谷胱甘肽传递系统.pdf

本发明提供一种传递系统，包括载体或活性物质，以及连接于该载体或活性物质上的谷胱甘肽或其衍生物。本发明还提供一种化合物，包括基团，该基团包括维生素E衍生物或磷脂质衍生物，与该基团连接的聚乙二醇或其衍生物，以及与该聚乙二醇或其衍生物连接的谷胱甘肽或其衍生物。

1.一种传递系统(10)，包括：载体，其中该载体为脂质体(20)；以及连接于该脂质体(20)上的配体(30)，所述配体(30)包括由维生素E衍生物或磷脂质衍生物组成的基团(40)，与基团(40)连接的聚乙二醇或其衍生物(50)，以及与聚乙二醇或其衍生物(50)连接的谷胱甘肽或其衍生物(60)，其中所述维生素E衍生物为α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、α-生育三烯醇、β-生育三烯醇、γ-生育三烯醇、δ-生育三烯醇、琥珀酸α-生育酚、琥珀酸β-生育酚、琥珀酸γ-生育酚、琥珀酸δ-生育酚、琥珀酸α-生育三烯醇、琥珀酸β-生育三烯醇、琥珀酸γ-生育三烯醇、琥珀酸δ-生育三烯醇、醋酸α-生育酚、醋酸β-生育酚、醋酸γ-生育酚、醋酸δ-生育酚、醋酸α-生育三烯醇、醋酸β-生育三烯醇、醋酸γ-生育三烯醇、醋酸δ-生育三烯醇、烟酸α-生育酚、烟酸β-生育酚、烟酸γ-生育酚、烟酸δ-生育酚、烟酸α-生育三烯醇、烟酸β-生育三烯醇、烟酸γ-生育三烯醇、烟酸δ-生育三烯醇、磷酸α-生育酚、磷酸β-生育酚、磷酸γ-生育酚、磷酸δ-生育酚、磷酸α-生育三烯醇、磷酸β-生育三烯醇、磷酸γ-生育三烯醇或磷酸δ-生育三烯醇；其中所述磷脂质衍生物具有下列化学式(I)或(II)化学式(I)中，A为神经鞘氨醇(sphingosine)，R为辛酰基(octanoyl)或棕榈酰基(palmitoyl)；化学式(II)中，A为磷酸乙醇胺(phosphoethanoamine)，R为肉豆蔻酰基(myristoyl)、棕榈酰基(palmitoyl)、硬脂酰基(stearoyl)或油酰基(oleoyl)；其中所述聚乙二醇衍生物为羧酸、马来酰亚胺、PDP、酰胺或生物素的聚乙二醇衍生物；其中所述谷胱甘肽衍生物为TPGS-谷胱甘肽。 2.如权利要求第1项所述的传递系统，其中该脂质体包括卵磷脂。 3.如权利要求第2项所述的传递系统，其中该卵磷脂在脂质体中的摩尔比介于0.5～100％。 4.如权利要求第1项所述的传递系统，其中该脂质体包括氢化卵磷脂。 5.如权利要求第4项所述的传递系统，其中该氢化卵磷脂在脂质体中的摩尔比介于0.5～100％。 6.如权利要求第2或4项所述的传递系统，其中该脂质体还包括胆固醇、水溶性维生素E或十八胺。 7.如权利要求第6项所述的传递系统，其中该胆固醇或水溶性维生素E在脂质体中的摩尔比介于0.005～75％，十八胺的摩尔比介于0.001～25％。 8.如权利要求第1项所述的传递系统，其中该载体还包括活性物质，包封于该载体内部。 9.如权利要求第8项所述的传递系统，其中该活性物质包括小分子化合物、多肽、蛋白质、DNA质体、寡核酸或基因片段。 10.如权利要求第8项所述的传递系统，其中该活性物质在载体中的摩尔比介于0.0005～95％。 11.如权利要求第1项所述的传递系统，其中该载体靶向于器官组织上的或血脑屏障上的谷胱甘肽转运体。 12.如权利要求第8项所述的传递系统，其中该活性物质是对脑内皮细胞具有穿透率。 13.如权利要求第12项所述的传递系统，其中该活性物质的细胞穿透率介于0.01～100％。

