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1、(10)申请公布号 CN 101972491 A (43)申请公布日 2011.02.16 CN 101972491 A *CN101972491A* (21)申请号 201010289874.5 (22)申请日 2010.09.25 A61L 27/50(2006.01) A61L 27/38(2006.01) A61L 27/20(2006.01) A61L 31/14(2006.01) A61L 31/04(2006.01) A61K 9/00(2006.01) A61K 9/50(2006.01) (71)申请人 上海交通大学医学院附属瑞金医院 地址 200025 上海市卢湾区瑞金二路。
2、 197 号 (72)发明人 彭承宏 韩宝三 董亚东 王加祥 余松林 黄芳 崔龙 (74)专利代理机构 上海申汇专利代理有限公司 31001 代理人 吴宝根 (54) 发明名称 一种葡萄串状微囊体系及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开一种葡萄串状微囊体系及其制备 方法。 它是在ACA微囊形成后， 取半量继续交联壳 聚糖形成 ACAC， 再与剩余的 ACA 混合通过静电吸 引力自组装而形成的一个葡萄串状体系。该体系 的形成没有添加微囊成分以外的化学物质， 具有 与原单个的微囊相同的稳定性、 通透性和生物相 容性。使用该微囊体系取代原来分散的微囊进行 体内原位或者异位移植时， 可以在微囊理化和。
3、生 物相容性不变的情况下使微囊聚集在一起， 避免 游走分散、 阻塞嵌顿脉管系统， 也有利于对植入体 内的微囊观察和回收。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 CN 101972491 A1/1 页 2 1. 一种葡萄串状微囊体系， 包括海藻酸钠 - 壳聚糖 - 海藻酸钠 (ACA) 微囊和海藻酸 钠 - 壳聚糖 - 海藻酸钠 - 壳聚糖 (ACAC) 微囊， 其特征在于 ACAC 微囊的第四层膜壳聚糖通 过静电引力与 ACA 微囊外层的海藻酸钠相互交联自组装形成。 2. 如权利要求 1 所述的一种。
4、葡萄串状微囊体系， 其特征在于葡萄串状微囊体系可以根 据实际需要， 通过将不同数目的微囊交联自组装而调节大小。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的一种葡萄串状微囊体系的制备方法， 其特征在于包括如下 步骤 ： （1） 、 ACA 微囊制备 海藻酸钠溶液在高压静电环境下通过微囊发生仪滴入氯化钙溶液中形成微球 ； 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤后使用壳聚糖对微球进行交联 ； 再用 PBS 洗涤后， 加入海藻 酸钠溶液形成海藻酸钠 - 壳聚糖 - 海藻酸钠 (ACA) 实心微球， 柠檬酸钠溶液洗涤去核， 即得 ACA 微囊 ； （2） 、 ACAC 微囊制备 取步骤 （1） 所得的 ACA 微囊的。
5、半量继续交联壳聚糖， PBS 洗涤后， 形成 ACAC 微囊 ； （3） 、 葡萄串状微囊体系制备 将步骤 （2） 所形成的 ACAC 微囊的第四层膜壳聚糖通过静电引力步骤 （1） 剩余的半量 ACA 微囊外层的海藻酸钠通过静电引力相互交联自组装， 形成 ACA-ACAC 微囊体系即葡萄串 状微囊体系。 4. 如权利要求 3 所述的一种葡萄串状微囊体系的制备方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （1） ACA 微囊制备中 ： 0.1%（wt/v） 海藻酸钠溶液在高压静电环境下 （U=60， f=90， PW=6 ： 高压微胶囊脉冲成型 仪） 通过微囊发生仪 （滴速 =90mm/h） 滴入 0.1M。
6、 氯化钙溶液中形成微球 ； 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤后使用 0.5%（wt/v） 壳聚糖对微球进行交联 ； 再用 PBS 洗涤 一次后， 加入 0.15%（wt/v） 海藻酸钠溶液形成海藻酸钠 - 壳聚糖 - 海藻酸钠 (ACA) 实心微 球， 55mmol/L 柠檬酸钠溶液洗涤 5 分钟去核， 即得 ACA 微囊 ； 所述步骤 （2） ACAC 微囊制备中 ： 取步骤 （1） 所得的 ACA 微囊的半量继续交联 0.15%（wt/v） 壳聚糖 5 分钟， PBS 洗涤一 次， 形成 ACAC 微囊。 5. 如权利要求 1 或 2 所述的一种葡萄串状微囊体系作为包裹药物、 生物活性酶或者。
