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用于牙科修复的骨移植物以及复合生物材料
    发明领域 本发明涉及骨移植物和的生物复合材料， 其由含有磷酸三钙颗粒和可吸收聚合物 或共聚物的基础材料制成。 本发明尤其涉及用于在牙科修复过程中加速和改善骨以及软组 织损伤痊愈的方法和复合材料。
     背景技术 骨植入物的稳定性很大程度取决于其内生性能。为了使人工植牙起作用， 颌骨内 应当有足够的骨， 且该骨应当坚固至足以固定和支撑植牙。当上颌骨或下颌骨不具备足够 或合适的深度或厚度时， 牙科修复中采用移植以实现与人工植牙的安全整合。常规的移植 物包括患者自身的骨 ( 自体移植 )、 来自尸体的处理过的骨 ( 同种异体移植 )、 牛骨或珊瑚 ( 异种移植 )、 以及合成的类骨或仿骨材料。
     在典型的程序中， 牙医或口腔外科医生创建一个大的龈瓣， 以暴露出移植部位的 颌骨， 在现有的骨内和骨上安装一些嵌段移植物和高嵌体移植物， 并最终采取措施以排除 不需要的感染。然后将牙龈在该部位上缝合， 该移植部位需要数周或数月才能痊愈。痊愈 涉及一连串复杂的自适应细胞反应， 例如分化、 迁移、 吸附、 增殖、 细胞外基质合成以及最终 的矿化作用。然而， 移植物或植入物整合入周围骨的骨整合过程极少为人所知。骨诱导性 和骨生成涉及众多的生长因子， 并且据称有许多其他的分子参与这些过程。
     骨形态发生蛋白 (BMP) 是唯一已知的能够异位诱导骨形成的生长因子。补充剂 量的 BMP 通过诱导未分化的间充质细胞分化为成骨细胞， 促进骨痊愈。然而， 骨移植物和 植入物会产生非常类似自然的有生命力的带血管骨。US-A 547 8237(Ishikawa) 公开了一 种涂覆有羟磷灰石层的植入物， WO 02/078759(Stratec 医学公司 ) 公开了一种具有多孔 金属氧化物层的植入物， 该多孔金属氧化物含有非晶形的和纳米晶体磷酸钙和羟磷灰石， WO 02/085250(KERAMED 公司 ) 公开了一种植入物， 其中， 一可吸收的磷酸钙相的涂覆层含 有粘着蛋白和信号蛋白， 例如骨涎蛋白 (BSP)、 骨形态发生蛋白 (BMP)、 纤连蛋白、 骨桥蛋 白 (OPN)、 ICAM-1、 VCAM 及其衍生物。其他这一类型的移植物和植入物均在 EP 1 166 804 A2(Merck， Darmstadt) 和 WO 99/08730( 儿童医学中心有限公司 ) 中得以描述。DE 100 37 850 A1(Jenissen H) 和 WO 03/059407 A1(Straumann 控股公司 ) 描述了用泛素或转化生 长因子 (TGF) 或全身激素例如骨抑制、 骨生成和骨生长蛋白 (OGP) 处理过的移植物或植入 物。US 7,229,545B2(Biomet 德国公司 ) 公开了由经磷酸钙矿化的胶原基质制成的类骨涂 层， EP 1 442 755 A1(Depuy 用品 ) 公开了一种含有骨生成蛋白 OP-1、 BMP-7 和非胶原性骨 基质蛋白的生物活性陶瓷涂层。此外， 骨生成活性已被报道为纤维母细胞生长因子 (FGF)、 转化生长因子 -β(TGF-β)， 血小板衍生生长因子 (PDGF)、 胰岛素生长因子 (IGF) 以及前述 物质的家族成员。
     WO 2005/104988(Armbruster 等 ) 要求保护采用低糖基化人 rBSP 处理过的植入物 和骨修复基质。 该植入物由钛、 锌、 陶瓷、 金属合金或不锈钢制成， 并可用非晶形的或晶体羟 磷灰石和 / 或磷酸钙涂覆。然而， 这些仿骨涂层具有随时间推移容易从基体松开、 影响植入
     物长期稳定性的缺点。
     WO 03/047646( 芬兰坦佩雷 Inion 公司 ) 公开了能够塑造为医疗植入物的骨移植 物。 该移植物或植入物由一基础材料制成， 该基础材料包括可吸收聚合物或共聚物基质， 以 及 N- 甲基 -2- 吡咯烷酮 (NMP)。Reichhardt 等在 《European Cells and Materials(2006， 11(2) ： 27f)》 中描述了一种生物复合材料， 该生物复合材料含有 β- 磷酸三钙 (β-TCP) 颗 粒， 该颗粒涂覆有聚羟基乙酸和聚乳酸的共聚物。该生物复合材料可通过与 N- 甲基 - 吡咯 烷酮混合制成可模塑的， 以便于放置。 Nair 等在 《J.Biomater.Appl.(2006， 20 ： 307-24)》 中 公开了牙科移植物和植入物， 其中， 通过聚羟基乙酸 - 聚乳酸共聚物的热融合， 使 β-TCP 颗 粒聚合在一起。该 β-TCP 颗粒描述为， 抑制间充质干细胞分化和增殖为成骨细胞， 并抑制 骨的愈合。Wang 等在 《J.Orth.Res.(2002， 20 ： 1175ff)》 中也描述了这样一种对金属磨损 颗粒的抑制， 以及对处理过的和大的表面区域的抑制。
     US 6,458,763(Peterson 等 ) 要求保护一种用于修复受损或患病的骨和软骨的生 物活性组合物。该生物活性组合物通过一载体施用， 该载体包括一药学上可接受的基体和 生理矿物填料， 例如磷酸三钙、 羟磷灰石、 石膏等。当在大鼠颅骨的顶骨隆凸或邻近顶骨隆 凸处钻孔， 并在 14 天内使用渗透泵将该生物活性组合物泵至该颅骨缺陷位置时， 随后在体 内观察到钻孔四周的骨组织生长减缓。 显然， 该施药的方法以及组合物并不适于牙科修复。 WO 94/13310( 等 ) 要求保护一种含有竞争肽作为活性组分的组合物， 该 竞争肽看起来似乎能够阻止金黄色葡萄球菌粘附到骨组织上， 并阻止骨髓炎的发生 (Ryden 等， 1989， Eur.J.Biochem.184 ： 331f)。