技术领域

本发明是关于生物传递系统，特别是关于谷胱甘肽传递系统。

现有技术

物质要进入脑内会因为血脑屏障的阻碍而受到限制，血脑屏障是由许多 脑微血管中的内皮细胞构成，细胞间因为紧密连接(tight junction)，其间隙非 常微小，所以可以提供有效的保护作用，以避免外来毒素进入脑中。目前认 为仅有脂溶性分子及分子量较低的物质才能利用被动扩散(passive diffusion) 的机制通过血脑屏障，进而进入脑中。

所以，一些活性物质，例如专门用于治疗脑部或神经方面疾病的蛋白质 药物，或作用于中枢神经的多肽类止痛药物，因为其分子量大、亲水性高， 所以并不能藉由被动扩散通过血脑屏障进入脑中，并且因为容易遭受血液中 酶分解，无法有效通过血脑屏障，发挥其药效。

目前文献上提及能够递送亲水性或大分子药物穿透血脑屏障的药物传 递系统，除了利用化学修饰增加药物的疏水性藉以通过血脑屏障外，另外就 是利用吸收介导的转运(absorption-mediated transport，AMT)、载体介导的细 胞转运(carrier-mediated transcytosis，CMT)或受体介导的细胞转运 (receptor-mediated trancytosis，RMT)这三种方式将药物载体带进脑中，其中以 吸收介导的转运(AMT)方式进入脑中的，大部分是以带电荷的药物载体为 主，藉由电荷吸附在内皮细胞后，再通过血脑屏障进入脑中。以载体介导的 细胞转运(CMT)方式通过血脑屏障的，大都是一些亲水性的金属离子，如钠、 钾，或是一些二肽(di-peptide)、三肽(tri-peptide)或葡萄糖，借着内皮细胞上 面的转运体(transporter)，进入脑中。而一些大分子，如胰岛素(insulin)、运 铁蛋白(transferrin)或低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)，则是利用受 体介导的细胞转运(RMT)的方式，通过血脑屏障进入脑中。

谷胱甘肽(glutathione，GSH)为一种内源性的抗氧化剂，缺乏时会造成多 种神经性病症。血中的谷胱甘肽(GSH)浓度长期过低也将会造成慢性疲劳综 合症(chronic fatigue syndrome，CFS)。

1988年，Kiwada Hiroshi等在JP63002922专利中，曾提及将长碳链的 酰基谷胱甘肽(N-acylglutathione)(例如棕榈酸谷胱甘肽 (N-palmitoylglutathione))与磷脂质(例如磷脂胆碱(phosphotidylcholine))制备 成脂质体，可利用其蓄积于肝脏的特性，靶向肝脏，增加药物于肝脏的递送 速度，进而治疗肝脏相关疾病。

1994年时，Berislav V.Zlokovic等曾报导，利用天竺鼠可以证实谷胱甘 肽(GSH)这种三肽可以经由特殊传递途径，不被分解破坏，完整地自血液进 入脑微血管中，再通过血脑屏障(blood brain barrier，BBB)后，进入天竺鼠的 脑中，此特殊途径为谷胱甘肽转运体(GSH-transporter)。

在1995年时，Berislav V.Zlokovic也曾于其发表的文献中提及谷胱甘肽 (GSH)以毫摩尔(millimolar)的浓度存在于脑星状细胞(astrocyte)及内皮细胞 (endothelium)中。

