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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510316098.6 (22)申请日 2015.06.10 A61L 27/54(2006.01) A61L 27/24(2006.01) (71)申请人 中国科学院遗传与发育生物学研究 所 地址 100000 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 2 号 (72)发明人 戴建武 肖志峰 陈冰 赵燕南 李星 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 赵静 (54) 发明名称 西妥昔单抗与负载该物质的胶原支架在制备 修复脊髓损伤药物中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种西妥昔单抗与负载该物质 的胶。
2、原支架在制备修复脊髓损伤药物中的应用。 同时还提供了负载了 Cetuximab 的神经再生胶 原支架材料， 其制备方法， 包括如下步骤 ： 1) 使神 经再生胶原支架材料吸收 Cetuximab， 得到含有 Cetuximab 的神经再生胶原支架材料 ； 2) 对步骤 1)中得到的负载Cetuximab的神经再生胶原支架 材料进行孵育， 即可得到。 通过试验发现西妥昔单 抗与负载该物质的胶原支架均能达到修复脊髓损 伤、 促进神经再生和 / 或减少脊髓损伤部位胶质 细胞增生的效果， 在未来临床脊髓损伤修复的应 用具有重要的现实指导意义。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权。
3、局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图6页 CN 106267368 A 2017.01.04 CN 106267368 A 1/1 页 2 1.Cetuximab 或负载 Cetuximab 的神经再生胶原支架材料在制备具有如下 (1)、 (2)、 (3)、 (4) 和 (5) 功能中至少一种的产品中的应用 ： (1) 修复脊髓损伤 ； (2) 促进神经再生 ； (3) 减少脊髓损伤部位胶质细胞增生 ； (4) 引导受损神经纤维的有序再生 ； (5) 引导脊髓损 伤后内源性的神经前体细胞和神经元向损伤区的迁移。 2.具有如下 (1)、 (2)、 (3)、 (4) 和 (5。
4、) 功能中至少一种的药物， 该药物是负载了 Cetuximab 的神经再生胶原支架材料 ： (1) 修复脊髓损伤 ； (2) 促进神经再生 ； (3) 减少脊髓 损伤部位胶质细胞增生 ； (4) 引导受损神经纤维的有序再生 ； (5) 引导脊髓损伤后内源性的 神经前体细胞和神经元向损伤区的迁移。 3.根据权利要求 2 所述的药物， 其特征在于 ： 所述药物中的神经再生胶原支架材料是 通过如下方法而制备得到 ： a) 将筋膜用体积百分浓度为 1-1.5的磷酸三丁酯溶液处理 24-72h ； b) 再用含有 0.5-1.5mol/L NaCl 的 25-100mmol/L、 pH 为 7.6-8.。
5、5 的 Tris-HCl 缓冲液 处理 24-72h ； c) 最后， 用 0.5-1.5g 胰蛋白酶 /100ml 缓冲液处理 48-96h， 得到所述有序胶原材料， 即 神经再生胶原支架材料， 其中， 所述缓冲液为 25-100mmol/L Tris-HCl， pH 为 7-8。 4.根据权利要求 3 所述的药物， 其特征在于 ： 步骤 a) 中， 所述磷酸三丁酯溶液的溶剂 为 PBS 缓冲液或 Tris-HCl 缓冲液 ； 所述筋膜在处理前还要去除内层粘附的肌肉组织和外层粘附的脂肪 ； 步骤 b) 和 c) 中， 所述处理的温度均为 2-8 ； 步骤 c) 中， 所述神经再生胶原支架材料。
6、还包括将其用浓度为 0.5-1.5mol/L 强碱溶液 处理 5-10min 的步骤。 5.权利要求 2-4 中任一项所述的药物的制备方法， 包括如下步骤 ： 1) 使神经再生胶原支架材料吸收 Cetuximab， 得到含有 Cetuximab 的神经再生胶原支 架材料 ； 2)对步骤1)中得到的含有Cetuximab的神经再生胶原支架材料进行孵育， 得到所述功 能神经再生胶原支架材料， 即所述药物。 6.根据权利要求 5 所述的制备方法， 其特征在于 ： 步骤 1) 中， 所述使神经再生胶原支 架材料吸收 Cetuximab 按如下步骤操作 ： 将长度为 4-6mm、 直径为 2-3mm 神。