     尽管现有技术提出这样一个问题， 即牙科植入物往往导致称为种植体周围炎的牙 周问题， 该种植体周围炎由在外科手术中或患者未能遵守正确的口腔保健程序所诱导的感 染所引起。 尽管种植体周围炎可通过在外科手术之前或之后的数天内使用一系列抗生素或 特殊的口腔漱液来进行治疗， 但令人期望的是， 可促进伤口及软组织愈合的以及种植体周 围炎的预先治疗。无菌性松动、 炎症反应和骨内植入物的长期稳定性仍是一个问题。除了 生物活性涂层之外， 在外科手术和骨整合之间仍然存在一段相当长的时间， 直到骨移植物 和骨内的牙齿植入物可耐受典型的压力、 剪切力和张力。
     本发明的一个具体目的是提供一种允许简易放置的移植材料， 以及用于在牙科修 复过程中促进骨头和软组织痊愈的方法和组合物。
     发明内容 以上目的已经由权利要求 1 所要求保护的生物复合材料达到。从属权利要求中公 开了本发明的其他实施方式。
     本发明用于处理骨缺陷和骨新生的骨移植物是一种含有可降解聚合物和 β- 磷 酸三钙颗粒的组合物， 并经由以下步骤获得 ：
     提供一种骨诱导性混合物， 所述骨诱导性混合物为一种分散剂或溶液， 其基于具 有至少一个含氮碱基的有机化合物， 以及生理有效量的低糖基化重组人 BSP， 该重组人 BSP 在非变性条件下获得， 其中所述低糖基化重组人 BSP 在所述骨诱导性混合物中作为盐或复 合物存在， 这与存在于人血清， 以及， 任选地， 药学上可接受赋形剂或载体中的常规人 BSP 相比， 可降低对钙、 羟磷灰石和补体因子 H 的亲和力 ；
     基于 β- 晶形的二磷酸三钙 (Ca3(PO4)2) 颗粒， 提供一种骨传导性混合物， 所述颗 粒涂覆有生物可降解聚合物或共聚物以及， 任选地， 药学上可接受的赋形剂或载体， 所述骨 传导性混合物为可模塑的和可成形的， 并且当通过手术或牙科修复放置时， 迅速在原位硬 化； 以及
     在放置不久之前或放置期间， 将所述骨诱导性混合物和所述骨传导性混合物结 合， 以获得骨移植材料， 所述骨移植材料促进骨修复以及受损或患病组织和病变的痊愈。
     在本发明的第二个方面， 所述骨诱导性人 BSP 为在无血清条件下生长的真核细胞 中表达并获得的低糖基化人 BSP。
     在本发明的第三个方面， 所述低糖基化人 BSP 从初乳或母乳中获得。
     本发明所使用的有机化合物优选为具有至少一个环状含氮碱基。 所述有机化合物 可优选为分散剂和所述生物可降解聚合物或共聚物的塑化剂， 并可选自 N- 异丙基吡咯烷 酮、 N- 甲基嘧啶、 N- 乙基嘧啶、 N- 甲基吡咯烷酮 (1- 甲基 -2- 吡咯烷酮 )、 N- 乙基吡咯烷酮、 N- 丙基吡咯烷酮、 N， N- 二乙基 -1， 4- 丁二胺、 1-(2- 氨乙基 )- 哌嗪、 2-(1- 吡咯烷基 ) 乙胺、 4- 氨基 -2- 甲氧基 - 嘧啶、 2- 二甲氨基 - 乙醇、 1-(2- 羟乙基 )- 哌嗪、 4-(2- 羟乙基 )- 吗 啉、 2- 巯基嘧啶、 2- 巯基苯并咪唑、 N， N- 二甲基 -1， 3- 丙二胺、 4-(2- 氨乙基 )- 嘧啶， 2- 氨 基 -6- 甲氧基苯并噻唑、 4-( 氨乙基 ) 吡啶、 N， N- 二烯丙基 - 三聚氰胺、 3- 氨基 -1， 2， 4- 三 唑、 1-(3- 氨丙基 )- 咪唑、 4-(2- 羟乙基 )- 吡啶、 1-(2- 羟乙基 )- 咪唑、 3- 巯基 -1， 2， 4- 三 唑。
     在本发明的另一方面， 所述生物可降解聚合物或共聚物选自聚乙交酯、 聚 (L- 丙 交酯 -co- 乙交酯 )、 聚 (D， L- 丙交酯 -co- 乙交酯 )、 聚 (L- 丙交酯 )、 聚 (D， L- 丙交酯 )、 聚 (L- 丙交酯 -co-D， L- 丙交酯 )、 聚己内酯、 聚 (L- 丙交酯 -co- 己内酯 )、 聚 (D， L- 丙交 酯 -co- 己内酯 )、 聚三亚甲基碳酸酯、 聚 (L- 丙交酯 -co- 三亚甲基碳酸酯 )、 聚 (D， L- 丙交 酯 -co- 三亚甲基碳酸酯 )、 聚对二氧环己酮、 聚乳酸聚合物、 聚羟基乙酸聚合物、 聚乳酸和 聚羟基乙酸的共聚物、 聚羟基丁酸、 聚羟基戊酸聚对二氧环己酮、 聚原酸酯、 聚碳酸酯、 聚酪 氨酸碳酸酯、 聚原碳酸酯聚亚烷基草酸酯、 聚亚烷基琥珀酸酯、 聚 ( 羟基丁二酸 )、 聚 ( 顺丁 烯二酸酐 )、 多肽、 聚缩酚酸肽、 聚乙烯醇、 聚酰胺酯、 聚酰胺、 聚酸酐、 聚氨酯、 聚磷腈、 聚氰 基丙烯酸酯、 聚富马酸酯、 聚 ( 氨基酸 )、 改性多糖、 改性蛋白以及它们的共聚物、 三元共聚 物或以上各物质的组合或混合物或共混聚合物。
     本发明的另一方面涉及在牙科修复中使用的所述骨传导性组分， 其可优选含有经 涂覆的磷酸三钙 (Ca3(PO4)2) 颗粒， 该颗粒直径为 300 至 800 微米， 优选为 400 至 700 微米。 本发明的生物复合材料可优选含有体积百分比大于 50％的 β- 磷酸三钙颗粒、 体积百分比 为 10％至 40％的聚合物基体、 体积百分比为 0.5％至 10％的第一骨诱导性混合物， 所述聚 合物基体含有一种或多种生物可降解聚合物和共聚物， 所述第一骨诱导性混合物增加生物 复合材料的可塑性和工作性能， 并作为 BSP 的溶剂或分散剂。每毫升所述复合材料中含有 1 至 200 微克的人 rBSP。优选地， 所述骨诱导性混合物在硬化之前每毫升含有 1 至 200 微 克的人 rBSP。
     根据本发明， 所述生物可降解聚合物可为聚乳酸和聚羟基乙酸的共聚物， 其组成 为含有 50％～ 80％的乳酸和 20％～ 50％的羟基乙酸。所述聚乳酸 - 聚羟基乙酸共聚物可 具有介于约 25,000 至约 1,000,000 之间的平均分子重量。所述骨移植材料应优选在硬化后具有介于 1GPa 至约 100Gpa 之间的杨氏模量。
     本发明的另一个方面是制备一种具有骨诱导和骨传导性能的骨移植物的方法， 包 括以下步骤 ：