Ram Kannan等在1995年的文献中曾报导，脑内皮细胞对谷胱甘肽 (GSH)的吞噬作用与钠离子浓度有关。若钠离子较低，会抑制脑内皮细胞对 谷胱甘肽(GSH)的吞噬作用。同时并指出，钠依赖型谷胱甘肽转运体 (Na-dependent GSH transporter)负责吞噬作用，位于血脑屏障的血液侧 (luminal side)。非钠依赖型谷胱甘肽转运体(Na-independent GSH transporter) 负责排出作用(efflux)，位于血脑屏障的脑腔侧(abluminal side)。并且以大鼠 及天竺鼠的脑，经表达转录后，建立大白鼠肝小管谷胱甘肽转运体(rat hepatic canalicular GSH transporter，RcGshT)系统，以分析cDNA片段(片段5，7～8及 11～12)的方式，证实其中片段7为钠依赖型谷胱甘肽转运体。片段5及11 为非钠依赖型谷胱甘肽转运体。

在1999年的文献中，使用小鼠脑内皮细胞株(mouse brain endothelial cell line，MBEC-4)作为血脑屏障的体外模型，并且证实钠依赖型谷胱甘肽转运体 (Na-dependent GSH transporter)是位于小鼠脑内皮细胞株的血液侧。

Ram Kannan等更在2000年时，证实在人类脑血管内皮细胞(human cerebrovascular endothelial cell，HCEC)中，谷胱甘肽(GSH)的确是利用钠依赖 型谷胱甘肽转运体(Na-dependent GSH transporter)来递送进入血脑屏障。并且 证实此钠依赖型谷胱甘肽转运体是存在于脑血管内皮细胞的血液侧原生质 膜(luminal plasma membrane)。

2003年，Zhao Zhiyang等在US2003/109555专利中，也提到将谷胱甘 肽s-转移酶/谷胱甘肽((glutathione s-transferase，GST)/(glutathione，GSH))，利 用磺胺(sulfonamide)共价键，结合于抗癌药物上，制备成药物前体后，能够 主动靶定于特定的癌细胞上，并且能在切断磺胺共价键后，释放药物以达到 疗效。所以，此改质方法可以保护药物的胺基团，增加药物的溶解度及改变 药物于身体的吸收及分布。此专利的重点，主要着重于如何以磺胺共价键键 合，将谷胱甘肽s-转移酶/谷胱甘肽(GST/GSH)合成于特定抗癌药物上。

发明内容

本发明提供一种传递系统，包括载体或活性物质，以及连接于该载体或 活性物质上的谷胱甘肽或其衍生物。

本发明还提供一种化合物，包括基团，该基团包括维生素E衍生物或磷 脂质衍生物，与该基团连接的聚乙二醇或其衍生物，以及与该聚乙二醇或其 衍生物连接的谷胱甘肽或其衍生物。

为让本发明的上述目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举较佳实施 例，并配合所附图，作详细说明如下：

附图说明

图1是为本发明的传递系统。

图2是为本发明不同甲硫脑啡呔(met-enkephalin)载体的最大可能效果 (maximal possible effect，MPE)。

图3是为本发明不同甲硫脑啡呔载体的曲面下面积(area under curve， AUC)。

图4是为本发明不同加巴喷丁(gabapentin)载体的最大可能效果。

图5是为本发明不同加巴喷丁载体的曲面下面积。

图6是为本发明未包封的甲硫脑啡呔与甲硫脑啡呔载体的血中稳定性比 较。

主要组件符号说明

10～传递系统；

20～脂质体；

30～配体；

40～基团(维生素E衍生物或磷脂质衍生物)；

50～聚乙二醇或其衍生物；

60～谷胱甘肽或其衍生物。

具体实施方式

本发明提供一种传递系统，包括载体或活性物质，以及连接于载体或活 性物质上的谷胱甘肽谷胱甘肽或其衍生物。

上述载体可包括纳米微粒、高分子纳米微粒、固化脂质纳米微粒、高分 子微囊、脂质体、微乳或液态纳米微粒。而脂质体可包括例如大豆卵磷脂(soy lecithin)的卵磷脂类或例如氢化大豆卵磷脂(hydrogenated soy lecithin)的氢化 卵磷脂类成分。

上述脂质体还可包括胆固醇、水溶性维生素E或十八胺(octadecyl amine)，以增加血中稳定性或电荷数量。在脂质体中，卵磷脂或氢化卵磷脂 的摩尔比大体介于0.5～100％，胆固醇或水溶性维生素E的摩尔比大体介于 0.005～75％，而十八胺的摩尔比大体介于0.001～25％。

