合液中， 得到改性镁合金试片； （3） 将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液中， 烘干后得到担载药物纳米颗粒的 镁合金支架； 或 将改性镁合金试片浸入microRNA-130a/壳聚糖溶液中， 烘干后得到担载基因纳米颗粒 的镁合金支架。 0005 本发明还提供了一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架， 所述担载药物/基因纳 米粒的镁合金支架由上述的制备方法制得。 0006 通过上述技术方案， 本发明提供。
10、了一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架的制 备方法， 所述制备方法包括： 将乙醇和硅烷偶联剂混合， 制得偶联剂混合液； 将镁合金试片 浸入偶联剂混合液中， 得到改性镁合金试片； 将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液 说 明 书 1/5 页 3 CN 107875457 A 3 中， 烘干后得到担载药物纳米颗粒的镁合金支架； 或将改性镁合金试片浸入microRNA- 130a/壳聚糖溶液中， 烘干后得到担载基因纳米颗粒的镁合金支架。 通过上述方法制得的担 载药物纳米颗粒的镁合金支架或担载基因纳米颗粒的镁合金支架可完全生物降解， 在治疗 血管阻塞的同时， 可降低再狭窄， 减少晚期血栓、 慢性炎。
11、症和机械损伤的风险， 镁合金支架 表面担载有药物或基因纳米粒可以解决裸镁合金金属支架降解速度较快， 降解部位不均匀 的问题， 包被在支架外层的特种药物可长期有效地调节血药浓度， 发挥长久抗炎症感染、 抗 血栓形成、 抗有丝分裂等作用， 阻止冠脉血管内病态的细胞增殖， 包被在支架外层的基因纳 米粒可以起到抑制炎症反应的作用。 0007 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。 具体实施方式 0008 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。 应当理解的是， 此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明， 并不用于限制本发明。 0009 在本文中所披露的范围的端点和任何值。
12、都不限于该精确的范围或值， 这些范围或 值应当理解为包含接近这些范围或值的值。 对于数值范围来说， 各个范围的端点值之间、 各 个范围的端点值和单独的点值之间， 以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个 新的数值范围， 这些数值范围应被视为在本文中具体公开。 0010 本发明提供了一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架的制备方法， 所述制备方 法包括： （1） 将乙醇和硅烷偶联剂混合， 制得偶联剂混合液； （2） 将镁合金试片浸入偶联剂混合液中， 得到改性镁合金试片； （3） 将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液中， 烘干后得到担载药物纳米颗粒的 镁合金支架； 或 将改性镁合金试片浸入。
13、microRNA-130a/壳聚糖溶液中， 烘干后得到担载基因纳米颗粒 的镁合金支架。 0011 在本发明的一种优选的实施方式中， 为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解 性能和其药物或基因功效， 偶联剂混合液的体积分数为4-6%。 0012 在本发明的一种优选的实施方式中， 为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解 性能和其药物或基因功效， 步骤 （1） 中混合的时间为8-12s。 0013 在本发明的一种优选的实施方式中， 为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解 性能和其药物或基因功效， 依维莫司/壳聚糖溶液的配制方法为： 将0.1mg/mL的依维莫司溶 液和1mg/mL的壳聚糖溶液按照体积。
14、比为0.8-1.2:10的比例进行混合。 0014 在本发明的一种优选的实施方式中， 为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解 性能和其药物或基因功效， microRNA-130a/壳聚糖溶液的配制方法为： 将0.1mg/mL的 microRNA-130a溶液和1mg/mL的壳聚糖溶液按照体积比为0.8-1.2:10的比例进行混合。 0015 在本发明的一种优选的实施方式中， 为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解 性能和其药物或基因功效， 将改性镁合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液中后， 以4-6cm/ min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片， 提拉次数为3-5次。 0016 在本发明的一种优选。