     提供一种骨诱导性混合物， 其为一种分散剂或溶液， 该分散剂或溶液基于具有至 少一个含氮碱基的有机化合物和生理有效量的低糖基化重组人 BSP ；
     提供一种骨传导性混合物， 其基于 β 晶形的磷酸三钙 (Ca3(PO4)2) 颗粒， 该颗粒涂 覆有可生物降解的聚合物或共聚物 ； 并且
     将所述骨诱导性混合物和所述骨传导性混合物结合， 以获得一复合材料， 该复合 材料最初为可模塑和可成形的， 并且当通过手术或牙科修复放置时， 在原位硬化。
     一种提供具有促进伤口或软组织损伤愈合性能的骨移植材料的方法， 包括以下步 骤： 将所述骨移植材料和分散剂或溶液混合， 所述分散剂或溶液基于具有至少一个含氮碱 基的有机化合物和生理有效量的低糖基化重组人 BSP。
     本发明进一步包括一种促进伤口和软组织损伤痊愈的方法， 该方法包括以上所定 义的生物复合材料的施用和使用。 该施用和使用可包括将所述生物复合材料成型至一植入 装置内， 该植入装置选自组织支架、 颗粒骨移植替代材料、 双相骨软骨植入物、 承重骨植入 物、 非承重以及低承重植入物或固定装置、 钉、 螺钉、 以及薄层。 本发明进一步延伸至具有使伤口愈合特性的可吸收的聚合物组合物， 包括可吸 收聚合物或共聚物的聚合物基质、 N- 甲基 -2- 吡咯烷酮 (NMP) 以及药学上有效剂量的人 rBSP， 优选地设计为缝合材料。 本发明还延伸至治疗的方法， 其中， 在手术前或手术后将 NMP 和人 rBSP 的溶液添加或施加至所述植入物或伤口。
     本发明的原理对植入物尤其有用， 该植入物包括基体、 由间隔套管底部或基座元 件以及间隔套管顶部或环元件组成的间隔组件。所述基体具有一内部钻孔， 该内部钻孔具 有内螺纹。所述基体在邻近较高的边缘或末端具有一凹处， 该凹处直径大于所述钻孔的直 径， 以提供一止动肩部。为提供可阻止轴扭的装置， 所述止动肩部设有均匀地、 环绕地间隔 排列的下凹联锁口袋， 以便可在其上用螺钉固定陶瓷牙。
     附图说明
     现在通过参考附图和实施例对本发明的技术特征和优势进行描述， 其中 ：
     图 1 是用于制备本发明所述生物复合材料的步骤的示意图。
     图 2A-C 是显示制备生物复合材料的照片， 该生物复合材料含有人 rBSP/NMP 和涂 覆有生物可吸收聚合物的 β-TCP 颗粒 ；
     图 3A-B 是手术位置以及本发明的生物复合材料在原位硬化的照片。
     图 4A-D 是放置部位的照片 ( 患者， 女， 73 岁 )， 以及术后 1 天、 3 周的照片 ；
     图 4E-G 是术后 2.5 个月的 X 光照以及 CT 图， 显示在植入和修复之前的状态。
     图 4H-N 是随伤口愈合以及骨再生之后的示例性的修复的照片。
     图 5/01-13 是术后 12 周， 从根据本发明所放置的 rhBSP/TCP- 生物复合材料上取 得的骨头样本 (64 天——长 1.2 厘米 ) 的显微镜图像——使用 Masson-Goldner’ s 三色染 色法或甲苯胺蓝或苏木精配曙红， 将厚度为 2 至 3 微米的组织切片进行染色。
     图 6/01-13 是来自另一 rhBSP/TCP- 生物复合材料植入物的骨头样本 (78 天——长 0.5 厘米 ) 的显微镜图像， 该样本同样取自放置后 12 周——使用 Masson-Goldner’ s三 色染色法或甲苯胺蓝或苏木精配曙红进行制备、 固定和染色。
     图 7/01-09 是第三个组织样本 (59 天——长 0.6 厘米 ) 的显微镜图像， 取自术后 3 个月的 rhBSP/TCP 生物复合材料——使用 Masson-Goldner’ s 三色染色法或甲苯胺蓝或 苏木精配曙红进行制备、 固定和染色。
     本发明具体内容及优选实施方式
     参见图 1， 本发明的所述骨移植物或生物复合材料通过以下步骤获得 ： a) 将基于 β- 磷酸三钙颗粒以及生物可降解聚合物或共聚物的基础材料 (A)， 和 b) 第一组合物 (B) 组合， 该第一组合物 (B) 为含有以下组分的分散剂或溶液 ： (i) 一种或多种具有至少一个含 氮基团的有机化合物， 该有机化合物首先是所述生物可降解聚合物或共聚物的塑化剂， 并 且其次能够和酸性蛋白质形成 pK1 为 4.0 的盐， 以及 (ii) 大体纯的活性人 rBSP ； 并与 (c) 任选地， 药学上可接受的赋形剂或载体混合 ； 获得生物复合材料 (C)， 该生物复合材料 (C) 含有由活性人 rBSP、 具有至少一个含氮碱基的塑化剂、 生物可降解聚合物或共聚物、 以及 β-TCP 颗粒组成的盐， 该生物复合材料为可模塑的， 并且在放置之后迅速在原位硬化。 正如 所提到的， 该可模塑的生物复合材料 (C) 可通过手术或牙科修复放置， 并由于血液和水的 作用， 在放置后迅速原位硬化 (D)。硬化之后， 该硬化的生物复合材料 (D) 含有 β- 磷酸三 钙颗粒支架， 以及包埋于生物可降解聚合物或共聚物之内的活性人 rBSP 的盐。 植入成功的关键仍在于最初的愈合过程。 本发明的骨移植材料是骨诱导性的和骨 传导性的， 此外， 还促进软组织的愈合， 特别是未能被快速重新吸收的受损、 患病连接组织 的愈合。换言之， 该骨移植材料是血管新生的， 但由于已硬化的 β- 磷酸三钙支架的生物重 吸收也可经调整以便与骨生成同步进行， 也产生阻碍该结缔组织的纤维原细胞和细胞进入 的物理屏障。 因此， 本发明的生物复合材料为牙科植入提供早期的物理支撑， 并在为骨矿化 提供内核的同时， 为骨系统的细胞提供支架。此外， 由于其抑制纤维单元， 还促进血管生成 和伤口痊愈。
     本发明的可模塑的生物复合材料在放置之后立即具有物理和机械性能， 这是由于 处于 β- 晶形下的磷酸三钙颗粒涂覆有可生物重吸收聚合物或共聚物， 当可生物重吸收的 聚合物内含有的塑化剂溶释出并进入周围体液 ( 血液、 血清、 水、 ) 中时， 其迅速硬化。