此外，本发明载体可包封活性物质，例如小分子化合物、多肽、蛋白质、 DNA质体、寡核酸或基因片段。此活性物质于载体中的摩尔比大体介于 0.0005～95％，而载体的包封率大体介于0.5～100％。

此靶向载体或活性物质可靶向体内各器官组织上的谷胱甘肽转运体 (glutathione transporter)，例如心脏、肺脏、肝脏、肾脏或血脑屏障上的谷胱 甘肽转运体。

特别是，包封于载体内的活性物质可藉由此靶向载体顺利通过由脑内皮 细胞组成的血脑屏障层，其穿透率大体介于0.01～100％。

本发明还提供一种化合物，包括由维生素E衍生物或磷脂质衍生物组成 的基团，与基团连接的聚乙二醇或其衍生物，以及与聚乙二醇或其衍生物连 接的谷胱甘肽或其衍生物。

上述维生素E衍生物可包括α-生育酚(α-tocopherol)、β-生育酚 (β-tocopherol)、γ-生育酚(γ-tocopherol)、δ-生育酚(δ-tocopherol)、α-生育三烯 醇(α-tocotrienol)、β-生育三烯醇(β-tocotrienol)、γ-生育三烯醇(γ-tocotrienol)、 δ-生育三烯醇(δ-tocotrienol)、琥珀酸α-生育酚(α-tocopherol succinate)、琥珀 酸β-生育酚(β-tocopherol succinate)、琥珀酸γ-生育酚(γ-tocopherol succinate)、琥珀酸δ-生育酚(δ-tocopherol succinate)、琥珀酸α-生育三烯醇 (α-tocotrienol succinate)、琥珀酸β-生育三烯醇(β-tocotrienol succinate)、琥珀 酸γ-生育三烯醇(γ-tocotrienol succinate)、琥珀酸δ-生育三烯醇(δ-tocotrienol succinate)、醋酸α-生育酚(α-tocopherol acetate)、醋酸β-生育酚(β-tocopherol acetate)、醋酸γ-生育酚(γ-tocopherol acetate)、醋酸δ-生育酚(δ-tocopherol acetate)、醋酸α-生育三烯醇(α-tocotrienol acetate)、醋酸β-生育三烯醇 (β-tocotrienol acetate)、醋酸γ-生育三烯醇(γ-tocotrienol acetate)、醋酸δ-生育 三烯醇(δ-tocotrienol acetate)、烟酸α-生育酚(α-tocopherol nicotinate)、烟酸 β-生育酚(β-tocopherol nicotinate)、烟酸γ-生育酚(γ-tocopherol nicotinate)、 烟酸δ-生育酚(δ-tocopherol nicotinate)、烟酸α-生育三烯醇(α-tocotrienol nicotinate)、烟酸β-生育三烯醇(β-tocotrienol nicotinate)、烟酸γ-生育三烯醇 (γ-tocotrienol nicotinate)、烟酸δ-生育三烯醇(δ-tocotrienol nicotinate)、磷酸α- 生育酚(α-tocopherol phosphate)、磷酸β-生育酚(β-tocopherol phosphate)、磷 酸γ-生育酚(γ-tocopherol phosphate)、磷酸δ-生育酚(δ-tocopherol phosphate)、磷酸α-生育三烯醇(α-tocotrienol phosphate)、磷酸β-生育三烯醇 (β-tocotrienol phosphate)、磷酸γ-生育三烯醇(γ-tocotrienol phosphate)或磷酸 δ-生育三烯醇(δ-tocotrienol phosphate)。

上述磷脂质衍生物可具有下列化学式(I)或(II)

R1-A1-(I)，

化学式(I)中，A1可为神经鞘氨醇(sphingosine)，R1可包括辛酰基(octanoyl) 或棕榈酰基(palmitoyl)。化学式(II)中，A2可为磷酸乙醇胺 (phosphoethanoamine)，R2可包括肉豆蔻酰基(myristoyl)、棕榈酰基(palmitoyl)、 硬脂酰基(stearoyl)或油酰基(oleoyl)。

