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1、(10)申请公布号 CN 101934089 A (43)申请公布日 2011.01.05 CN 101934089 A *CN101934089A* (21)申请号 201010270558.3 (22)申请日 2010.09.01 A61L 27/18(2006.01) A61L 27/52(2006.01) C08J 3/24(2006.01) C08J 3/075(2006.01) C08L 51/08(2006.01) C08L 71/00(2006.01) (71)申请人 北京大学人民医院 地址 100044 北京市西城区西直门南大街 11 号 (72)发明人 陶勇 姜燕荣 郭宝华。
2、 黄延宾 童新明 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 一种可眼内注射的原位交联水凝胶在制备人 工玻璃体中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种原位交联水凝胶在制备人 工玻璃体中的应用 ； 所述原位交联水凝胶， 是由 式(I)所示四臂端巯基聚乙二醇的溶液和式(II) 所示聚合物的溶液混合后， 原位交联制成的 ； 其 中， 式 (I) 中的 m 为大于 1 的整数 ； 式 (II) 中的 n 为大于 1 的整数。将上述两种溶液混合后在无 玻璃体眼内进行填充， 可有效形成凝胶。经细胞 实验和动物体内实验验证均未引起明显炎性反应 和眼内。
3、组织毒性反应， 可作为人工玻璃体使用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 5 页 CN 101934089 A1/1 页 2 1. 原位交联水凝胶在制备人工玻璃体中的应用 ； 所述原位交联水凝胶， 是由式 (I) 所 示四臂端巯基聚乙二醇的溶液和式 (II) 所示聚合物的溶液混合后， 原位交联制成的 ； 式 (I) 式 (II) 其中， 式 (I) 中的 m 为大于 1 的整数 ； 式 (II) 中的 n 为大于 1 的整数。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述溶液中的溶剂均选自。
4、下述任意一种 ： 水、 质量浓度 0.9的氯化钠水溶液和 pH 值为 7.0-8.0 且浓度为 0.01-0.2mol/L 的磷酸盐 缓冲液。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于 ： 所述四臂端巯基聚乙二醇的溶液中 四臂端巯基聚乙二醇的浓度为0.1-500mg/mL， 优选为140-160mg/ml ； 所述式(II)所示聚合 物的溶液中式 (II) 所示聚合物的浓度为 0.1-500mg/mL， 优选为 140-160mg/ml。 4. 根据权利要求 1-3 中任一所述的应用， 其特征在于 ： 所述四臂端巯基聚乙二醇的溶 液和所述式 (II) 所示聚合物的溶液的体积比为。
5、 1 10-10 1， 优选为 2 1-3 1。 5. 根据权利要求 4 所述的应用， 其特征在于 ： 所述四臂端巯基聚乙二醇的溶液中四臂 端巯基聚乙二醇的浓度为 150mg/ml ； 所述式 (II) 所示聚合物的溶液中式 (II) 所示聚合物 的浓度为 150mg/ml ； 所述四臂端巯基聚乙二醇的溶液和式 (II) 所示聚合物的溶液的体积 比为 2 1。 权 利 要 求 书 CN 101934089 A1/4 页 3 一种可眼内注射的原位交联水凝胶在制备人工玻璃体中的 应用 技术领域 0001 本发明涉及一种可眼内注射的原位交联水凝胶在制备人工玻璃体中的应用。 背景技术 0002 玻璃体。
6、切除术是临床上常用的治疗视网膜脱离、 玻璃体出血、 眼后段外伤等眼底 疾患的手术方法。玻璃体被切除后， 需要注入眼内填充物来进行视网膜的顶压复位和维持 眼球外形。常用的眼内填充物有硅油和惰性气体 ( 如 SF6、 C2F6和 C3F8等 )。但硅油填充存 在硅油乳化、 继发性青光眼、 角膜带状变性及并发性白内障等并发症， 必须二次手术取出。 对于那些硅油依赖眼， 硅油取出后即眼球萎缩者， 则无能为力。 而气体眼内填充的时间比较 短暂， 因为气体会不断被眼内组织吸收， 所以在眼内的容积逐渐缩小， 不超过 2 个月的时间 内， 气体会完全吸收。因此， 迄今为止， 临床上缺乏比较理想的眼内填充物。 。
7、发明内容 0003 本发明的目的是提供一种原位交联水凝胶在制备人工玻璃体中的应用。 0004 所述原位交联水凝胶， 是由式 (I) 所示四臂端巯基聚乙二醇 (4ARM-PEG-SH) 的溶 液和式 (II) 所示聚合物 (PEG-S-EMA) 的溶液混合后， 原位交联制成的 ； 0005 0006 式 (I) 0007 0008 式 (II) 0009 其中， 式 (I) 中的 m 为大于 1 的整数 ； 式 (II) 中的 n 为大于 1 的整数。 0010 式 (I) 所示的 4ARM-PEG-SH， 其数均分子量具体可为 10000， 可购于 JenChem， 货号 4ARM-SH-10。
