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一种微管蛋白抑制剂磷酸酯及其组合物和用途，本发明公开了一种式Ia1所示的化合物或其药学上可接受的盐， 本发明所述化合物通过酶促和/或非酶促机制，可以水解生成具有微管抑制活性的药物原型。本发明所述化合物相对于药物原型具有更好的溶解性，具有更高的药效。本发明的化合物适合制成多种剂型的药物，广泛用于治疗肿瘤疾病。

1.一种式Ia1所示的化合物或其药学上可接受的盐，

2.如权利要求1所述化合物，其特征在于所述药学上可成的盐具有如下结构式：

M_l、M₂相同或不同，为H⁺、K⁺、Na⁺或NH₄⁺，且M_l、M₂不同时为H⁺。
3.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备具有微管蛋白抑制活性药
物中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述具有微管蛋白抑制活性药物为抗肿瘤药物。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述肿瘤包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉
瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉
瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢
癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳头状腺
癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、
胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胧癌、上皮癌、神
经胶质瘤、星细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、
听觉神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤以及视网膜母细胞瘤。
6.一种药物组合物，其特征在于包含如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的
盐作为药物活性成分以及药学上可接受的辅料。

一种微管蛋白抑制剂磷酸酯及其组合物和用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体而言，本发明涉及作为微管蛋白抑制剂磷酸酯或药学上
可接受的盐的化合物、包含所述化合物的药物组合物、以及所述化合物和药物组合物在制备
药物和治疗相关疾病中的用途。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康的常见疾病。寻找有效的抗肿瘤药物与方法，彻
底攻克癌症，是一项世界性的难题。虽然抗肿瘤药物的化学结构和作用机制是多种多样的，
但是目前临床上常用的抗肿瘤药物普遍存在对实体瘤疗效较差、毒副作用大以及容易产生多
药耐药性等诸多缺陷。因此发现高效低毒的新型抗肿瘤药物，仍是一项极其重要的研究课
题。

微管蛋白抑制剂是目前临床上应用的一类非常重要的抗肿瘤药物。它们作用于细胞
的微管蛋白，从而阻止细胞正常的有丝分裂。这类药物大部分都来源于天然产物，主要包
括：秋水仙碱、喜树碱、长春碱、紫杉醇以及鬼白毒素等。

微管是广泛存在于真核细胞的胞质内，由αβ两种微管蛋白聚合而成的管状聚合
物。作为构成细胞骨架的主要成分之一，微管在维持细胞形态，参与细胞的收缩和胞质内物
质的运输等方面发挥着重要的作用。尤其是其在细胞分裂前期解聚重组形成纺锤体参与到细
胞有丝分裂中的这一特殊的生物学功能使之成为抗肿瘤药物的重要靶点。肿瘤细胞具有快速
增殖的能力，若抑制其纺锤体的形成，必将影响细胞有丝分裂的正常进行，使得肿瘤细胞生
长停滞于G2/M期。二十世纪初以微管为靶点的紫杉醇类药物在临床上的成功应用激起了人
们寻找和改造新型微管类靶点药物的浓厚兴趣。尽管人们对紫杉醇不断地进行结构改造和修
饰但其水溶性差，易产生多药耐药以及毒副作用强等问题还是限制了其临床上的广泛运用。
寻找新型的微管靶点药物一直是抗肿瘤药物学领域研究的热点之一，直到1987年美国国家
癌症研究所Pettit等从南非矮生柳树(Combretumcaffrum)中发现了天然活性产物CA-4。
CA-4是一类结构简单的顺式二苯乙烯类化合物,它是目前已知的微管蛋白抑制剂中活性最强
的化合物之一。然而CA-4水溶性差、生物利用度低，而且给药后CA-4很容易转变为无药
理活性的结构相对稳定的反式结构。因此，为了克服这一缺点，国际上近年来围绕CA-4的
结构进行改造，作了大量的工作，已合成了数百个CA-4衍生物。例如以下式I表示的化合
物1其为含有二氮杂卓官能团CA-4衍生物，能有效抑制微管蛋白聚集及肿瘤细胞增殖，具
有抗肿瘤活性(参见UbaldinaGalli等人，Design,Synthesis,andBiologicalEvaluationof
Combretabenzodiazepines:ANovelClassofAnti-TubulinAgents.J.Med.Chem.2015,58,1345-
1357)。