上述聚乙二醇或其衍生物的聚合度(polymerization number)大体介于 6～210。此聚乙二醇或其衍生物的分子量可随连接不同的维生素E衍生物或 磷脂质衍生物而改变，例如，当连接基团为维生素E衍生物时，聚乙二醇或 其衍生物的分子量大体介于300～10,000，当连接基团为例如化学式(I)所示的 磷脂质衍生物时，聚乙二醇或其衍生物的分子量大体介于750～5,000，当连 接基团为例如化学式(II)所示的磷脂质衍生物时，聚乙二醇或其衍生物的分 子量大体介于350～5,000。

上述聚乙二醇衍生物可包括羧酸、马来酰亚胺(maleimide)、PDP、酰胺 (amide)或生物素(biotin)。

请参阅图1，说明本发明的传递系统。传递系统10包括脂质体20与连 接其上的配体30。配体30包括由维生素E衍生物或磷脂质衍生物组成的基 团40，与基团40连接的聚乙二醇或其衍生物50，以及与聚乙二醇或其衍生 物50连接的谷胱甘肽或其衍生物60。

本发明利用连接谷胱甘肽配体的靶向载体运送例如蛋白质、多肽或小分 子化合物的活性物质，使活性物质藉由载体介导的细胞转运(carrier-mediated transcytosis，CMT)或受体介导的细胞转运(receptor-mediated transcytosis， RMT)的方式通过血脑屏障，进行脑部或神经疾病的治疗。

实施例

实施例1

TPGS-谷胱甘肽制备

首先，取1当量的N-Cbz谷氨酰胺(N-Cbz glutamine)与1当量的羟基琥 珀硫亚胺(N-hydroxysuccinimide，HOSu)溶于1 5毫升的二甲醚(dimethyl ether， DME)溶剂，并冷却至摄氏0度。之后，在相同温度下，加入1当量的二环 己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide，DIC)搅拌反应4小时。反应混合物 于冷冻静置2小时后过滤。

过滤掉二环己基尿素(dicyclohexylurea，DCU)并抽干溶剂后，所得的纯化 合物产率为98％。接着，将残余物浸于乙醚/己烷溶液中并过滤。之后，在 烘箱中干燥，以得到白色固体。

之后，将上述白色固体、1当量的半胱氨酸锂与5当量的碳酸钠混合溶 于15毫升水中，并加入乙腈溶剂，以生成步骤2的中间产物。上述混合物 继续在室温中强烈搅拌3～6小时，直至TLC分析结果指出步骤2的中间产 物消失为止。接着，以200毫升的水清洗溶液，有机层以硫酸钠干燥并过滤。 最后，在烘箱中浓缩，以得到化合物2。

接着，将化合物2与1当量的羟基琥珀硫亚胺(N-hydroxysuccinimide， HOSu)溶于15毫升的二甲醚(dimethyl ether，DME)溶剂，并冷却至摄氏0度。 之后，在相同温度下，加入1当量的二环己基碳二亚胺 (dicyclohexylcarbodiimide，DIC)搅拌反应4小时。反应混合物于冷冻静置2 小时后过滤。

过滤掉二环己基尿素并抽干溶剂后，加入1当量的甘氨酸锂与5当量的 碳酸钠混合溶于15毫升水中，并加入乙腈溶剂，以生成步骤4的中间产物。 上述混合物继续在室温中强烈搅拌3～6小时，直至TLC分析结果指出步骤4 的中间产物消失为止。接着，以200毫升的水清洗溶液，有机层以硫酸钠干 燥并过滤。最后，在烘箱中浓缩，以得到化合物3。

接着，加入琥珀酸α-生育酚聚乙二醇1000(α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS-OH)与化合物3进行偶合酯化反应，以得到化合 物4。