8、K。 0011 式 (II) 所示的 PEG-S-EMA， 其聚合度 n 优选为大于 30 小于 60 的整数。 0012 上述两种溶液中的溶剂均选自下述任意一种 ： 水、 质量浓度 0.9的氯化钠水溶 液和 pH 值为 7.0-8.0 且浓度为 0.01-0.2mol/L 的磷酸盐缓冲液。 0013 所述四臂端巯基聚乙二醇的溶液中四臂端巯基聚乙二醇的质量浓度为 0.1-500mg/mL， 优选为 140-160mg/ml ； 所述 PEG-S-EMA 溶液中 PEG-S-EMA 的质量浓度为 0.1-500mg/mL， 优选为 140-160mg/ml。 0014 所 述 四 臂 端 巯 基。
9、 聚 乙 二 醇 的 溶 液 和 所 述 PEG-S-EMA 的 溶 液 的 体 积 比 为 说 明 书 CN 101934089 A2/4 页 4 1 10-10 1， 优选为 2 1-3 1。 0015 本发明所提供的人工玻璃体替代材料与传统的人工玻璃体替代材料相比， 在眼内 可持续填充， 无明显毒性反应的优点， 并且在结构上模拟原始的天然玻璃体结构， 为亲水 性。 附图说明 0016 图 1 为本发明所制备的 PEG-S-EMA 的核磁共振氢谱谱图。 0017 图 2 为实施例 2 中使用本发明提供的水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔 25 后的玻璃 体腔凝胶照相。 0018 图 3 为实施例 。
10、2 中使用本发明提供的水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔 25 天后的眼 底照相。 0019 图 4 为实施例 2 中使用本发明提供的水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔 25 天后的凝 胶苏木素 - 伊红染色照片。 0020 图 5 为实施例 2 中使用本发明提供的水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔 25 天后的晶 状体照相。 0021 图 6 为实施例 2 中使用本发明提供的水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔 25 天后的视 网膜苏木素 - 伊红染色 (A) 和正常视网膜相比 (B)。 具体实施方式 0022 为了更好的理解本发明， 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。但是本 发明的保护范围并不局限于实施例所表述的范。
11、围。 0023 下述实施例中所述实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法 ； 所述试剂和材料， 如 无特殊说明， 均可从商业途径获得。 0024 下述实施例中所用的四臂端巯基聚乙二醇 (4ARM-PEG-SH)， 数均分子量约为 10000， 购于 JenChem， 货号 4ARM-SH-10K。 0025 下述实施例中所用的 PEG-S-EMA(n 为大于 30 小于 60 的整数 ) 是按照下述方法制 备得到的 ： 0026 将羟端基 PEG( 数均分子量约为 2000， Alfa-Aesar 提供， 货号 B22181)20.0g 溶于 500mL 干燥的二氯甲烷中， 加入三乙胺 8.3。
12、mL、 对甲苯磺酰氯 11.4g， 室温下反应 24 小时， 将 所得产物与硫代乙酸钾 4.5g 在 85下回流 4 小时， 然后将所得产物与 2M 氨的甲醇溶液， 在氮气保护下搅拌 4 小时， 即得到端巯基 PEG。将 9.0g 羟甲基丙烯酸乙酯 (TCI 提供， 货号 H0916) 溶于 75mL 无水乙醚中， 冰浴下滴入 2.3mL 三溴化磷， 冰浴下反应 3 小时后于室温继 续反应 24 小时， 得到溴甲基丙烯酸乙酯。将 20.0g 端巯基 PEG 溶于 300mL 二氯甲烷中， 加 入 3mL 三乙胺， 并在冰浴下滴入 8mL 溴甲基丙烯酸乙酯， 室温下反应 24 小时， 即得到最终。
13、产 品 (PEG-S-EMA)。 0027 所得化合物的结构可以从图 1 的核磁氢谱得到确认。 0028 实施例 1、 本发明的原位交联凝胶的细胞安全性试验 0029 细胞实验步骤如下 ： 0030 1、 将 4ARM-PEG-SH 和 PEG-S-EMA 分别溶于 pH 7.4 浓度为 0.1mol/L 的磷酸盐缓 说 明 书 CN 101934089 A3/4 页 5 冲液中， 配制成浓度均为 150mg/mL 的溶液， 将两者的溶液以体积比为 2 1 在体外混合， 3h 得到凝胶块， 用于细胞实验。 0031 2、 细胞系 ( 大鼠视网膜色素上皮细胞 D407 细胞系 ； 猴眼视网膜血管。