     正如以上所提及的， 根据本发明， 组分 (A) 首先和塑化剂结合， 该塑化剂用于可生 物重吸收的聚合物或共聚物， 以使基础材料可在放置或放置期间模塑。所述塑化剂或分散 剂 (B) 选自具有含氮碱基的一组化合物， 以使其具备类似的功能， 作为酸性糖蛋白的载体 和生理上的共生离子， 该酸性糖蛋白例如人 rBSP， 其 pK1 为 4.0。塑化剂通过将其自身包 埋于聚合物或共聚物的链之间， 将这些链分隔开， 以及通过 “自由体积” 的增长而起作用， 并 通过降低聚合物或共聚物的玻璃化转化点而起作用。本发明适合的塑化剂和生理共生离 子为 ： N， N- 二乙基 -1， 4- 丁二胺、 1-(2- 氨乙基 )- 哌嗪、 2-(1- 吡咯烷基 ) 乙基 - 胺、 4- 氨 基 -2- 甲氧基 - 嘧啶、 2- 二甲基氨基乙醇、 1-(2- 羟乙基 )- 哌嗪、 4-(2- 羟乙基 )- 吗啉、 2- 巯基嘧啶、 2- 巯基苯并咪唑、 特别优选为 N， N- 二甲基 -1， 3- 丙二胺、 4-(2- 氨乙基 )- 吡 啶、 2- 氨基 -6- 甲氧基苯并噻唑、 4-( 氨乙基 ) 吡啶、 N， N- 二烯丙基三聚氰胺、 3- 氨基 -1， 2， 4- 三唑、 1-(3- 氨丙基 )- 咪唑、 4-(2- 羟乙基 )- 吡啶、 1-(2- 羟乙基 )- 咪唑、 3- 巯基 -1， 2， 4- 三唑。适合的化合物特性为具有 2 至 14 的 pKa 值， 优选为 5 至 14 的 pKa 值， 最优选为
     5 至 12 的 pKa 值的非反应性基团。所述 pKa 值可从表格中获得。以上所给出的极限值指 的是在 25℃测得的 pKa 值。最优选使用 1- 甲基 -2- 吡咯烷酮 (NMP ＝ CAS 号 ： 872-50-4 ； N- 甲基吡咯烷酮、 1- 甲基吡咯烷酮、 N- 甲基 -α- 吡咯烷酮、 1- 甲基氮杂环戊烷 -2- 酮、 N- 甲 基 -γ- 丁内酯 )， 其已知为可促进体外的成骨细胞成熟， 也可促进体内的骨再生 (Miguel 等， 2006， Europ.Cells & Materials， 11， Suppl.2 ： 5)。然而该活动的潜在生物机制仍未可 知。
     本发明的生物可吸收的及生物相容的聚合物优选为聚 ( 丙交酯 -co- 乙交酯 )PLGA 或聚 ( 乳酸 -co- 羟基乙酸 ) 的酸性共聚物。 通过将羟基乙酸和乳酸的环状二聚物 (1， 4- 二 氧六环 -2， 5- 二酮 ) 开环共聚化的方式， 合成 PLGA。 在聚合反应期间， 连续的羟基乙酸或乳 酸单体通过酯键连接， 产生一直链、 脂肪族聚酯的产物。所获得的 PLGA 的不同类型， 取决于 用于聚合反应的丙交酯和乙交酯的比例。最优选为 PLGA 75 ∶ 25， 其定义是由 75％乳酸和 25％羟基乙酸组成的共聚物。PLGA 玻璃化转化点在 40℃至 60℃的范围内， 其同样取决于 所用塑化剂或 NMP 的量。与乳酸 ( 聚丙交酯 ) 以及羟基乙酸 ( 聚乙交酯 ) 的均聚物不同， PLGA 通过例如四氢呋喃、 丙酮、 乙酸乙酯的溶液溶解， 并因此可轻易涂覆于特定的材料， 例 如 β- 磷酸三钙颗粒之上。 在有水存在时， PLGA 通过其酯键水解而降解， 以产生乳酸单体和羟基乙酸单体， 这 些单体可进入体内的各个代谢途径， 以使 PLGA 在生物材料应用中不具有系统毒性。 PLGA 降 解所需的时间部分取决于单体的比例。PLGA 50 ∶ 50 可于约两个月内在体内迅速降解， 而 端基带有酯基的聚合物具有较长的降解半衰期。已经使用由碳 -14 和氚标记的聚合物制成 的植入物， 频繁地在大鼠和其他哺乳动物中， 对乳酸 (PLA)、 羟基乙酸 (PGA) 的纯聚合物之 间的降解速率的差异， 以及这两种物质的共聚物的各种比例进行研究。 从植入的区域、 来自 肝、 脾、 肾、 肺的组织以及当然从实验中每隔一段时间就收集的尿液和排泄物中所存在的放 射性， 来计算不同聚合物和共聚物的半衰期。聚合物和共聚物的半衰期在 100％ PGA 时为 5 个月， 在 50 ∶ 50PGA ∶ PLA 时， 减少为一周， 并在 100％ PLA 时迅速增加至 6.1 个月。在软 组织或骨中未观察到降解的速率有任何差异。 尿、 排泄物、 或其他组织样品中未检测出任何 强放射性。从这些研究可见， 可得出这样的结论 ： 通过将 PLA 和 PGA 的组成在 75％至 100％ 的 PLA， 伴随相应的 25％至 0％的 PGA 之间改变， 可最佳地控制植入物的降解速率。这将为 植入物提供 2 周至 6 个月的半衰期。因此， 最优选为这些生物可降解聚合物。
     另一种生物吸收性聚酯为聚己内酯， 其由于降解速度比 PLGA 的降解速度更慢， 可 TM 用于长期可植入装置。聚己内酯 ( 商品名 ： Resilon ) 已被研究作为用于组织修复的支架， 以及用于根管填充的牙科修复中。通常， 所述生物可降解聚合物可选自聚乙交酯、 聚丙交 酯、 聚己内酯、 聚三亚甲基碳酸酯、 聚羟基丁酯、 聚羟基戊酯、 聚二氧环己酮、 聚原酸酯、 聚碳 酸酯、 聚酪氨酸碳酸酯、 聚原酸碳酸酯、 聚亚烷基草酸酯、 聚亚烷基琥珀酸酯、 聚 ( 羟基丁二 酸 )、 聚 ( 顺丁烯二酸酐 )、 多肽、 聚缩酚酸肽、 聚乙烯醇、 聚酰胺酯、 聚酰胺、 聚酸酐、 聚氨酯、 聚磷腈、 聚氰基丙烯酸酯、 聚富马酸酯、 聚 ( 氨基酸 )、 改性多糖、 改性蛋白以及它们的共聚 物、 三元共聚物或以上各物质的组合或混合物或共混聚合物。所述聚合物基质优选地选自 聚乙交酯、 聚 (L- 丙交酯 -co- 乙交酯 )、 聚 (D， L- 丙交酯 -co- 乙交酯 )、 聚 (L- 丙交酯 )、 聚 (D， L- 丙交酯 )、 聚 (L- 丙交酯 -co-D， L- 丙交酯 )、 聚己内酯、 聚 (L- 丙交酯 -co- 己内 酯 )、 聚 (D， L- 丙交酯 -co- 己内酯 )、 聚三亚甲基碳酸酯、 聚 (L- 丙交酯 -co- 三亚甲基碳酸