7、经再生胶原支架 材料浸泡在 20-50L、 5g/L 的 Cetuximab 溶液中， 吸收 Cetuximab。 7.根据权利要求5或6所述的制备方法， 其特征在于 ： 步骤2)中， 所述孵育是在0-10 下孵育 20-30min。 权 利 要 求 书 CN 106267368 A 2 1/8 页 3 西妥昔单抗与负载该物质的胶原支架在制备修复脊髓损伤 药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于医疗领域， 具体涉及一种西妥昔单抗与负载该物质的胶原支架在制备 修复脊髓损伤药物中的应用。 背景技术 0002 脊髓是中枢神经的重要组成部分， 主要功能是传送脑与外周之间的神经信息同 时也是许多简单。
8、反射活动的低级中枢。脊髓损伤 (spinal cord injury,SCI) 多见于砸 伤、 摔伤、 交通事故、 运动性损伤和一些如地震及矿难等自然灾难中。脊髓损伤后通常表现 为损伤节段以下的躯体丢失感觉与自主运动功能， 而与外周神经不同， 脊髓神经元在损伤 后很难自发再生进入或跨越损伤区 Neumann S,Bradke F,Tessier-Lavigne M,Basbaum AI.Regeneration of sensory axons within the injured spinal cord induced by intraganglionic cAMP elevation.Ne。
9、uron.2002 ； 34:885-93. ； Qiu J,Cai CM,Dai HN,McAtee M,Hoffman PN,Bregman BS,et al.Spinal axon regeneration induced by elevation of cyclic AMP.Neuron.2002 ； 34:895-903.。影响脊髓损伤后轴突再生的抑 制因素主要包括以下两类 ： 首先， 脊髓损伤后， 星型胶质细胞、 小胶质细胞以及少突胶质 细胞等胶质细胞活化、 增生以致胶质疤痕形成。研究表明， 在脊髓损伤后几天之内损伤区 周围的反应性星形胶质细胞大量表达硫酸软骨素蛋白聚糖类 (CSP。
10、Gs) 这类神经再生抑制 分子 Filbin MT.Recapitulate development to promote axonal regeneration:good or bad approach， Philos T R Soc B.2006 ； 361:1565-74.。CSPGs 除了能以瘢痕的形 式在空间上影响轴突再生， 还能激活神经元内 PKC 信号通路继而活化 Rho 来抑制神经再 生 Sivasankaran R,Pei J,Wang KC,Zhang YP,Shields CB,Xu XM,et al.PKC mediates inhibitory effects of 。
11、myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration.Nature neuroscience.2004 ； 7:261-8.。 此外， 髓鞘来源的髓鞘相关蛋白同 样具有抑制神经轴突再生的作用， 其主要包括 Nogo-A， MAG 和 OMgp 等， 这三种抑制分子均 可以与 NgR1 识别结合， 与配体结合后 NgR1 会进一步招募 p75、 TROY 和 LINGO-1 形成受体 复合物， 随后抑制信号传导进入细胞内引起 RhoA 磷酸化， 细胞骨架重排最终轴突生长被抑 制 He ZG,Koprivica V.。
12、The Nogo signaling pathway for regeneration block.Annual review of neuroscience.2004 ； 27:341-68.。 有研究表明髓鞘相关蛋白与其受体结合后， 能引发胞内钙离子浓度提高， 进而激活表皮生长因子信号通路， 表皮生长因子受体 (EGFR) 激活后活化 Rho-Rac 信号， 导致轴突生长锥塌陷， 从而抑制轴突再生 Koprivica V,Cho KS,Park JB,Yiu G,Atwal J,Gore B,et al.EGFR activation mediates inhibition of axon。