15、的实施方式中， 为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解 说 明 书 2/5 页 4 CN 107875457 A 4 性能和其药物或基因功效， 将改性镁合金试片浸入microRNA-130a/壳聚糖溶液中后， 以4- 6cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试片， 提拉次数为3-5次。 0017 在本发明的一种优选的实施方式中， 为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解 性能和其药物或基因功效， 烘干的条件包括： 温度为35-45， 时间为22-26h。 0018 在本发明的一种优选的实施方式中， 为了进一步提高制得的镁合金支架生物降解 性能和其药物或基因功效， 所述制备方法包括： 镁合金试片。
16、需利用金相砂纸由800目打磨到 2000目， 依次用丙酮、 无水乙醇除去表面油污， 后在去离子水中超声清洗， 晾干备用。 0019 本发明还提供了一种担载药物/基因纳米粒的镁合金支架， 所述担载药物/基因纳 米粒的镁合金支架由上述的制备方法制得。 0020 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。 以下实施例中， 以下实施例中， 各原料 的制备方法如下： 1mg/mL的壳聚糖溶液： 将壳聚糖溶于0.1mol/L的醋酸中 （壳聚糖规格： 脱乙酰度95%， 粘度100-200mPa.s； 采用去RNA酶水） ， 磁力搅拌12h， 待壳聚糖完全溶解后， 用氢氧化钠调节 ph至5， 将溶液经0.22um。
17、的滤膜过滤除去杂质， 低温保存。 0021 1mg/mL的依维莫司溶液： 将依维莫司溶于无水乙醇中， 遮光密封保存， 防止乙醇挥 发。 0022 0.1mg/mL的依维莫司溶液： 以1mg/mL的依维莫司溶液为母液配制0.1mg/mL的依维 莫司溶液。 0023 0.1mg/mL的microRNA-130a溶液： 将microRNA-130a冻存粉瞬时离心， 溶于去RNA酶 水中， 配制成0.1mg/mL的RNA溶液。 0024 实施例1 将乙醇和硅烷偶联剂混合8s， 制得偶联剂混合液 （体积分数为4%） ； 将镁合金试片 （镁合 金试片需利用金相砂纸由800目打磨到2000目， 依次用丙酮、。
18、 无水乙醇除去表面油污， 后在 去离子水中超声清洗， 晾干备用） 浸入偶联剂混合液中， 得到改性镁合金试片； 将改性镁合 金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液 （将0.1mg/mL的依维莫司溶液和1mg/mL的壳聚糖溶液按 照体积比为0.8:10的比例进行混合得到） 中， 以4cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试 片， 提拉次数为3次， 烘干 （温度为35， 时间为22h） 后得到担载药物纳米颗粒的镁合金支 架； 将改性镁合金试片浸入microRNA-130a/壳聚糖溶液 （将0.1mg/mL的microRNA-130a溶液 和1mg/mL的壳聚糖溶液按照体积比为0.8:10的比例进行混合得到。
19、） 中， 以4cm/min的恒定速 度垂直提拉改性镁合金试片， 提拉次数为3次， 烘干后得到担载基因纳米颗粒的镁合金支 架。 0025 实施例2 将乙醇和硅烷偶联剂混合12s， 制得偶联剂混合液 （体积分数为6%） ； 将镁合金试片 （镁 合金试片需利用金相砂纸由800目打磨到2000目， 依次用丙酮、 无水乙醇除去表面油污， 后 在去离子水中超声清洗， 晾干备用） 浸入偶联剂混合液中， 得到改性镁合金试片； 将改性镁 合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液 （将0.1mg/mL的依维莫司溶液和1mg/mL的壳聚糖溶液 按照体积比为1.2:10的比例进行混合得到） 中， 以6cm/min的恒定速度垂。