7、细 胞的应用。 6. 如权利要求 1 或 2 所述的一种葡萄串状微囊体系作为包裹肝细胞的应用。 权 利 要 求 书 CN 101972491 A1/3 页 3 一种葡萄串状微囊体系及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种微囊交联改性后自组装构成的葡萄串状体系微囊及其制备方法。 背景技术 0002 微囊是具有半通透性特征的移植载体。 其半通透膜通过阻止囊外免疫球蛋白、 酶、 免疫细胞等进入， 可以有效保护其内包裹的药物、 生物活性酶或者细胞 ； 还可以使囊内包裹 的或者合成分泌的小分子活性物质自由移出而发挥治疗作用。 不同的使用途径对微囊的要 求各不相同。 微囊包裹药物口服时主要为了避免。
8、首过效应、 掩盖药物原有气味、 防止药物提 前被酶消化等。选用稳定性良好、 可以阻止大分子物质通过的微囊即可。微囊包裹生物活 性酶血管移植时， 需要微囊足够小、 相互之间不粘连和良好的通透性、 稳定性、 免疫隔离。 微 囊包裹细胞后直径一般为 300-600m， 因体积太大而无法进行血管植入， 其移植途径常为 原位或者异位入各个体腔或者皮下。此时不仅需要微囊具有良好的通透性、 稳定性和免疫 隔离作用， 还需要避免微囊游走分散。微囊在体腔内或者皮下四处游走时容易堵塞脉管系 统、 降低局部药物浓度， 并且回收困难、 不利于后续研究， 目前对此类问题尚无解决方法。 发明内容 0003 为了克服微囊移。
9、植后因相互之间分散、 游走和回收研究障碍 , 本发明对微囊交联 改性后自组装形成一种微囊体系而取代原来的散在单个微囊。 该微囊体系使得原单个微囊 相互附着结合成葡萄串状， 有效避免单个微囊散布体腔、 堵塞脉管系统， 并且不影响微囊的 其他特性。 0004 本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下 ： 葡萄串状微囊体系， 是由海藻酸钠 - 壳聚糖 - 海藻酸钠 (ACA) 微囊继续交联壳聚糖形 成海藻酸钠 - 壳聚糖 - 海藻酸钠 - 壳聚糖 (ACAC) 微囊， ACAC 微囊的第四层膜壳聚糖再与 ACA 微囊外层的海藻酸钠通过静电引力自组装而构成。 0005 上述的葡萄串状微囊体系的制备方法。
10、包括如下步骤 ： （1） 、 ACA 微囊制备 海藻酸钠溶液在高压静电环境下通过微囊发生仪滴入氯化钙溶液中形成微球 ； 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤后使用壳聚糖对微球进行交联 ； 再用 PBS 洗涤后， 加入海藻 酸钠溶液形成海藻酸钠 - 壳聚糖 - 海藻酸钠 (ACA) 实心微球， 柠檬酸钠溶液洗涤去核， 即得 ACA 微囊 ； （2） 、 ACAC 微囊制备 取步骤 （1） 所得的 ACA 微囊的半量继续交联壳聚糖， PBS 洗涤后， 形成 ACAC 微囊 ； （3） 、 葡萄串状微囊体系制备 将步骤 （2） 所形成的 ACAC 微囊的第四层膜壳聚糖通过静电引力步骤 （1） 剩余的半量 。
11、ACA 微囊外层的海藻酸钠通过静电引力相互结合自组装， 形成 ACA-ACAC 微囊体系即葡萄串 状微囊体系。 说 明 书 CN 101972491 A2/3 页 4 0006 单个微囊包裹细胞后直径一般为 300-600m ； 本发明的葡萄串状微囊体系可以 根据实际需要， 通过将不同数目的微囊交联自组装而调节大小。 0007 本发明所得的一种葡萄串状微囊体系可作为包裹药物、 生物活性酶或者细胞的应 用， 例如奥美拉唑、 氯霉素、 血红蛋白、 胰岛细胞和肝细胞等， 特别是包裹肝细胞的应用。 0008 本发明的有益效果 本发明的葡萄串状微囊体系的制备方法， 可以在保证微囊原有功能的同时， 改变微。
12、囊 在体内易游走分散、 位置不确定、 易堵塞脉管并且难以回收的缺点 ； 微囊体系甚至可以模拟 实体脏器的框架结构， 更加明确地发挥所包裹的内容物的功能。 附图说明 0009 图 1 是 ACA 微囊图。 0010 图 2 是 ACAC 微囊图。 0011 图 3 是 ACA-ACAC 微囊体系图。 0012 图 4 是 ACA 微囊包裹细胞图。 0013 图 5 是 ACAC 微囊包裹细胞图。 0014 图 6-8 是 ACA-ACAC 微囊体系包裹细胞图。 具体实施方式 0015 下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步描述， 但并不限制本发明。 0016 实施例 1 制备葡萄串状微囊体系 。