     酯 )、 聚 (D， L- 丙交酯 -co- 三亚甲基碳酸酯 )、 聚对二氧环己酮及其共聚物、 三元共聚物或 以上各物质的组合或混合物或共混聚合物。
     本发明的骨传导性结构组分优选为磷酸三钙 (TCP)。如果 TCP 支架降解得太快， 纤维单元会在未完成骨修复的情况下穿过开口。如果支架内的孔或路径太少， 骨再生会非 常缓慢。TCP 的纯度对骨形成和生物相容性都会造成影响， β 晶形的 TCP(β-TCP) 最优选 作为支架。鉴于所述支架可允许主成骨细胞和间充质细胞的进入， 优选平均孔径为约 200 至 400 微米， 并且这些孔通过 100 至 200 微米的路径相互连接。然而， 多孔 β-TCP 具有较 弱的机械特性， 并在体内迅速降解。这在一定程度上意味着弱的机械特性。因此， 本发明的 β-TCP 优选为在可获得纯相 β- 晶形的温度烧结， 以避免太快降解。因此， 根据本发明， 所 述支架优选为细小的纯相 β-TCP 颗粒， 其涂覆有生物可降解聚合物， 并形成为可与约 100 至 5000 微米的涂覆有聚合物的 TCP 颗粒更好地连接， 优选为 200 至 700 微米， 以便填充较 小的骨头空腔， 并优选为 500 至 1500 微米， 以便填充较大的骨头空腔， 例如切除后的空腔。 非常大的涂覆有聚合物的 β-TCP 颗粒可用作骨传导性支架， 该骨传导性支架用于在整形 外科和改良手术中较大的骨置换。
     通过将活性人 rBSP 和包埋于所述生物可吸收聚合物内的塑化剂混合， 该生物可 吸收聚合物上涂覆在 β-TCP 支架颗粒上， 所述活性人 rBSP 被整合入仿骨材料， 其中， 即使 在硬化之后， 活性人 rBSP 仍可在骨传导性环境中表现出其骨诱导活性。由于所用活性人 rBSP 优选为低糖基化的， 并包埋于聚合物或共聚物中， 其可通过补体因子 H 进一步避免失 活， 并形成骨矿化内核。所述人 rBSP 通过塑化剂进一步包埋于生物可吸收性聚合物和 / 或共聚物中， 并因此随着生物可吸收性聚合物或共聚物的生物再吸收而释放。总而言之， 人 rBSP 的长期活性可通过以下方式获得 ： (i) 具有含氮碱基的生理笼形包合物或复合盐的 形成 ； (ii) 通过其物理掺入在所述生物可吸收性聚合物或共聚物中， 使其远离成熟前的矿 化， 并结合至补体因子 H ； 和 (iii) 通过低糖基化作用成为低糖基化人 rBSP， 与完全糖基化 的来自常规骨细胞的人 BSP 相比， 被补体因子 H 导致失活的效率更低。因此， 所述重组人 rBSP 应当从在无血清培养基中培养的细胞中获得。 尽管如此， 所述人 rBSP 仍然是骨矿化和 磷酸钙沉淀的体内的核。 因此， 本发明包括一种移植组合物， 其含有用于修复受损骨以及结 缔组织的人 rBSP。 如导言中所提到的， 与骨钙蛋白和骨粘连蛋白相比， 人骨涎蛋白是骨细胞 外基质中主要的非胶原蛋白。
     进一步设想， 通过连接蛋白和连接蛋白标记， 将所述骨活性 rBSP 连接至所述支架 或聚合物 - 支柱。然而， 人 BSP 不含有半胱氨酸残基。人 BSP 具有高的负电荷度 (Pi ＝ 4.0)， 以便最初使强离子交换 HPLC 应用至分离出的 BSP 复合物。塑化剂的碱基可从而产生 类似的结合效应。
     然而发明人不希望受任何理论之限制， 注意到， 本发明组合物中的酸性人 rBSP 具 有骨诱导性和生物矿化效应， 并提高成骨细胞向骨移植材料的粘附和趋化性迁移。我们的 研究发现支持， 人 rBSP 和碱性塑化剂的笼形包合物或复合盐在包含于生物可降解聚合物 或共聚物中， 并任选地具有支撑体或赋形剂时， 具有协同活性， 尤其是在软组织和伤口愈合 方面。 每种组分都具有生物活性， 而结合则产生协同有效的血管再生和骨诱导效应。 所提供 的格林形式是基于生物可降解聚合物和矿物支撑颗粒的混合物， 其能够很容易就在手术部 位施用， 其中， 血管生成和骨生成活性在一限定的共同顺序中都是必需的。 有充足的证据表明， 人 rBSP 不仅仅有助于伤口愈合和骨生成。它也在牙科手术过程中抑制炎症和种植体周 围炎。本发明的生物复合材料中的手术 TCP 支架最终提供了与纤维连接及内皮植入相对的 临时机械屏障， 以便手术生物复合材料和人 rBSP 能完全产生其骨诱导效应并促进骨再生。 在该连接中， 需要所述生物可降解聚合物， 以便包埋人 rBSP， 并以活性形式缓慢释放。
     在体内， BSP 的表达与初始骨骼矿化相一致， 且当 BSP 涂覆于股骨植入物时， 显示 BSP 为骨诱导性的 (OToole GC 等， 2004， J Orth Res 22 ： 641-646.)。同样的效应也已报道 发生在骨生成蛋白 OP-1、 BMP-7、 各种其他非胶原骨基质蛋白、 纤维原细胞生长因子 (FGF)、 转化生长因子 -β(TGF-β)、 血小板衍生生长因子 (PDGF)、 胰岛素生长因子 (IGF) 及以上所 述的家族成员。 然而， 由于这些生物活性分子的骨整合活性既不能在体外测量， 也不能在体 内测量， 所以它们的骨活性仅仅是一种推测。
     然而， 本发明的生物复合材料能够被直接放置， 并在提取部位， 或者在需要骨再生 和软组织痊愈的位置硬化。在提取量较小的情况下， 半硬化的生物复合材料可在周围齿龈 的水平进行切割， 以便获得光滑的表面， 其在软组织和骨移植材料之间仅具有一最小间隙 ； 参见图 4A-C。当所述软组织连接至所述骨移植材料时， 所述骨移植材料随后在一天或两天 之内痊愈 ( 见图 4D)。最终， 齿龈内的龈瓣可更小， 并且整个手术对患者的负担更轻。如果 有更小的牙科植入物， 甚至不需要植入位点上缝合齿龈 ； 见图 4C。 随着破骨细胞和成骨细胞对骨基质的吸附， 在内皮细胞的粘附、 传播和定位中， 以 及血管形成中进一步涉及 BSP(Bellahcene 等， 2000， Circ.Res.86(8)， 885-91)。然而， 在植 入位点的纤维连接或内皮植入都不是想要得到的， 其中， 需要附加的骨以便对骨内植入物 的物理支撑。根据本发明， 这通过在生物复合材料内的 β-TCP 颗粒来实现。然而， 所述人 rBSP 抑制炎症反应并调节所涉及的蛋白质的释放， 例如白介素 IL-6、 IL-8、 RANKL、 骨保护 素等等。