13、 regeneration by myelin and chondroitin sulfate proteoglycans. Science.2005 ； 310:106-10.。 0003 目前 EGFR 抗体已经用于临床的药物是 Cetuximab， 但是该药物主要是用于 临 床 治 疗 肿 瘤 疾 病 ( 如 直 肠 癌， 食 道 癌 等 )Malik H,Khan AZ,Berry DP,Cameron 说 明 书 CN 106267368 A 3 2/8 页 4 IC,Pope I,Sherlock D,Helmy S,Byrne B,Thompson M,Pulfer A,Davi。
14、dson B.Liver resection rate following downsizing chemotherapy with cetuximab in metastatic colorectal cancer:UK retrospective observational study.Eur J Surg Oncol.2015 ； 41(4):499-505 ； Tian X,Zhou JG,Zeng Z,Shuai T,Yi LJ,Ma L,Wang Y,Cao H,Song GM.Cetuximab in patients with esophageal cancer:a syste。
15、matic review and meta-analysis of randomized controlled trials.Med Oncol.2015 ； 32(4):127.， 但未 见有用于脊髓损伤修复的临床报道。 0004 我们前期研制的神经再生胶原支架除了具有良好的生物相容性之外， 还根据脊 髓神经元细胞的神经纤维纵向有序生长的特点能够引导神经纤维有序延伸。通过大鼠及 全横断脊髓损伤模型证实， 神经再生胶原支架能够减少损伤面积扩散， 引导神经纤维有序 再生 Han QQ,Sun WJ,Lin H,Zhao WX,Gao Y,Zhao YN,et al.Linear Ordered 。
16、Collagen Scaffolds Loaded with Collagen-Binding Brain-Derived Neurotrophic Factor Improve the Recovery of Spinal Cord Injury in Rats.Tissue Eng Pt A.2009 ； 15:2927-35.。 发明内容 0005 本发明的目的是提供Cetuximab或负载Cetuximab的神经再生胶原支架材料在制 备具有如下 (1)、 (2)、 (3)、 (4) 和 (5) 功能中至少一种的产品中的应用 ： (1) 修复脊髓损伤 ； (2) 促进神经再生 ； (3)。
17、 减少脊髓损伤部位胶质细胞增生 ； (4) 引导受损神经纤维的有序再 生 ； (5) 引导脊髓损伤后内源性的神经前体细胞和神经元向损伤区的迁移。 0006 本发明所述的 Cetuximab 购自德国默克里昂制药公司， 商品规格为 100 毫克 /20 毫升 / 瓶 )。 0007 本发明的再一个目的是提供具有如下 (1)、 (2)、 (3)、 (4) 和 (5) 功能中至少一种 的药物， 该药物是负载了 Cetuximab 的神经再生胶原支架材料 ： (1) 修复脊髓损伤 ； (2) 促 进神经再生 ； (3)减少脊髓损伤部位胶质细胞增生 ； (4)引导受损神经纤维的有序再生 ； (5) 引导。
18、脊髓损伤后内源性的神经前体细胞和神经元向损伤区的迁移。 0008 本发明所述药物中的神经再生胶原支架材料是通过如下方法而制备得到 ： 0009 a) 将筋膜用体积百分浓度为 1-1.5的磷酸三丁酯溶液处理 24-72h ； 0010 b) 再用含有 0.5-1.5mol/L NaCl 的 25-100mmol/L、 pH 为 7.6-8.5 的 Tris-HCl 缓 冲 液处理 24-72h ； 0011 c) 最后， 用 0.5-1.5g 胰蛋白酶 /100ml 缓冲液处理 48-96h， 得到所述有序胶原材 料， 即神经再生胶原支架材料， 其中， 所述缓冲液为 25-100mmol/L T。