14、内皮细胞 RF/6A)(CRL-1780 细胞系 ) 常规培养， 培养液为 DMEM/F12 1 1( 购于美国 Hyclone 公 司 )， 加入胎牛血清 ( 终浓度为 10 )， 取传至 3-6 代的细胞用于实验。 0032 3、 0.25的胰酶消化细胞， 混匀， 制成细胞悬液， 计数至 50000/ml， 取无菌 96 孔 板， 每孔加入100l细胞悬液， 放入37度5CO2的恒温培养箱内培养， 至细胞融合到70 孔底面积， 给予无血清的培养液培养 24h。 0033 4. 弃掉培养液， 每孔重新加入新鲜的无血清培养液 100l， 不同的组别分别加入 不同浓度的新材料凝胶块 ( 每组设 。
15、5 个重复 )， 对照组不加， 培养箱内继续培养 24h。 0034 5、 弃掉培养液和其内的凝胶块， 每孔加入含 10 CCK-8 的无血清培养液继续培养 3h， 以 450nm 波长测定各孔的吸光度值， 结果见表 1 和表 2。 0035 表 1 大鼠视网膜色素上皮细胞与原位交联凝胶共培养后 CCK8 吸光度值 0036 0037 表 2 猴眼视网膜血管内皮细胞 RF/6A 与新材料共培养后 CCK8 吸光度值 0038 0039 细胞实验的数据表明 ： 大鼠视网膜色素上皮细胞与 10浓度或 15浓度的新材 料凝胶块共培养 24h 后， 与未加凝胶的空白组相比， CCK8 吸光度值差异均不。
16、显著 ( 独立样 本 t 检验， P 0.57 ； P 0.19)。猴眼视网膜血管内皮细胞 RF/6A 与 10浓度或 15浓度 新材料凝胶块共培养 24h 后， 与未加凝胶的空白组相比， CCK8 吸光度值差异亦均不显著 (P 0.52 ； P 0.61)。上述结果表明， 本发明提供的新材料原位交联凝胶没有明显的细胞毒 性反应。 0040 实施例 2、 本发明的原位交联凝胶动物眼内填充安全性实验 0041 试验选取 5 只青紫兰兔。 0042 动物实验步骤如下 ： 说 明 书 CN 101934089 A4/4 页 6 0043 1、 麻醉青紫兰兔。 0044 2、 沿角膜缘剪开半侧球结膜，。
17、 19G 巩膜穿刺刀造灌注孔和玻切孔。 0045 3、 插入灌注头， 打开灌注， 灌注液的配方如下 ： 500ml 乳酸林格氏液中加入 50 葡萄糖 4ml， 地塞米松 (5mg/1ml)1.6ml， 盐酸肾上腺素 (1mg/1ml)0.5ml， 妥布霉素 (8 万 U/1ml)0.2ml。 0046 4、 玻璃体切割头伸入玻璃体腔， 切除全部玻璃体。 0047 5、 将 4ARM-PEG-SH 和 PEG-S-EMA 分别溶于 pH 7.4 浓度为 0.1mol/L 的磷酸盐缓 冲液中， 配制成浓度均为 150mg/mL 的溶液， 将两者的溶液以体积比为 2 1 混合均匀， 注入 玻璃体腔。。
18、 0048 6、 缝合巩膜口和球结膜。 0049 7. 结膜囊涂抹泰利必妥眼膏。 0050 本发明提供的原位交联的聚乙二醇衍生物材料在玻璃体切除后的兔眼内有效形 成凝胶， 形状符合玻璃体腔形状的特点， 并且保持透明， 表面无渗出膜、 出血覆盖 ( 见图 2)。 对水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔25天后的眼底照相(见图3)， 可见视网膜及脉络膜表现正 常， 无出血、 渗出等病理性改变。对兔眼玻璃体腔中的凝胶用苏木素 - 伊红染色 ( 见图 4)， 可见凝胶内部无炎性细胞浸润。 对水凝胶材料填充兔眼玻璃体腔25天后的晶状体照相(见 图 5)， 可见晶状体透明无混浊。由此反映本材料对晶状体没有造成明显毒。
19、性。对水凝胶材 料填充兔眼玻璃体腔25天后的视网膜苏木素-伊红染色(见图6)， 与正常视网膜相比(B)， 两者无明显差异， 由此反映本材料对视网膜没有造成明显毒性。 0051 综上， 原位交联的聚乙二醇衍生物材料在玻璃体切除后的兔眼内有效形成凝胶， 并且保持透明， 无炎性细胞浸润。兔眼的晶状体保持透明， 未出现混浊。视网膜和脉络膜的 各层组织结构存在， 未见出血、 水肿等病理改变。 动物体内实验也证实本材料在眼内填充是 安全的。 说 明 书 CN 101934089 A1/5 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101934089 A2/5 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 101934089 A3/5 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 101934089 A4/5 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 101934089 A5/5 页 11 图 6 说 明 书 附 图 。