式I(化合物1)

然而，研究表明，化合物1溶解度很差(少于0.1mg/ml)，分子中的酚羟基在肝微粒体中与
葡萄糖醛酸结合，发生II相代谢，快速排出体外，导致化合物1的体内半衰期短(参见
UbaldinaGalli等人，Design,Synthesis,andBiologicalEvaluationofCombretabenzodiazepines:
ANovelClassofAnti-TubulinAgents.J.Med.Chem.2015,58,1345-1357)。限制了其在治疗肿
瘤疾病方面的应用。

发明内容

为了改善化合物1的溶解性，从而优化化合物1抗肿瘤活性，本发明有针对性地设
计了化合物1的磷酸酯及药学上可接受的盐，并通过大量实验测定化合物1磷酸酯及药学上
可接受的盐的溶解度以及对裸鼠的抗肿瘤活性。本发明制备得到化合物1的磷酸酯及药学上
可接受的盐溶解性明显高于化和物1，延长其在动物体内的半衰期，增强其在裸鼠的抗肿瘤
药效。

因此，本发明的一个目的在于提供一种作为微管蛋白抑制剂磷酸酯的化合物或其药
物可接受的盐，以满足目前对于抗肿瘤类药物的需求。

本发明的另一个目的在于提供以所述化合物或其药物可接受的盐为活性成分的药物
组合物。

本发明的又一个目的在于提供所述化合物或其药物可接受的盐或药物组合物在制药
方面的用途。

本发明的还一个目的在于提供采用所述化合物或其药物可接受的盐或采用所述药物
组合物用于治疗肿瘤相关疾病的方法。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下:

一种式Ia1所示的化合物或其药学上可接受的盐，

上述化合物Ia1为化合物1的磷酸酯。

进一步的，式Ia1所示的化合物可以形成药学上可成的盐，优选的，所述药学上可成的盐具
有如下结构式：

式Ia

M_l、M₂相同或不同，为H⁺、K⁺、Na⁺或NH₄⁺，且M_l、M₂不同时为H⁺。

根据本发明的具体实施方式，本发明提供式Ia所示的化合物，其中所述式Ia所示的
化合物的结构分别如下式所示：

优选地，本发明提供的化合物的结构分别如式Ia1、Ia2、Ia3、Ia4、Ia5，进一步优选如式
Ia4所示。

再一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含式Ia所述的化合物以及
药学上可接受的辅料。

根据具体剂型和施用方式，所述药物组合物中的药学上可接受的辅料可以包括下述
的一种或多种:稀释剂、增溶剂、崩解剂、悬浮剂、润滑剂、粘合剂、填充剂、矫味剂、甜
味剂、抗氧化剂、表面活性剂、防腐剂、包裹剂、和色素等。

所述药物组合物可以为临床施用的任何剂型，例如片剂、栓剂、分散片、肠溶片、
咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小针、注射用冻干
粉针或大输液。

优选地，本发明提供的药物组合物经胃肠外输注、局部施用或口服施用。进一步优
选经胃肠外输注施用，例如采用静脉点滴、静脉注射和肌肉注射施用。

又一方面，本发明提供上述化合物上述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物
用于抗肿瘤治疗。示例性肿瘤病症包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源
性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、
尤文氏瘤、平滑肌瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞
癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气
管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤、
子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胧癌、上皮癌、神经胶质瘤、星细胞瘤、成神
经管细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听觉神经瘤、少突神经胶质
瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、以及视网膜母细胞瘤。