19、ris-HCl， pH 为 7-8。 0012 上述方法中， 步骤 a) 中， 所述磷酸三丁酯溶液的溶剂为 PBS 缓冲液或 Tris-HCl 缓 冲液。 0013 所述筋膜在处理前还要去除内层粘附的肌肉组织和外层粘附的脂肪。 0014 步骤 b) 和 c) 中， 所述处理的温度均为 2-8， 优选是 4。 0015 步骤 c) 中， 所述神经再生胶原支架材料还包括将其用浓度为 0.5-1.5mol/L 强碱 溶液处理 5-10min 的步骤。 0016 本发明所述药物的制备方法， 包括如下步骤 ： 说 明 书 CN 106267368 A 4 3/8 页 5 0017 1) 使神经再生胶原支。
20、架材料吸收 Cetuximab， 得到含有 Cetuximab 的神经再生胶 原支架材料 ； 0018 2)对步骤1)中得到的含有Cetuximab的神经再生胶原支架材料进行孵育， 得到所 述功能神经再生胶原支架材料， 即所述药物。 0019 上述制备方法中， 步骤 1) 中， 所述使神经再生胶原支架材料吸收 Cetuximab 具体可按如下步骤操作 ： 将长度为 4-6mm、 直径为 2-3mm 神经再生胶原支架材料浸泡在 20-50L、 5g/L 的 Cetuximab 溶液中， 使其充分吸收 Cetuximab。 0020 所述神经再生胶原支架材料吸收 Cetuximab 的量主要依据实。
21、验动物的体重而定 的。 0021 上述制备方法中， 步骤2)中， 所述孵育是在0-10下孵育20-30min， 具体可在0 下孵育 20-30min。 0022 本发明通过将 EGFR( 表皮生长因子受体 )Cetuximab( 西妥昔单抗 ) 应用于大鼠的 小脑颗粒神经元细胞上， 发现在髓鞘蛋白抑制条件下， Cetuximab 能有效促进神经元细胞神 经丝伸长的作用。 0023 本发明具体通过将神经再生胶原支架材料与 EGFR Cetuximab 进行复合后移植到 犬 T8 脊髓全横断损伤模型之中， 通过九个月的恢复和观察， 我们的研究证明移植复合 EGFR antibody( 表皮生长因子。
22、受体抗体 ) 得到的功能神经再生胶原支架能够更好地促进神经纤 维再生进入损伤区， 并能明显减少损伤区胶质瘢痕及其抑制分子 CSPG 的沉积。同时移植功 能神经再生胶原支架组的犬在损伤后能自发引导神经前体细胞和神经元向损伤区迁移， 这 些进入损伤区的神经元包括运动和感觉神经元， 它们在损伤区内能实现很好的髓鞘化， 并 能产生功能性的突触结果， 为受损脊髓的功能性再生提供了中继的角色。 另外， 移植功能神 经再生胶原支架组的犬术后表现出明显优于空白对照和移植单纯神经再生胶原支架组犬 的运动功能恢复， 这也表明本研究中的移植功能 神经再生胶原支架治疗策略具有更好的 修复效果及良好的临床应用前景。 0。
23、024 本发明通过犬全横断脊髓损伤模型发现神经再生胶原支架材料除了作为支架引 导神经再生的作用， 移植胶原支架材料后脊髓损伤部位的胶质瘢痕相关的标志物 GFAP 或 CSPGs 明显减少， 这说明神经再生胶原支架除了为神经再生提供支撑和方向上的引导外， 还 可以明显抑制胶质瘢痕的形成。同时， 在该研究中， 我们还证明， 通过将 EGFRCetuximab 复 合神经再生胶原支架后移植到脊髓损伤区域能在髓鞘抑制分子 Nogo 存在的情况下有效促 进神经纤维的再生。此外， 拮抗 EGFR 信号还能调动大量内源性的神经前体细胞及 ( 或 ) 神 经元自发迁移进入到损伤区域， 并能有效地再髓鞘化及形成。
24、功能性的突出联系。 综上所述， 本研究中以 EGFR Cetuximab 与胶原支架材料复合形成的功能神经再生胶原支架在未来临 床脊髓损伤修复的应用具有重要的现实指导意义。 附图说明 0025 图 1 为实施例 1 中体外小脑颗粒神经元细胞的神经丝、 髓鞘蛋白存在下的小脑颗 粒神经元细胞的神经丝和EGFR Cetuximab+髓鞘蛋白存在下的小脑颗粒神经元细胞的神经 丝的形态和长度图。 0026 图 2 为实施例 2 中脊髓损伤修复的神经再生胶原支架 (A) ； 及其与 EGFR 抗体复合 说 明 书 CN 106267368 A 5 4/8 页 6 后准备移植时的形态 (B)。 0027 图。
25、 3 为实施例 3 中 (A) 犬 T8 脊髓全横断模型建立 ； (B) 术中电生理监测犬 T8 脊 髓全横断模型质量。 0028 图 4 为实施例 3 中 Masson 染色观察各组胶原性瘢痕沉积情况， 其中， 放大区域的 标尺为 100m。 0029 图 5 为实施例 3 中 CSPG 染色观察各组反应性星型胶质细胞及胶质瘢痕沉积 情况， 其中上侧含黄色框的图片内标尺为 500m， 下侧放大图的标尺为 50m。图中的 “Chondroitin sulfate/GFAP” 为 “硫酸软骨素 / 胶质纤维酸性蛋白” 。 0030 图 6 为实施例 3 中 NF 蛋白在各组的表达情况， 其中左侧。