20、直提拉改性镁合金 试片， 提拉次数为5次， 烘干 （温度为45， 时间为26h） 后得到担载药物纳米颗粒的镁合金支 说 明 书 3/5 页 5 CN 107875457 A 5 架； 将改性镁合金试片浸入microRNA-130a/壳聚糖溶液 （将0.1mg/mL的microRNA-130a溶液 和1mg/mL的壳聚糖溶液按照体积比为1.2:10的比例进行混合得到） 中， 以6cm/min的恒定速 度垂直提拉改性镁合金试片， 提拉次数为5次， 烘干后得到担载基因纳米颗粒的镁合金支 架。 0026 实施例3 将乙醇和硅烷偶联剂混合10s， 制得偶联剂混合液 （体积分数为5%） ； 将镁合金试片 。
21、（镁 合金试片需利用金相砂纸由800目打磨到2000目， 依次用丙酮、 无水乙醇除去表面油污， 后 在去离子水中超声清洗， 晾干备用） 浸入偶联剂混合液中， 得到改性镁合金试片； 将改性镁 合金试片浸入依维莫司/壳聚糖溶液 （将0.1mg/mL的依维莫司溶液和1mg/mL的壳聚糖溶液 按照体积比为1:10的比例进行混合得到） 中， 以5cm/min的恒定速度垂直提拉改性镁合金试 片， 提拉次数为4次， 烘干 （温度为40， 时间为24h） 后得到担载药物纳米颗粒的镁合金支 架； 将改性镁合金试片浸入microRNA-130a/壳聚糖溶液 （将0.1mg/mL的microRNA-130a溶液 和。
22、1mg/mL的壳聚糖溶液按照体积比为1:10的比例进行混合得到） 中， 以5cm/min的恒定速度 垂直提拉改性镁合金试片， 提拉次数为3次， 烘干后得到担载基因纳米颗粒的镁合金支架。 0027 测试例 CCK8检测 取生长状态良好的对数生长期的细胞， 每孔按410 3 个接种至96 孔板中， 每组设置 6个复孔， 置于细胞培养箱中培养， 待细胞转染和加药物处理， 继续培养48h 后， 弃含药培养 基， 每孔加入新鲜配制的含10L 的毒性检测液CCK8， 置于培养箱中继续培养4h 后， 用酶 标仪测波长为450 nm 的OD 值。 实验重复3次， 取实验结果的平均值作为最终实验结果。 将 mi。
23、croRNA-130a 的模拟序列、 对照序列及对应的表征载基因纳米粒分别加入细胞中， 检测 对细胞的毒性， 经分析， 转染模拟序列组 （miR-130a mimic） 与转染模拟序列对照组 （miR- 130a NC） 比较， 没有统计学差异 （P0.05） ； 转染模拟序列与表征载基因纳米粒组 （ miR- 130a mimic+nano-particles） 与转染模拟序列对照与表征载基因纳米粒组 （miR-130a NC+ nano-particles） 比较， 没有统计学差异 （P0 .05） ； 表征载基因纳米粒组 （nano- particles） 与对照组 （control） 。
24、比较， 有统计学差异 （p0.05） 。 0028 细胞周期检测 取生长状态良好的对数生长期的细胞， 每孔按410 3 个接种至12 孔板中， 每组设置 3 个复孔， 置于细胞培养箱中培养， 待细胞转染和加药物处理， 继续培养48h 后， PBS 洗细 胞两次， 加70%乙醇固定， 用流式检测仪检测细胞周期。 将microRNA-130a 的模拟序列、 对照 序列及对应的表征载基因纳米粒分别加入细胞中， 检测对细胞周期的影响， 经分析， 各组对 细胞周期的差异影响不大， 表征载基因纳米粒、 表征载基因纳米粒与对照序列、 表征载基因 纳米粒与模拟序列的加入对G1/S 期的有一定的影响， 但不显著。
25、。 0029 细胞凋亡检测 取生长状态良好的对数生长期的细胞， 每孔按410 3 个接种至12 孔板中， 每组设置 3 个复孔， 置于细胞培养箱中培养， 待细胞转染和加药物处理， 继续培养48h 后， PBS 洗细 胞两次， 用Annexin V/PI 检测试剂盒， 用流式检测仪检测细胞凋亡。 将microRNA-130a 的 说 明 书 4/5 页 6 CN 107875457 A 6 模拟序列、 对照序列及对应的表征载基因纳米粒分别加入细胞中， 检测对细胞凋亡的影响， 经分析， 表征载基因纳米粒、 表征载基因纳米粒与对照序列、 表征载基因纳米粒与模拟序列 的加入细胞凋亡数量增加。 0030。
26、 以上详细描述了本发明的优选实施方式， 但是， 本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节， 在本发明的技术构思范围内， 可以对本发明的技术方案进行多种简单变型， 这 些简单变型均属于本发明的保护范围。 0031 另外需要说明的是， 在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征， 在不矛 盾的情况下， 可以通过任何合适的方式进行组合， 为了避免不必要的重复， 本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。 0032 此外， 本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合， 只要其不违背本 发明的思想， 其同样应当视为本发明所公开的内容。 说 明 书 5/5 页 7 CN 107875457 A 7 。