并且，本发明还提供上述化合物或所述药物组合物在制备微管蛋白抑制活性药物中
的用途。

综上所述，本发明提供了一种新型化合物，所述化合物可作为具有微管蛋白抑制剂
(具体为化合物1)的前药。实验证明，本发明的化合物通过酶促和/或非酶促机制，可以产生
具有活性的微管蛋白抑制剂化合物1，本发明所述化合物的溶解度明显高于化合物1，其中
化合物Ia4、Ia5的溶解度是化合物1的100倍以上，在动物体内的半衰期提高到大于6小
时，在裸鼠的抗肿瘤药效提高1.5倍。因此本发明的化合物适合制成多种剂型的药物，以广
泛用于治疗肿瘤疾病。

附图说明

图1为化合物Ia4体内抑瘤结果图((A)各组小鼠图片，(B)各组小鼠的剥离肿瘤图片；
(C)给药期间各组肿瘤重量图；(D)给药期间各组肿瘤体积图)。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解
的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是
为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

化合物1可参照已发表文献制备。(Design,Synthesis,andBiologicalEvaluationof
Combretabenzodiazepines:ANovelClassofAnti-TubulinAgents.J.Med.Chem.2015,58,1345-
1357)。

实施例1化合物Ia1的制备

第一步8-甲氧基-2-氧代-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-9-磷酸
二乙酯(M1)的制备

将9-羟基-8-甲氧基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1,3-二氢-2H-苯并[e][1,4]二氮杂-2-酮(化
合物物1，20mmol)置于100ml圆底烧瓶中，用干燥的二氯甲烷溶解并冷却到-5℃，加入三
乙胺(120mmol)。搅拌反应5分钟，缓慢加入四氯化碳稀释的亚磷酸二乙酯(70
mmmol)。反应液-5℃搅拌过夜。加入0.5mmol/mlKH₂PO₄溶液淬灭反应，分离有机相并
用饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。有机层减压蒸馏得到粗产品，粗产品经柱层析纯
化(二氯甲烷/甲醇，100:1)得到黄色油状物6.78g。产率66.7％。¹HNMR(400MHz,
DMSO-d⁶)δ8.76–8.72(m,1H),8.06–8.02(m,2H),7.45–7.38(m,1H),6.84(dd,J＝18.9,3.9
Hz,3H),4.11–3.97(m,4H),3.85–3.81(m,9H),3.73–3.69(m,3H),1.33–1.24(m,6H)；

第二步8-甲氧基-2-氧代-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-9-基二
氢磷酸酯(Ia1)的制备。

将8-甲氧基-2-氧代-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-9-磷酸二乙酯
(M1,12mmol)置于100ml圆底烧瓶中，用干燥的二氯甲烷溶解，加入三甲基溴硅烷(240
mmol)，室温搅拌反应24小时，减压蒸馏除去溶剂得到粗产品。粗品用甲醇重结晶得到化
合物Ia12.84g。黄色固体。产率52.3％。¹HNMR(400MHz,D₂O)δ8.44–8.40(m,1H),8.06
–8.02(m,2H),7.45–7.38(m,1H),6.84(dd,J＝18.9,3.9Hz,3H),3.85–3.81(m,9H),3.73–
3.69(m,3H)。

实施例2化合物Ia2的制备

将Ia1(1.0mmol)置于5ml圆底烧瓶中，加纯净水2ml，并加入1MNaOH溶液
(1.0mmol)。室温搅拌1小时，冷冻干燥除去溶剂，得到化合物Ia2，白色固体。¹HNMR
(400MHz,D₂O)δ8.41–8.37(m,1H),8.00–7.92(m,2H),7.41–7.36(m,1H),6.84(dd,J＝
18.0,4.3Hz,3H),3.84–3.78(m,9H),3.76–3.70(m,3H)。