26、含黄色框的图片内标尺为 500m， 右侧放大图的标尺为 50m， 图中的 “GFAP/NF/DAPI” 为 “胶质纤维酸性蛋白 / 神经 丝蛋白 / 细胞核荧光染料 DAPI” 。 0031 图 7 为实施例 3 中新生神经元标志物 Tuj-1、 成熟神经元标志物 Map2 以及神经前 体细胞标志物 Nestin 蛋白在各组的表达情况， 其中 A、 B 和 C 内含有中文标注的图片内标尺 为 500m， 下侧放大图的标尺为 50m。 0032 图 8 为实施例 3 中运动神经元标志物 5-HT、 感觉神经元标志物 TH 在移植功能神 经再生胶原支架组中的具体表达情况 (A 和 C) 和在三组中。
27、表达量的比较 (E) ； B 和 D 表示在 移植功能神经再生胶原支架组损伤区内 5-HT 和 TH 神经纤维的再髓鞘化 ； F 表示功能 性突 触标志物 SYN 在各组中的表达。其中， A、 C 和 F 中的标尺表示 500m,B 和 D 中的标尺表示 50m。 0033 图 9 为实施例 3 中术后行为学评分情况。 具体实施方式 0034 下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明， 但本发明并不局限于此， 凡在本 发明的精神和原则之内所做的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范 围之内。 0035 下述实施例中所述实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法 ； 所述试剂和材。
28、料， 如 无特殊说明， 均可从商业途径获得。 0036 下述实施例中所用神经再生胶原支架材料是本实验室自制， 方法参照专利 ZL200510098731.5， 具体制备步骤如下 ： 0037 1) 预处理筋膜 ： 取新鲜带有白色筋膜的成年牛肌肉， 用冷的去离子水冲洗 3 遍， 用 镊子和手术刀分离出筋膜， 尽量去除内层粘附的肌肉组织和外层的脂肪等组织 ； 0038 2) 将预处理筋膜按如下步骤制备有序神经再生胶原支架 ： (a)1 TnBP( 磷酸 三丁酯 ) 溶液 (50mM Tris-HCl， pH 8.0， 体积百分比 ) 中处理 48h ； (b)50mM Tris-Cl buffer。
29、(pH 8.0， 含有 1M NaCl) 中处理 48h ； (c)1g 胰蛋白酶 /100ml(50mM Tris-HCl 缓冲 液， pH 8.0) 中处理 72h ； (d)1M NaOH 中处理 5min， 充分清洗直至中性， 冻干， 即得到有序 胶原材料 (LOCS 丝 )， 命名为神经再生胶原支架材料。 0039 所制备得到的神经再生胶原支架材料颜色为白色， 形状可根据实际情况制备， 具 体可为片状、 管状或纤维状 ； 神经再生胶原支架保持了天然胶原纤维的结构， 其具有有序的 粗糙表面结构， 利于细胞的贴附 ； 本发明采用有序神经再生胶原支架。 说 明 书 CN 106267368。
30、 A 6 5/8 页 7 0040 实施例 1、 EGFR( 表皮生长因子受体 )Cetuximab( 西妥昔单抗 ) 能促进体外小脑颗 粒神经元细胞在髓鞘蛋白抑制条件下的神经丝伸长。 0041 以新生 7 天大鼠的小脑颗粒神经元细胞 ( 分离培养方法 ： 将动物浸入 75乙醇中 浸泡2-5min。 在超净台中， 断头， 分离出小脑， 取出放入预冷的PBS中， 仔细地剔除血管和脑 膜。弯剪剪碎， 加 DMEM 高糖培养液， 并用钝头粗口滴管轻轻吹打直到组织团块消失。然后 用高温高压灭菌的 400 目尼龙膜过滤， 离心 1000rpm， 5min， 弃上清， 按 20000-30000 个细胞 。
31、每孔接种到含 20胎牛血清的 DMEM 高糖培养基的 48 孔板内， 培养于提前铺被有 200ng 髓 鞘蛋白 ( 提取方法采用非连续性蔗糖密度梯度离心法。具体为从成年大鼠中取得脊髓， 在 0.3M蔗糖溶液中匀浆破碎， 然后铺到密度梯度为1.23和0.85M蔗糖浓度上。 样品于75000g 离心 45min。在 0.85/1.23M 蔗糖分界处收集提 取的鞘蛋白片段。粗提取物用渗透压休克 洗两次， 重悬于 0.32M 蔗糖溶液中， 成铺到 0.85M 蔗糖溶液， 离心， 于 0.32/0.85M 蔗糖分界 处收集鞘蛋白， 除去多余的蔗糖， 鞘蛋白按 1 ： 1 比例溶解于 DMEM 培养基， 。