13、（1） 、 ACA 微囊制备 0.1%（wt/v） 海藻酸钠溶液在高压静电环境下 （U=60， f=90， PW=6 ： 高压静电微胶囊成 型仪， 上海理工大学） 通过微囊发生仪 （滴速 =90mm/h） 滴入 0.1M 氯化钙溶液中形成微球 ； 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤后使用 0.5%（wt/v） 壳聚糖对微球进行交联 ； PBS 洗涤一次， 加入 0.15%（wt/v） 海藻酸钠溶液形成海藻酸钠 - 壳聚糖 - 海藻酸钠 (ACA) 实心微球 ； 55mmol/L 柠檬酸钠溶液洗涤 5 分钟去核。 0017 （2） 、 ACAC 微囊制备 取半量 ACA 微囊继续交联 0.15% （。
14、wt/v） 壳聚糖 5 分钟， PBS 洗涤一次， 形成 ACAC 微囊。 0018 （3） 、 葡萄串状微囊体系制备 ACAC 微囊与 ACA 微囊混合， 通过外层壳聚糖的静电引力自组装， 形成 ACA-ACAC 微囊体 系， 所形成的葡萄串状微囊体系作为移植细胞的载体。 0019 图 1 是步骤 （1） 所得的 ACA 微囊图 ； 图 2 是步骤 （2） 所得的 ACAC 微囊图 ； 图 3 是 步骤 （3） 所得的 ACA-ACAC 微囊体系即葡萄串状微囊体系图。从图 1、 图 2 中可以看出 ACA 微囊和 ACAC 微囊均单个散发， 而图 3 显示 ACA-ACAC 微囊体系成葡萄串。
15、状， 从而说明海藻酸 钠与壳聚糖之间的静电引力可以有效地将两种散发微囊自组装成一个整体体系。 0020 应用实施例 1 葡萄串状微囊体系包裹细胞的应用 （1） 、 海藻酸钠 - 细胞悬液 说 明 书 CN 101972491 A3/3 页 5 将分离培养好的总量约 1106个小鼠原代肝细胞 500rpm、 5min 离心， 弃上清 ； 0.1% （wt/v） 海藻酸钠溶液 1ml 混合沉淀细胞 ； （2） 、 包裹细胞的 ACA 微囊 混合肝细胞的海藻酸钠溶液在高压静电环境下 （U=60， f=90， PW=6 ： 高压静电微胶囊成 型仪， 上海理工大学） 通过微囊发生仪 （滴速 =90mm/。
16、h） 滴入 0.1M 氯化钙溶液中形成微球 ； 磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤后使用 0.5%（wt/v） 壳聚糖对微球进行交联 ； PBS 洗涤一次， 加入 0.15%（wt/v） 海藻酸钠溶液形成海藻酸钠 - 壳聚糖 - 海藻酸钠 (ACA) 实心微球 ； 55mmol/L 柠檬酸钠溶液洗涤 5 分钟去核， 即得包裹细胞的 ACA 微囊 ； （3） 、 包裹细胞的 ACAC 微囊 将半量包裹细胞的 ACA 微囊继续交联 0.15%（wt/v） 壳聚糖 5 分钟， PBS 洗涤一次， 形 成包裹细胞的 ACAC 微囊 ； （4） 、 包裹细胞的 ACA-ACAC 微囊体系 将上述包裹细胞后的。
17、 ACAC 微囊与 ACA 微囊混合， 通过外层壳聚糖的静电引力自组装， 形成包裹细胞的 ACA-ACAC 微囊体系。 0021 图 4 是步骤 （2） 所得的包裹细胞的 ACA 微囊图 ； 图 5 是步骤 （3） 所得的包裹细胞 的 ACAC 微囊图 ； 图 6-8 是步骤 （4） 所得的包裹细胞的 ACA-ACAC 微囊体系， 即包裹细胞的葡 萄串状微囊体系图。从图 4、 图 5 中可以看出包裹细胞后的 ACA 和 ACAC 微囊均呈均匀的散 发状态 ； 图 6-8 显示包裹细胞后的单个散发微囊相互自组装结合成葡萄串状体系， 从而说 明在包裹内容物情况下， 本发明可以有效地促使微囊体系化。 0022 以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明， 而依据本发明的技术方案所做的任 何等效变换， 均应属于本发明的保护范围。 说 明 书 CN 101972491 A1/1 页 6 图 1图 2 图 3图 4 图 5图 6 图 7图 8 说 明 书 附 图 。