实施例3化合物Ia3的制备

将Ia1(1.0mmol)置于5ml圆底烧瓶中，加纯净水2ml，并加入1MKOH溶液
(1.0mmol)。室温搅拌1小时，冷冻干燥除去溶剂，得到化合物Ia3，白色固体。¹HNMR
(400MHz,D₂O)δ8.39–8.35(m,1H),8.08–8.04(m,2H),7.41–7.37(m,1H),6.85(m,3H),
3.87–3.80(m,9H),3.74–3.68(m,3H)。

实施例4化合物Ia4的制备

将Ia1
(3.0mmol)置于25ml圆底烧瓶中，加纯净水6ml，并加入1MNaOH溶液(2.0mmol)。室
温搅拌1小时，冷冻干燥除去溶剂，得到化合物Ia4，白色固体。。¹HNMR(400MHz,D₂O)
δ8.47–8.43(m,1H),8.01–7.94(m,2H),7.42–7.35(m,1H),6.99(m,3H),3.87–3.81(m,9H),
3.74–3.69(m,3H)。

实施例5化合物Ia5的制备

将Ia1(1.0mmol)置于10ml圆底烧瓶中，加纯净水2ml，并加入1MNaOH溶液
(2.0mmol)。室温搅拌1小时，冷冻干燥除去溶剂，得到化合物Ia5，白色固体。。¹H
NMR(400MHz,D₂O)δ8.43–8.38(m,1H),8.11–8.05(m,2H),7.50–7.42(m,1H),6.91(dd,J
＝20.4,6.4Hz,3H),3.89–3.84(m,9H),3.80–3.73(m,3H)。

实施例6化合物溶解度测定

本实施例检测了化合物1以及本发明的化合物Ia1至Ia5在生理盐水中的溶解度。测试方法
为常规的溶解度测定法，结果见表1：

表1化合物溶解度数据

由表1结果可知，本发明的磷酸酯或其药学上可接受的盐在水中的溶解度显著高于化合物
1，特别是化合物Ia4和Ia5溶解度比化合物1提高了100倍以上。

实施例7对肿瘤细胞增殖的抑制活性研究

本实施例以化合物Ia1、Ia4为例，检测了化合物Ia1、Ia4的12种肿瘤细胞增殖的抑制活
性，化合物Ia2-3和Ia5均具有相似药效结果。

细胞培养：12种细胞均培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μ
g/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养。

抗增殖抑制活性测试方法：本专利中采用MTT方法测试所合成化合物对人癌细胞株
的增殖抑制活性。具体操作步骤如下：将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，以5×10⁴
个/孔的密度铺于96孔板中，继续培养24h后，吸弃旧的培养基加入不同浓度的含药培养
基，每个药物设置六个浓度，每个浓度设置三个复孔。加药培养48h后，向每孔加入5
mg/mL的MTT溶液，培养4h后吸弃培养基，向每孔加入150μL的DMSO后在水平摇床
上避光放置15min溶解结晶紫后用酶标仪读取570nM下的吸光度值。根据吸光度值用一下
公式算出细胞生长抑制率：抑制率％＝(1-(A_加药-A_空白)/(A_control-A_空白))*100％(注：A_加
药，A_空白，A_control分别代表加药孔，空白孔，对照孔的吸光度值。