32、匀浆后放 -80备 用 ) 的 48 孔细胞培养板中， 处理组加入 5g 的 Cetuximab， 培养 24h 后检测神经丝的伸长 情况。 0042 其中， 小脑颗粒神经元细胞的神经丝免疫荧光染色步骤如下 ： 0043 (1) 吸净孔板内的培养基， 用 PBS 清洗细胞 1-2 次。 0044 (2) 固定 ： 4多聚甲醛， 室温， 20min 后， 用 PBS 洗 3 次 0045 (3) 封闭 ： 100 FBS， 室温 1h 后， 用 PBS 洗 1 次 0046 (4) 一抗孵育 ： 用抗 Tubulin(1:500， 购自 Millipore 公司， 货号 05-559)， 4， 。
33、过夜， 后用 PBS 洗 3 次 0047 (5) 二抗孵育 ： 按说明稀释荧光二抗 ( 购自 invitrogen 公司， 货号分别为 ： Alexa 488 Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) ； CA21202s ； Alexa594 Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L)， A21207) 于 37孵育 40min， 后用 PBS 洗 3 次 0048 (6) 核衬染 ： 50g/ml Hoechst 33342( 购自 sigma 公司 )， 10min， PBS 洗 3 次 0049 (7) 显微镜下观察， 照相。 0050 相应测试结果如图 1 。
34、所示， 从图 1 可以看出 ： 与对照组和髓鞘蛋白组相比， 处理组 ( 即髓鞘蛋白 +EGFR 抗体 ) 在具抑制蛋白存在的情况下， Cetuximab 能有效促进神经元细胞 神经丝伸长的作用。 0051 实施例2、 制备含EGFR(表皮生长因子受体)Cetuximab(西妥昔单抗)的脊髓损伤 功能神经再生胶原支架材料 ： 0052 将用牛筋膜所制备得到的有序神经再生胶原支架材料 ( 长度为 5mm， 直径为 2mm) 浸泡在含 30L、 浓度为 5g/L( 含 150g Cetuximab) 的 Cetuximab 液体 ( 购自德国 默克里昂制药公司， 商品规格为 100 毫克 /20 毫。
35、升 / 瓶 ) 中， 使其全部被神经再生胶原支架 吸收， 冰上孵育30min即制备得到含EGFR Cetuximab的脊髓损伤功能神经再生胶原支架材 料。 0053 相应的形态如图2所示， 图2(A)为有序神经再生胶原支架的形态图； 图2(B)为含 EGFR Cetuximab 的脊髓损伤功能神经再生胶原支架的形态图， 从图 2 可看出 ： 有序神经再 生胶原支架束经功能化后可塑形的形态。 0054 实施例 3、 用含 EGFR Cetuximab 的脊髓损伤功能神经再生胶原支架材料治疗 5mm 说 明 书 CN 106267368 A 7 6/8 页 8 犬 T8 脊髓全横断损伤 ： 005。
36、5 1) 制备 5mm 犬 T8 脊髓全横断损伤模型， 并移植功能胶原支架材料至损伤区域 ： 0056 首先制备犬脊髓 T8 全横断损伤模型 ( 如图 3A 所示 )， 选择 6 只 1 周岁左右的比格 犬， 体重在 7 9 公斤左右， 麻醉后， 磁共振定位脊髓 T8 段， 打开 T7-T9 椎板暴露脊髓组织， 将 T8 段经游离全横断 5mm， 制作犬急性 T8 全横断损伤模型 ； 然后将制备好的功能神经再生 胶原支架材料桥接在损伤区域之内。再进行无缝连接。术中电生理检测体感诱发电位和动 作电位的消失来检测全横断的模型质量 ( 如图 3B 所示 )， 从图 3B 可得出 ： . 手术前， 所。
37、有实 验犬的左右后肢胫神经的运动诱发电位及其体感诱发电位均能正常检测到， 而在实施完成 T8 全横断损伤实验后， 上述各种电生理活动均消失， 无法被检测到， 证实 T8 全横断损伤模 型质量可靠。 0057 2) 术后九个月后经形态学染色 ( 如图 4 所示 )、 免疫荧光染色 ( 如图 5-图 8 所 示 ) 和行为学评分 ( 如图 9 所示 ) 等多项检测综合评价移植功能胶原支架材料对犬脊髓全 横断损伤后的修复效果 ： 0058 a) 胶原性瘢痕沉积染色 ： 0059 术后九个月将犬处死后， 迅速将脊髓取出， 于 4多聚甲醛固定液中固定 48 小时， 分别在 20和 30的蔗糖中进行沉糖脱。