接着，加入10％的Pd/C催化剂(上述三肽-TPGS重量的0.2倍)至溶有化 合物4的100毫升甲醇中。之后，将上述悬浮液于室温充满氢气环境中搅拌 16小时并过滤。残留物以乙醇结晶，以得到化合物5。

接着，在二氯甲烷存在下，加入三乙基硅烷(triethylsilane)与TFA对化合 物5进行去保护，以得到化合物6，即为TPGS-谷胱甘肽化合物。

甲硫脑啡呔载体溶液制备

首先，取0.5克的脂质置于12.5毫升的氧化锆研磨钵中。本实施例脂质 组成包括83.2％的大豆磷脂胆碱(soybean phosphatidylcholine，SPC)、4.2％的 琥珀酸α-生育酚聚乙二醇(PEG1500)(α-tocopherol succinate-polyethylene glycol(PEG1500)，TPGS)、4.2％的谷胱甘肽-TPGS(glutathione-TPGS， GSH-TPGS)以及8.4％的胆固醇。同时，取适量的甲硫脑啡呔溶于10mM的 磷酸水溶液(pH7.4)，以制备4％的药物溶液。之后，取0.5毫升的药物溶液 与5颗氧化锆研磨球(直径10毫米)置于研磨钵中，并以500rpm研磨1小时， 以形成黏稠膏状物。之后，取0.2克的黏稠膏状物置于10毫升烧杯中，并加 入1.8毫升的磷酸水溶液(10mM，pH7.4)，于室温下进行水合反应1小时， 即可获得经谷胱甘肽(GSH)修饰的甲硫脑啡呔脂质体溶液。脂质体中的甲硫 脑啡呔浓度为0.56mg/mL，包封率达33.3％。脂质体平均粒径为173.1纳米， 分子量多分散性指数(polydispersity index，PI)为0.243。

实施例2～6

实施例2～6的制备方法与实施例1类似，其差别在于载体组成的不同， 请参阅表1与表2。

表1(摩尔比)

实施例 大豆 卵磷脂   氢化大豆   卵磷脂 胆固醇 TPGS TPGS- 谷胱甘肽 十八胺   甲硫脑啡呔     2     10     -     1     -     1     -     0.48     3     10     -     1     -     1     1     1.60     4     9     1     1     0.5     0.5     -     1.60     5     9     1     1     0.75     0.25     -     1.60     6     9     1     1     -     1     -     1.60

表2

实施例     平均例径     (纳米) 分子量 多分散性指数     甲硫脑啡呔浓度     (mg/mL)     包封率     (％)     2     162.7     0.227     0.56     31.70     3     161.4     0.046     4.00     70.33

    4     214.1     0.003     3.25     68.85     5     165.3     0.137     3.40     68.48     6     214.5     0.116     3.99     80.78

实施例7

加巴喷丁载体溶液制备

首先，取0.5克的脂质置于12.5毫升的氧化锆研磨钵中。本实施例脂质 组成包括83.2％的大豆磷脂胆碱(soybean phosphatidylcholine，SPC)、4.2％的 琥珀酸α-生育酚盐聚乙二醇(PEG1500)(α-tocopherol succinate-polyethylene glycol(PEG1500)，TPGS)、4.2％的谷胱甘肽-TPGS(glutathione-TPGS， GSH-TPGS)以及8.4％的胆固醇。同时，取适量的加巴喷丁溶于10mM的磷 酸水溶液(pH7.4)，以制备10％的药物溶液。之后，取0.5毫升的药物溶液与 5颗氧化锆研磨球(直径10毫米)置于研磨钵中，并以500rpm研磨1小时， 以形成黏稠膏状物。之后，取0.2克的黏稠膏状物置于10毫升烧杯中，并加 入1.8毫升的磷酸水溶液(10mM，pH7.4)，于室温下进行水合反应1小时， 即可获得经谷胱甘肽(GSH)修饰的加巴喷丁脂质体溶液。脂质体中的加巴喷 丁浓度为1.08mg/mL，包封率达35.7％。脂质体平均粒径为147.7纳米，分 子量多分散性指数(polydispersity index，PI)为0.157。