结果：实验结果表明(表3)，本发明的化合物Ia1和Ia4对肿瘤细胞增殖均有很好的
抑制活性，GI₅₀值可达纳摩尔水平。

表3.化合物1、Ia1和Ia4对肿瘤细胞增殖的抑制活性

NT表示没有测试

实施例9体内抗肿瘤活性测试

本实施例以化合物Ia1、Ia4为例，检测了化合物1、Ia1、Ia4的体内抗肿瘤活性，化合物
Ia2-3和Ia5均具有相似药效结果。

A549肺癌裸鼠移植瘤模型的建立：将5只BALB/c裸鼠(购于中山大学实验动物中
心，雄性，4周龄，体重18－20g)饲养于SPF级实验动物中心内，如上述方法培养A549
细胞后，取5代以内处于对数生长期的细胞用胰酶消化后制备成5×10⁷个/mL密度的细胞
悬液，皮下注射到裸鼠腋下，约2周后，裸鼠腋下实体瘤达到1000mm³，将实体瘤剥下，用
眼科剪剪成大小均一的48个组织块，接种到另外48只BALB/c裸鼠(购于中山大学实验动
物中心，雄性，4周龄，体重18－20g)的背部右肢皮下。待实体瘤长至100mm³后，将小鼠
随机分为43组(Control组，化合物1组、Ia1组、Ia4组)，每组12只，剪耳编号后开始给
药。

给药：将化合物Ia4用生理盐水溶解，化合物1和Ia1组均用含5％DMSO、
HS15生理盐水溶液溶解、以30mg/kg的剂量分别腹腔注射于Ia4组、Ia4
组、化合物1组小鼠，Control组给予相同剂量的生理盐水溶液。每两天给药一次，记录小
鼠体重，并用游标卡尺测量小鼠实体瘤的长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积V＝1/2×a×
b²。连续给药三周后，处死小鼠，剥离肿瘤块并称重，计算抑瘤率。

结果：见附图1。图A为建立好A549裸鼠移植瘤模型，给药12次实验结束，处死
小鼠后所有小鼠的图片，图B为处死小鼠后，剥离肿瘤组织块的图片，从图B可以看出，
给予化合物1、化合物Ia1和Ia4组肿瘤块大小明显比control组小，并且组间差异性较小；
图C为对剥离的肿瘤块称重所得到的平均肿瘤重量，control组、化合物1组、化合物Ia1
组、化合物Ia4组的平均瘤重分别为1.027g、0.502g、0.482g，0.162g。化合物1组，化合物
Ia4组的抑瘤率为58.4％和86.6％。图D为在给药期间肿瘤体积增长图。按各组小鼠肿瘤重
量计算各化合物的肿瘤抑制率。Ia1的肿瘤抑制率为63.0％，活性与化合物1近似(肿瘤抑
制率为58.4％)。Ia4的肿瘤抑制率为84.2％，高于化合物1。

实施例10大鼠体内半衰期测定

本实施例以化合物Ia4为例，检测了化合物1及本发明的化合物Ia4的体内药代动力学。

6只雄性SD大鼠(购于中山大学实验动物中心，6至8周龄，体重200-220g克)饲养
于SPF级实验动物中心内，随机分为两组，分别经静脉注射化合物1(3mg/ml，溶于含
5％DMSO、HS15生理盐水)、Ia4(3mg/ml，溶于生理盐水)。经颈静脉插管
于给药后15min，30min，1h，2h，4h，6h，8h和24h各采血0.3ml。将血样收集于具
有肝素钠的样品管中，立即在4℃下以4000rPm离心血样5分钟，然后将血浆转移到另一个
样品管中，储存于-20摄氏度下。向150μL大鼠血浆样品中分别加入1500μL乙酸乙酯，
涡流混合1min，加入200μL内标溶液，涡流混合2min，离心30min(15,000g)分离上
清，并取10μL进行LC/MS/MS分析。

检测各时间点取得的血样中由Ia4转化形成的化合物1的浓度，由此对样品进行药代
动力学检验，采用的仪器和方法如下：

仪器：液相色谱质谱联用仪(Finnigan)(TSQQuantum)

色谱柱：YMC-TriartC18(2.0mm×150mm)；流动相：ACN：H₂O(0.5％乙酸铵)＝90:10；
流速0.25mL·min^-1，检测波长：254nm，进样量：2μL，柱温：30℃。

质谱条件：ScanType:MRM(MRM)；Polarity:Positive；ScanMode:N/A；Ion
Source:TurboSpray；Sprayvoltage:3800；Gaspressure:30；Temperature:350。

定量方法:内标法

结果：化合物Ia4的半衰期比化合物1明显延长(表4)。

表4化合物半衰期