38、水。然后以 OCT(opti-mum cutting temperature compound、 一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物， 常作为冰冻切片包埋剂 ) 包埋组织 进行冰冻切片， 切片厚度为 15m ； 随后将切片进行 Masson 染色鉴定胶原性瘢痕组织的沉 积情况 ； 0060 具体步骤如下 ： (1) 取出切片晾干 ； (2) 依次用自来水和蒸馏水清洗 ； (3) 用 Regaud 苏木精染液或 Weigert 苏木精液染核 5-10min ； (4) 充分水洗， 若过染可盐酸酒精分 化 ； (5)蒸馏水洗 ； (6)用Masson丽春红酸性复红液染色5-10min ； (7)。
39、以体积分数为2的 冰醋酸水溶液浸洗片刻 ； (8)1磷钼酸水溶液分化 3-5min ； (9) 不经水洗， 直接用苯胺蓝或 光绿液染色 5min ； (10) 以体积分数为 0.2的冰醋酸水溶液浸洗片刻 ； (11) 先用体积分数 为 95的酒精水溶液和无水酒精清洗后， 再用二甲苯透明中性树胶封固 0061 从图 4 可得知 ： 移植了单纯神经再生胶原支架材料组和功能神经再生胶原支架材 料组的犬损伤处的胶原性瘢痕的沉积量要相对比空白对照组(control组)低， 说明移植支 架材料或功能支架材料均能一定程度降低胶原性瘢痕组织的沉积。 0062 b) 免疫荧光染色检测反应性星型胶质细胞分泌的抑制。
40、分子 CSPG 表达 ： 0063 术后九个月， 我们对犬脊髓切片进行免疫荧光染色， 以确定损伤处的反应性星型 胶质细胞产生的 CSPGs 的沉积。 0064 做法如下 ： (1) 将切片用 PBS 洗一遍后， 用山羊血清封闭液封闭 20-40min ； (2) 吸去山羊血清， PBS 洗两遍， 将切片周围的水用吸水纸擦净 ； (3) 加入 200L 左右混合 了来源于小鼠的 anti-CSPG 抗体 (1:200) 和来源于兔的 anti-GFAP(1:500) 的一抗于 切片组织上， 使液体完全覆盖脊髓组织 ； (4)4下孵育过夜 ； (5)PBS 洗净两三遍 ； (6) 按 照二 抗说明。
41、书稀释的荧光二抗 ( 购自 invitrogen 公司， 货号分别为 ： Alexa 488 Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)， CA21202s ； Alexa594 Donkey Anti-Rabbit IgG(H+L),A21207)， 室温孵育 1 小时， 注意避光操作 ； (7)PBS 洗两遍， 避光自然晾干 ； (8) 滴 加含 DAPI 的封片剂后， 封上盖玻片， 显微镜下观察， 照相。 说 明 书 CN 106267368 A 8 7/8 页 9 0065 从图 5 可得知 ： 无论是移植单纯神经再生胶原支架材料组还是移植功能神经再生 胶原支架材料组的犬， 。
42、其 GSPG 的表达量均远远低于空白对照组 (control 组 ) 犬的表达量 ； 该结果说明我们的有序神经再生胶原支架材料能够明显抑制胶质瘢痕的沉积及其抑制分 子 CSPG 的表达， 是一种非常好的可用于脊髓损伤后修复的生物支架材料。 0066 c) 免疫荧光染色检测神经丝蛋白 NF 表达 ： 0067 术后九个月， 我们对犬脊髓切片进行神经丝蛋白 NF 免疫荧光染色以确定再生进 入损伤区的神经纤维的数量和密度。具体染色步骤同 b) 中所述， 所使用的一抗为鼠来源的 anti-NF 抗体 (1:200) 以及兔来源的 anti-GFAP 抗体 (1:500) ； 0068 从图 6 可得知。
43、 ： 移植功能神经再生胶原支架材料组的犬长入损伤区内的神经纤维 数量明显高于移植单纯神经再生胶原支架材料组及空白对照组 (control 组 )， 此外， 移植 功能神经再生胶原支架材料组的 NF 阳性纤维在损伤区内可见较明显的纵向有序排列， 说 明 EGFR 抗体复合神经再生胶原支架材料能更好的引导受损神经纤维的有序再生。 0069 d) 免疫荧光染色检测神经前体细胞及神经元向损伤区的迁移 ： 0070 术后九个月， 我们对犬脊髓切片进行神经前体细胞标志物 Nestin、 新生神经元标 志物 Tuj-1 以及成熟神经元标志物 Map2 的免疫荧光染色以确定再生进入损伤区的神经前 体细胞及神经。