对比例1

甲硫脑啡呔载体溶液制备

首先，取0.5克的脂质置于12.5毫升的氧化锆研磨钵中。本实施例脂质 组成包括83.2％的大豆磷脂胆碱(soybean phosphatidylcholine，SPC)、8.4％的 琥珀酸α-生育酚聚乙二醇(PEG1500)(α-tocopherol succinate-polyethylene glycol(PEG1500)，TPGS)以及8.4％的胆固醇。同时，取适量的甲硫脑啡呔溶 于10mM的磷酸水溶液(pH7.4)，以制备4％的药物溶液。之后，取0.5毫升 的药物溶液与5颗氧化锆研磨球(直径10毫米)置于研磨钵中，并以500rpm 研磨1小时，以形成黏稠膏状物。之后，取0.2克的黏稠膏状物置于10毫升 烧杯中，并加入1.8毫升的磷酸水溶液(10mM，pH7.4)，于室温下进行水合 反应1小时，即可获得甲硫脑啡呔脂质体溶液。脂质体中的甲硫脑啡呔浓度 为0.57mg/mL，包封率达31.1％。脂质体平均粒径为164.1纳米，分子量多 分散性指数(polydispersity index，PI)为0.281。

对比例2～3

对比例2～3的制备方法与对比例1类似，其差别在于载体组成的不同， 请参阅表3与表4。

表3(摩尔比)

  对比例   大豆   卵磷脂   氢化大豆   卵磷脂 胆固醇 TPGS 十八胺   甲硫脑啡呔     2     10     -     1     1     1     1.60     3     9     1     1     1     -     1.60

表4

  比较   实施例     平均例径     (纳米) 分子量 多分散性指数     甲硫脑啡呔浓度     (mg/mL)   包封率   (％)     2     159.7     0.103     3.58   70.17     3     149.0     0.168     3.22   69.67

对比例4

加巴喷丁载体溶液制备

首先，取0.5克的脂质置于12.5毫升的氧化锆研磨钵中。本实施例脂质 组成包括83.2％的大豆磷脂胆碱(soybean phosphatidylcholine，SPC)、8.4％的 琥珀酸α-生育酚聚乙二醇(PEG1500)(α-tocopherol succinate-polyethylene glycol(PEG1500)，TPGS)以及8.4％的胆固醇。同时，取适量的加巴喷丁溶于 10mM的磷酸水溶液(pH7.4)，以制备10％的药物溶液。之后，取0.5毫升的 药物溶液与5颗氧化锆研磨球(直径10毫米)置于研磨钵中，并以500rpm研 磨1小时，以形成黏稠膏状物。之后，取0.2克的黏稠膏状物置于10毫升烧 杯中，并加入1.8毫升的磷酸水溶液(10mM，pH7.4)，于室温下进行水合反 应1小时，即可获得加巴喷丁脂质体溶液。脂质体中的加巴喷丁浓度为 1.17mg/mL，包封率达38.5％。脂质体平均粒径为155.8纳米，分子量多分散 性指数(polydispersity index，PI)为0.186。

甲硫脑啡呔脂质体体外穿透率测试1

本发明利用模拟人体血脑屏障的RBE4/glioma细胞模型量测甲硫脑啡呔 的穿透率。实施例1～2(经谷胱甘肽修饰)及对比例1(未经谷胱甘肽修饰)的测 试结果，请参阅表5。

表5

    实施例   药物剂量(μg)   穿透率(％)   标准差     对比例1     182.6     3.4     0.6     实施例1     167.7     9.8     1.3     实施例2     165.2     9.8     1.2

测试结果发现，实施例1、2的穿透率(9.8％)明显较对比例1(3.4％)高出 许多，大约2.82倍。

甲硫脑啡呔脂质体体外穿透率测试2

本发明利用模拟人体血脑屏障的RBE4/glioma细胞模型量测甲硫脑啡呔 的穿透率。实施例3(经谷胱甘肽修饰)及对比例2(未经谷胱甘肽修饰)的测试 结果，请参阅表6。