     本发明提供了一种新颖的骨移植物和复合材料， 其促进间充质干细胞分化为成骨 细胞、 诱导成骨细胞迁移至所需骨再生的部位和成骨细胞增殖、 并最终为骨矿化提供内核。 许多蛋白质都已经因其骨生成特性而得到研究， 尤其是胶原蛋白、 纤连蛋白、 玻连蛋白和天 然胞外基质蛋白的混合物 (Sodek 等， J， 2000， Peridontol.， 24 ： 99-126 ； Meyer U 等， 1998， J Mater Sci-Mater Med 9 ： 301-307 ； Lacouture M 等， 2002， J Bone Miner.Res 17 ： 481-492 ； SalihE 等， 2002， Biochem J.364 ： 465-474)。通过对 I 型胶原蛋白、 纤连蛋白和玻连蛋白 在支撑机械应变的成骨细胞的粘附方面的比较， 显示当可获得的用于连接的分子数目有限 时， 调节抗变阻力的主要因素是胞外整合蛋白基质连接的数目 (Lacouture ME 等， 2002 J Bone Miner Res 17 ： 481-49220)。因此， 可预计本发明的生物复合材料中也加入有这些蛋 白。
     现有技术中， 在初步愈合过程中没有任何方式可获得生理上的改进 (Lekic P 等， 1996， Anat Rec 244 ： 50-58)。这是因为仿生移植材料的大表面积会导致延迟的细胞增 殖。另外也没有任何可用于 BSP 施用的方法或组合物， 以便其能在体内发挥其生物功能， 并且不会由于补体因子 H 或矿化作用而失活， 而 BSP 在体内沉积代表了骨形成的第一步 (Riminucci M 等， 2003， Braz J Med Biol Res 36 ： 1027-1036)。此外， 发现 BSP 在骨修复 中是骨诱导性的， 并可完成严重缺陷的愈合 (Wang ML 等， 2002， J Orth Res 20 ： 1175-1184 ； Wang J 等， 2004 J Bone Miner.Res.19 ： 221 摘要 )。因此， 已经通过诱导剂进行努力以诱
     导 BSP 的表达 (Chou 等， 2005， Biomaterials 26 ： 285-29529)。然而， 结果表明这些努力并 不太成功。
     可以推断， BSP 进行着某种细胞外熟化， 这会减少其在间充质干细胞和成骨细胞 上可能的分化和增殖。一些研究组织甚至已经设想 BSP 保护滋养层和 BSP 产生的肿瘤细 胞不受免疫系统的攻击， 由于 BSP 与高吸附性的补体系统的因子 H 结合， 该因子 H 已知可 限 制 补 体 溶 解 的 替 代 路 径 (Fedarko et al.， J.Biol.Chem.， 200， 275， 16666-16672 ； WO 00/062065)。然而， 已证实 BSP 在体内通过其识别序列精氨酸 - 甘氨酸 - 天门冬氨酸， 特定 结合至整合蛋白受体。RGD 识别序列结合至 α(v)β(3) 整合蛋白受体， 并且由于观察到内 皮细胞的粘着、 传播和定向都由 BSP 介导， BSP 在骨基质形成以及伤口愈合过程中处于核心 的位置。此外， 肿瘤周围的血管形成与肿瘤细胞中的 BSP 表达同时进行 (Bellahcene 等， 2000， Circ.Res.86(8) ： 885ff)。然而， “自由的” BSP 被高亲和力的补体因子 H 所束缚， 令 现有技术组合物的任何施用的 BSP 不能发挥其生理功能。150kDa 的大因子 H 分子使较小 的 BSP(ca.65kDa) 束缚至抗体或受体不能够结合的程度。此外， 因子 H 在血清中过量 ( 每 毫升 0.5 毫克因子 H， 相比之下， 健康人血清每毫升中含少于 20 纳克的 BSP)。
     然而， 我们的数据表明， 低浓度的低糖基化人 rBSP 足以诱导间充质干细胞的分化 和成骨细胞的初步连接。这通过将低糖基化人 rBSP 整合进生物可降解聚合物中来达到目 的， 这使骨细胞的分化和沉降不再受大表面或外来材料的阻碍。 然而， 本发明的低糖基化人 rBSP 仍是强酸性的， 并与羟基以及磷酸钙反应并使反应加快。通过将低糖基化人 rBSP 涂 层溶解在一碱性溶液和用于生物可吸收聚合物的塑化剂中， BSP 蛋白似乎保持在一个能够 发挥较长的生物学功能的状态。最优选地， 低糖基化人 rBSP 被掺入由 β-TCP 颗粒制成的 支架， 其孔优选为直径 10 至 1000 微米， 更优选为 20 至 500 微米， 最优选为 50 至 200 微米。 换言之， 当成骨细胞连接至该移植材料的孔内并实际上在孔内生长时， 可达到骨移植物矿 化的或似骨的骨整合。因此， 孔的直径应当优选为 10 至 1000 微米， 更优选为 20 至 500 微 米， 最优选为 50 至 200 微米。本发明的组合物中优选含有所述低糖基化人 rBSP 的浓度为 1 至 100 微克 / 毫升， 更优选为 10 至 50 微克 / 毫升。
     以下所描述的本发明的例子和实施方式不应被视为对本发明的限制或其他约束， 而只是本质上的示例性的。本发明的保护范围已在所附权利要求中所确定。 具体实施例
     本实验所使用的所有程序均由道德委员会同意， 并遵守赫尔辛基 1964 声明 (NIH 公开号 .86-23， 1985 修订 )。