44、元的数量和密度 ； 0071 具体染色步骤同 b) 中所述， 所使用的一抗分别为鼠来源的 anti-Nestin 抗体 (1:200)、 anti-Tuj-1 抗体 (1:200)、 anti-Map2 抗体 (1:200) 以及兔来源的 anti-GFAP 抗 体 (1:500)。 0072 结果显示 ： 移植功能神经再生胶原支架材料组的犬长入损伤区内的新生的神经 元 (图 7A)、 成熟的神经元细胞 (图 7B) 以及神经前体细胞 (图 7C) 的数量明显高于移植 单纯神经再生胶原支架材料组及空白对照组 (control 组 )， 且差异具有统计学意义 (图 7D-7F)， 说明 EGFR。
45、 抗体复合神经再生胶原支架材料能更好的引导脊髓损伤后内源性的神 经前体细胞和神经元向损伤区的迁移。 0073 e) 免疫荧光染色检测损伤区内的感觉和运动神经元及其髓鞘化以及损伤区内功 能性突触的形成 ： 0074 术后九个月， 我们对犬脊髓切片进行运动神经元标志物 5-HT、 感觉神经元标志物 TH 以及髓鞘蛋白标志物 MBP 的免疫荧光染色以确定再生进入损伤区的感觉和运动神 经元 细胞的数量及其髓鞘化的程度 ； 0075 具体染色步骤同 b) 中所述， 所使用的一抗分别为鼠来源的 anti-5-HT 抗体 (1:200)、 anti-TH 抗体 (1:200) 以及兔来源的 anti-GFA。
46、P 抗体 (1:500) 和 anti-MBP 抗体 (1:200)。 0076 结果显示 ： 移植功能神经再生胶原支架材料组的犬长入损伤区内的运动神经元 (图 8A) 和运动神经元 (图 8C) 的数量均显著高于单纯移植神经再生胶原支架材料组及空 白对照组 (control 组 )， 且差异具有统计学意义 (图 8E)。这些再生进入损伤区的感觉和 运动神经元的神经纤维均能有效地髓鞘化(图8B和8D)， 上述结果说明EGFR抗体复合神经 再生胶原支架材料能更好的引导脊髓损伤后运动和感觉神经元的再生， 并能实现再生神经 元的髓鞘化。 0077 此外， 通过对功能性突触标志物 Synaptophy。
47、sin( 一抗为鼠来源的 anti-SYN， 说 明 书 CN 106267368 A 9 8/8 页 10 1:200) 的免疫荧光染色结果表明， 移植单纯神经再生胶原支架材料组及空白对照组 (control 组 ) 的犬在损伤区内功能性突触几乎不能检测到， 而移植功能神经再生胶原支架 材料组的犬损伤区内的 SYN 阳性标志横跨整个损伤区均可被检测到 (图 8F)， 说明 EGFR 抗 体复合神经再生胶原支架材料能具有更好的促进脊髓损伤再生的效果。 0078 f) 术后九个月犬的行为学评分 ： 0079 术后零至九个月， 我们每月均对犬的行为学进行评价， 观测器运动功能的恢复情 况。行为学评。
48、分采用 Olby 评分。在评估过程中， 犬在一个开放的环境中自由移动， 由两名 观察者评分。评分分为 0-14 级， 14 分为功能正常， 0 分为功能完全丧失。观察者为非本组 实验人员， 但熟悉评分细则， Olby 评分标准如下 ： 0080 分数 行为 0 无任何后肢运动或深度疼痛 2 无任何后肢运动， 但尾部自发运动 3 后肢不能承重， 仅有一个关节 ( 髋关节 ) 运动 4 后肢不能承重， 多于一个关节运动， 运动时间小于 50 5 后肢不能承重， 多于一个关节运动， 运动时间大于 50 6 后肢能承重， 但承重时间小于 10 7 后肢能承重， 但承重时间在 10-50之间 8 后肢能。
49、承重， 承重时间大于 50 9 后肢 100承重， 但肌力没有完全恢复， 步态错误时间大于 90 10 后肢 100承重， 但肌力没有完全恢复， 步态错时间在 50-90之间 11 后肢 100承重， 但肌力没有完全恢复， 步态错误时间小于 50 12 肌力正常， 但后肢步态混乱， 错误时间大于 50 0081 13 肌力正常， 但后肢步态混乱， 错误时间小于 50 14 正常步态 0082 行为学评分结果显示 ： 从术后第一月开始， 移植功能神经再生胶原支架材料组的 犬较对照组犬均具有显著性改善 (图 9， 带 * 标志 )， 此外， 自第三月开始， 移植功能神经再 生胶原支架材料组的犬较单纯移植神经再生胶原支架材料组的犬表现出行为学优势 (图 9， 带标志 )， 部分犬能。