表6

    实施例 药物剂量(μg)   穿透率(％) 标准差 对比例2     250.0     3.55   0.36 实施例3     250.0     6.99   1.43 实施例3(预先给予谷胱甘肽)     250.0     0.25   0.03

测试结果发现，实施例3的穿透率(6.99％)明显较对比例2(3.55％)高出许 多，大约1.96倍。此外，若先以谷胱甘肽与细胞培养30分钟后，再测试实 施例3的穿透率，结果发现穿透率降低0.25％。原因是先行加入的谷胱甘肽 会先将细胞上的谷胱甘肽受体占满，造成实施例3无法经由与谷胱甘肽受体 的结合，而通过血脑屏障。所以，可以证实谷胱甘肽-甲硫脑啡呔脂质体配 方，是经由与谷胱甘肽受体的结合，诱发受体介导的细胞转运 (receptor-mediated transcytosis)或载体介导的细胞转运(carrier-mediated transcytosis)作用而通过血脑屏障。

甲硫脑啡呔脂质体热板测试

本发明利用热板药效实验测试小鼠静脉注射给药后，在摄氏55度的热 板上对热的止痛效果。结果请参阅图2，甲硫脑啡呔溶液以30mg/kg的剂量 给药后，并无明显止痛效果产生，证实未经靶向修饰的甲硫脑啡呔无法经由 静脉注射小鼠产生药效。对比例3为未经谷胱甘肽修饰的甲硫脑啡呔脂质体 配方，在30mg/kg的给药剂量下，给药90分钟后，可达到最大可能效果(MPE ＝13％)。实施例5为经过谷胱甘肽修饰的甲硫脑啡呔脂质体配方，在30mg/kg 的给药剂量下，给药60分钟后，可达到最大可能效果(MPE＝37％)。继续参 阅图3，由曲线下面积(area under curve，AUC)数据可发现，实施例5的止痛 效果为对比例3的3.2倍，更为甲硫脑啡呔溶液止痛效果的14.7倍。由此可 证实经谷胱甘肽修饰的药物载体，的确可有效保护药物并穿透血脑屏障，达 到止痛效果。

加巴喷丁脂质体热板测试

本发明利用热板药效实验测试小鼠静脉注射给药后，在摄氏55度的热 板上对热的止痛效果。结果请参阅图4，加巴喷丁溶液以30mg/kg的剂量给 药后，并无明显止痛效果产生，证实未经靶向修饰的加巴喷丁无法经由静脉 注射小鼠产生药效。对比例4为未经谷胱甘肽修饰的加巴喷丁脂质体配方， 在10mg/kg的给药剂量下，给药270分钟后，可达到最大可能效果(MPE＝ 3.15％)。实施例7为经过谷胱甘肽修饰的加巴喷丁脂质体配方，在10mg/kg 的给药剂量下，给药180分钟后，可达到最大可能效果(MPE＝4.47％)。继 续参阅图5，由曲线下面积(area under curve，AUC)数据可发现，实施例7的 止痛效果为对比例4的1.54倍，更为加巴喷丁溶液止痛效果的2.76倍。由 此可证实经谷胱甘肽修饰的药物载体，的确可有效保护药物并穿透血脑屏 障，达到止痛效果。

甲硫脑啡呔脂质体血中稳定性测试

首先，取实施例5制作的载体溶液与胎牛血清(FBS)以1∶1(体积比)的 比例混合，并置于摄氏37度的水浴。待分别0、1、2及4小时后，取出上 述混合液进行柱层析分析(Sephrox CL-4B，75mm×120mm)。之后，测定甲硫 脑啡呔于脂质体内的残留浓度，结果请参阅图6。

结果发现，实施例5制作的载体溶液，置血清中4小时后，其甲硫脑啡 呔浓度仍维持起始浓度的93％以上。然未包封的甲硫脑啡呔在血中的残存量 却不到2％。由此可知，本发明载体确实可提升药物在血液中的稳定性。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何 熟习此项技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作更动与润饰，因 此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。