     实施例 1——制备含骨诱导性人 rBSP 的血管生成混合物
     根 据 Wuttke 等 所 描 述 的 方 法 来 分 离 低 糖 基 化 人 rBSP(Wuttke 等， 2001， Structural characterization of human recombinant and bone-derived bone sialoprotein.J Biol Chem276 ： 36839-36848)。简而言之， 通过 PCR 扩增人 BSP 的完整 cDNA( 不带信号肽 )， 并在游离基因真核表达载体 pCEP-Pu 中进行克隆 (Kohfeldt E 等， Properties of the extracellular calcium binding module of the proteoglycan testican， in FEBS Lets.1997， 414(3)557-61)。 通过脂质体介导的稳定转染进入胚胎肾细 胞株 EBNA-293 或人乳腺癌细胞 MCF-7 内， 引入表达构建体。转染 48 小时后， 在无血清培养基中培养瞬时细胞两天， 使 FCS 中的蛋白质不能够与表达的 rBSP 反应， 也不干扰重组 BSP 的纯化。然后在无血清条件下培养 BSP 表达细胞。通过 SDS-PAGE 和免疫印迹来监控重组 人 BSP 的表达。
     通过 SepharoseTM 柱对 2.5 升转染细胞的无血清培养上层清液进行纯化， 产物为 250μg 同源重组 His-myc-EK-BSP( 人 rBSP)。该人 rBSP 为部分糖基化， 并且在苏氨酸 125 上没有糖基化。人 rBSP 的氨基酸序列在位置 88(NTT)、 161(NCT)、 166(NST) 和 174(NGS) 具 有四个 N- 糖基化位点。全部可识别的 N- 聚糖结构都能够在该重组 EBNA-293 BSP 上找到。 然而， 各结构在总 N- 聚糖中的百分比有所差异。骨中 BSP N- 聚糖的主要比例为三糖苷结 构 (58％ )， 在 EBNA 细胞中为四糖苷结构 (48％ )。通过 MALDA-TOF 质谱分析的方式， 确定 多肽的量， 并通过 PSD-MALDI-TOF 质谱分析的方式， 测定部分多肽的序列。这其中， 人 rBSP 序列 DATPGTG 中的苏氨酸为 O- 糖基化。随着人骨分离出的 BSP， 存在受第三个 O- 糖基化的 影响。而对重组 BSP 来说， 没有第三个糖基化位点。有可能， 该糖基化位点位于 TGLAA-BSP 部分结构。
     从细胞中分离出 250μg 人 rBSP， 将其在无血清条件下培养， 然后冷冻干燥， 并溶 于 5mlN- 甲基吡咯烷酮中， 以获得含有人 rBSP 的碱性溶液 (50μg/mL)， 该溶液具有骨生成 和骨诱导活性。 实施例 2——制备具有骨传导特性的可模塑骨移植物以及生物复合材料
     对于骨移植物和骨传导性材料， 使用可从 DS DENTAL Degradable Solutions 公司 (Schlieren-Zürich， Wagistrasse， Switzerland) 购得的 Easy GraftTM“空间支撑器” 材 料。该生物复合材料含有 β- 晶形的纯磷酸三钙 (TCP) 颗粒。将该含 TCP 材料压实至形成 颗粒， 并且在该实施例中， 采用直径为 500μm 至 630μm、 微孔隙度大于 50％且平均孔径约 5μm 的颗粒部分。为有助于放置， 进一步将该可从商业途径获得的 Easy GraftTM 空间支撑 器材料颗粒涂覆 10μm 厚的生物可降解 PLGA 聚合物涂层， 以通过添加预定量的塑化剂， 使 该硬颗粒材料在放置时为可模塑的。
     实施例 3——制备具有骨诱导性、 骨传导性和骨生成特性的生物复合材料以及空 间支撑器
     本发明的生物复合材料通过用含有 N- 甲基 -2- 吡咯烷酮 (NMP) 和 50 微克 / 毫升 的人 rBSP 的塑化剂溶液， 将涂覆有 PLGA 的 β-TCP 颗粒 (DS DENTAL Degradable Solutions 公司 [Schlieren-Zürich， Wagistrasse， Switzerland] 的 Easy GraftTM“空间支撑器” 材 料 ) 浸浴或浸透 5s 至 1 分钟， 其间轻微摇动， 以使硬化的 TCP 颗粒材料变得可流动， 从包埋 于生物可降解 PLGA 涂层内的多齿状突起的人 rBSP-NMP 复合盐中， 获得液态笼形包合物。 由 于所述生物可降解 PLGA 位于由 TCP 材料组成的表面、 TCP 管道内、 孔内以及进一步位于颗粒 之间的间隙和裂缝中， 所述人 rBSP/NMP 复合盐笼形包合物因此也置于所述颗粒状 β-TCP 材料内。因此， 获得一种生物复合材料， 其含有 β- 晶形的纯磷酸三钙 (TCP) 颗粒、 生物可 降解 PLGA 聚合物和内部含有 NMP 的笼形包合物以及生物活化的人 rBSP。该生物复合材料 在放置时为可模塑的， 并且通过在 2 分钟内将过量 NMP 扩散入水和血液中， 在原位硬化。该 生物复合材料优选为以可使该最终硬化生物复合材料在硬化后每毫升 β-TCP/PLGA 材料 (EasyGraftTM 空间支撑器 ) 中含有大约 20 微克人 rBSP 的比例混合。
     该与颗粒状 TCP 材料的混合可通过注射装置或安瓿在体外进行 ( 见图 2A、 B)， 也
     可当部分 TCP- 材料已用于在原位成型而放置时， 在原位替代 ( 图 2C)。
     实施例 4——手术
     图 4A-K 描述了所述生物复合材料在牙科手术和骨形成中的应用。临床上， 痊愈时 间， 特别是软组织痊愈的痊愈时间缩短了 50％， 并随植入体的活性抑制和组织活化以及伤 口痊愈而完成。与常规的使用 NMP 作为模塑塑化剂的 Easy GraftTM 材料相比， 伤口愈合过 程中的反应次数实际上减半 (50％ )， 且骨材料生长翻倍。采用骨密度测量对采用 BSP/NMP 进行加速的软组织和硬组织愈合进行量化。在移植不久后， 对植入物 ( 生物复合材料 ) 进 行活组织切片检查， 结果表明， 由 BSP 诱导的新形成骨材料与天然骨组织从组织学上可明 显区别， 这证实所观察到的成骨细胞的迅速进入和天然骨矿化过程与所观察到的加速再生 以及天然病变愈合是一致的。
     图 4A 为牙科手术前， 患者 ( 女， 73 岁 ) 的牙齿和骨骼情况的 X 光照图。图 4B 显 示， 放置浸泡过的可模塑的骨移植物 (Easy GraftTM)， 该移植物包括预先形成的人 rBSP/NMB 混合物 ( 每毫升颗粒 TCP/PLGA 含 50 微克人 rBSP)。在最终硬化之前， 除去 ( 切除 ) 过量的 颗粒移植物， 人工将龈瓣压实并无缝合闭合。图 4C 和 4D 显示手术后 1 天和 3 周的临床表 现。注意到， 对年长的患者， 可加速最初伤口痊愈和短周期软组织痊愈。图 4E 和 F 为移植 后 2.5 个月的 X 光照图和 CT 图像， 显示在冠状部位 11 13 HU 中新形成的骨。注意新形成 骨相邻面的水平。图 4G 表明牙科移植物 ( 螺钉 ) 如何放置。图 4H 至 N 示例了后续牙科手 术的步骤， 例如定位装置的放置 (4H)、 出血点的放置 (4I)、 在植入位置 (4K) 对骨的侧面压 实、 定位后的植入 (4L)。注意用于对乳头状突起的保留宽度 (3 毫米 ) 和相邻面距离 ( 大于 3 毫米 )。临时的牙科用液剂 (4M) 和最终的牙科用液剂 (4N)。
     值得注意的是， 图 4C 至 4F 证实， 用人 rBSP 处理过的颗粒 TCP 移植材料， 可加速组 织和伤口愈合。此外， 图 4E 证实， 快速的软组织愈合并不会妨碍或阻碍骨移植材料的骨传 导性和骨生成特性， 并且当人 rBSP 被包埋于生物可降解聚合物中时， 其能够完整地运用并 显示出其骨传导性活性。
     实施例 5——放置生物复合材料后的组织学检查
     牙齿拔除后， 放置本发明的生物复合材料， 手术 12 周后采集骨头样本 ( 长度—— 68 天 ： 1.2 厘米 ； 78 天 ： 0.5 厘米 ； 59 天 ： 0.6 厘米 )。环钻孔脱水、 包埋于可聚合树脂材料 中， 将含有该组织的硬化方块切为 2 至 3 毫米厚的组织切片。该组织切片放置于显微玻片 上， 用 Masson’ s 三色染色法 (Masson-Goldener)、 甲苯胺蓝、 苏木素配曙红进行总染色。
     在 Masson’ s 三色染色中 ： 细胞核为黑色 ； 细胞质——红 / 粉红色 ； 血红细胞—— 红色 ； 胶原纤维和软骨——蓝 / 绿色 ； 肌纤维——红色。
     在总 H&E 染色 ( 苏木素配曙红 ) 中， 细胞核、 核酸和内质网为蓝色 ； 细胞质——粉 红色 ； 血红细胞——橙色 / 红色 ； 弹性纤维、 网状纤维和胶原纤维——粉红色。
     在用甲苯胺蓝总染色中， 由于其较低的 pH 值， 细胞核和核酸、 细胞质、 血红细胞和 胶原纤维为蓝色， 肥大细胞颗粒为紫色。
     参考图 5， 本样本 (Masson-Goldner 染色 ) 的切片 DS64(Dunnschnitt #64) 概观， 显示骨组织在 10 倍放大下有活力地内生长， 而部分外源颗粒材料 (β-TCP 颗粒 ) 可见。在 DS64/01-03 图像上， 骨再生占优势， 且外源颗粒的比例较小。 较高放大倍数的 DS64/04 图像 显示层状骨形成的早期 ( 仅 12 周后！ ) 以及早期开始的层状骨形成。通常， 层状骨仅能够在约九个月后在这种样本中检测到。图 DS64/05-07 显示外源材料的分离区域， 但在某些位 置也有清晰的有活力骨再生。显微图像 DS64/08-10 为基于 H&E 染色的不同放大倍数图像。 这些显微图像显示在较高放大倍数下的新形成层状骨的早期， 以及在周边部分的成骨细胞 链。图像 D64/11-13 用甲苯胺染色。在环钻孔中可发现成功的再生和新形成的骨材料。
     参见图 6， 样本 DS78 的图像表明在环钻孔中的骨再生更少。 在较高放大倍数下， 有 编织骨的表征 ； 见显微图像 DS78/11-13。因此， 将发生编织骨向层状骨熟化。
     参见图 7， 关于样本 DS59， 环钻孔左端的图像 (DS59-9) 显示影响深远的骨重建和 有活力的骨再生， 仅有部分微量外源材料。环钻孔右端的图像 (DS59-06) 显示类似的有活 力的骨再生和骨重建。如显微图像 DS59/07 可见， 新形成的骨材料为层状类型。这表示非 常活跃的再生。图像 DS59/09 显示胰岛的血管生成和血管新生、 例如纤维原细胞、 成骨细胞 和结缔组织的形成， 以及所有骨重建和骨再生的迹象。
     总而言之， 样本 64 和 59 显示早期开始以及优势骨再生。样本 78 显示较少的骨形 成。 在所有情况下， 组织学表明健康的新的编织骨和层状骨形成， 其仅具有最小微量的残留 外源材料。 因此， 本发明的新的生物复合材料看起来已经历了加速的重塑， 并诱导了骨重建 和骨形成。
     实施例 6——人 rBSP 在成骨细胞上的体外活性
     成骨细胞的活化和分化取决于来自成骨细胞的 RANKL 的表达， 以及 OPG( 骨保护蛋 白 ) 的表达。OPG 似乎与 RANKL 的活性相反， 并抑制成骨细胞的分化。当在体外将初级人成 骨细胞和人 rBSP 一起培养时， 通过 ELISA 和实时 PCR 确定的 OPG 和 RANKL 在上层清液中的 表达， 随后发现人 rBSP 通常抑制来自成骨细胞的 RANKL 的表达， 并促进 OPG 的释放。 RANKL/ OPG 之比增加， 意味着成骨细胞的活化可解释本发明的生物复合材料的骨诱导性能。