埃兹蛋白在防治乙型脑炎病毒感染中的应用技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗乙型脑炎病毒感染的新靶点及
应用。
背景技术
乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)，属
于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，为有包膜的单正链RNA
病毒[Gubler,D.,G.Kuno,andL.Markoff.Flaviviruses,p.2007.1153-1252.InD.
M.KnipeandP.M.Howley(ed.),Fieldsvirology,5thed.,vol.1.
Lippincott-Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.]。JEV为流行性乙型脑炎的病
原体，主要以蚊虫为媒介进行传播，感染后能够引发脑炎或脑膜炎等严重的
急性神经系统症状，对人类健康威胁巨大。乙型脑炎主要流行于东亚、东南
亚以及大洋洲的部分地区，目前主要的控制手段为疫苗预防以及蚊虫的消除，
然而全球每年报告的乙型脑炎病例仍有35,000-50,000例，死亡人数超过
10,000例[Misra,U.K.andJ.Kalita.Overview:Japaneseencephalitis.Prog.
Neurobiol.2010.91:108-120.]，由于诊断和报告机制不完善，实际的感染和死
亡病例要超过这些数字，可见乙型脑炎仍然是危害公众健康的重大问题，因
而研究JEV致病机理和预防手段，寻找新的抗病毒策略，已成为亟待解决的
前沿课题。
JEV感染具有嗜神经性，易造成严重的中枢神经系统(CNS)疾病及其
并发症，这也是导致乙型脑炎患者发展为重症甚至死亡的主要原因[Denizot
M,NealJW,GasqueP.Encephalitisduetoemergingviruses:CNSinnate
immunityandpotentialtherapeutictargets.JInfect.2012.65(1):1-16.]。JEV经血
液循环感染CNS需要穿越血脑屏障，然而病毒如何穿过血脑屏障侵入CNS
的机制还不清楚。血脑屏障(BloodBrainBarrier，BBB)是位于循环系统和中
枢神经系统之间一道主要的屏障，它限制着不同物质在两个部位之间的自由
运输，对维持CNS的体内平衡以及保护CNS免受外界病原微生物的侵袭中起
着至关重要的作用[DyrnaF,HanskeS,KruegerM,BechmannI.Theblood-brain
barrier.JNeuroimmunePharmacol.2013；8(4):763-73.]。血脑屏障是由无窗孔的脑
微血管内皮细胞及其间的紧密连接、星形胶质细胞足突、细胞基膜和周细胞
共同组成的一个细胞复合体。在这个细胞复合体中，最主要的物质结构基础
是脑微血管内皮细胞(BrainMicrovascularEndothelialCells，BMECs)及其紧密
连接，其严整性的丢失被认为是病毒感染致脑组织损伤的一个重要原因。因
此，探明JEV感染BMECs的机制并以此寻找新的抗病毒靶点，对于保护血
脑屏障的功能，以及防治JEV所导致的中枢神经系统感染至关重要。
为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其囊泡运输系
统完成对宿主细胞的入侵，才能在细胞内进行复制并释放出有感染性的子代
病毒颗粒。因此，作为病毒感染宿主细胞的首要环节，细胞入侵已成为抗病
毒药物筛选的重要靶标。研究表明，JEV可利用不同的宿主因子和感染途径
来侵入靶细胞，如JEV需借助网格蛋白依赖的内吞途径(clathrin-mediated
endocytosis)感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)[NawaM,TakasakiT,YamadaK,
KuraneI,AkatsukaT.InterferenceinJapaneseencephalitisvirusinfectionofVero
cellsbyacationicamphiphilicdrug,chlorpromazine.JGenVirol.2003,84(Pt
7):1737-41.]，但感染神经细胞并不需要依赖网格蛋白[KaliaM,KhasaR,
SharmaM,NainM,VratiS.Japaneseencephalitisvirusinfectsneuronalcells
throughaclathrin-independentendocyticmechanism.JVirol,2013,
87(1):148-62.]。JEV可通过其包膜蛋白与热休克蛋白70相互作用来感染白纹
伊蚊细胞(C6/36细胞)[ChuangCK,YangTH,ChenTH,YangCF,ChenWJ.Heat
shockcognateprotein70isoformDisrequiredforclathrin-dependentendocytosis
ofJapaneseencephalitisvirusinC6/36cells.JGenVirol.2015,96(Pt4):793-803.]
以及人肝癌细胞(Huh7细胞)[ZhuYZ,CaoMM,WangWB,etal.Associationof
heat-shockprotein70withlipidraftsisrequiredforJapaneseencephalitisvirus
infectioninHuh7cells.JGenVirol.2012,93(Pt1):61-71.]。目前，关于JEV感染
BMECs的途径及机制仍不清楚。
病毒侵入靶细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子，这
些宿主细胞膜转运分子在细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞以及分泌
中发挥着重要的作用。如金属蛋白酶调节了细胞粘附，细胞膜分子的降解；
网格蛋白(clathrin)主要负责受体介导的的内吞过程；Flotillin分子能够与脂
筏内蛋白分子相互作用并内吞入细胞内；ADP核糖基化因子6分子参与调解
细胞质膜运输和胞内肌动蛋白装配；GTP酶激活蛋白分子GRAF1在网格蛋白
非依赖型的囊泡运输中具有重要的调节作用；白细胞介素2受体内吞调节了
信号通路并影响了细胞增殖；epsin蛋白调节了网格蛋白介导的内吞囊泡的运
输过程等[DohertyGJ,McMahonHT.Mechanismsofendocytosis.AnnuRev
Biochem.2009,78:857-902.]。在这些分子中，网格蛋白被证实参与了JEV感
染的过程，而其它分子在JEV感染中的作用还未有报道。
埃兹蛋白(Ezrin)为膜细胞骨架连接蛋白，是连接细胞膜和细胞骨架之
间的ERM(ezrin-radixin-moesin，埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白)家族成员之一。
常与根蛋白、膜突蛋白共同表达于细胞膜内侧。研究表明，Ezrin介导膜与细
胞骨架的连接，是细胞信号传导和生长过程中胞膜与细胞骨架的重要联系和
调节分子。因此，Ezrin在维持细胞极性、参与细胞运动、黏附、信号转导、
调节免疫细胞功能等方面均发挥着作用[NeischAL,FehonRG.Ezrin,Radixin
andMoesin:keyregulatorsofmembrane-cortexinteractionsandsignaling.
CurrOpinCellBiol.2011,23(4):377-82.]。近些年研究也发现Ezrin蛋白也参与
了多种病毒的感染与致病过程。如Ezrin蛋白作为正向调节因子参与了免疫缺
陷病毒(HIV-1)的感染过程[YoshinaoKubo,HiroakiYoshii,HarukaKamiyama,
etal.Ezrin,Radixin,andMoesin(ERM)proteinsfunctionaspleiotropic
regulatorsofhumanimmunodeficiencyvirustype1infection.Virology,2008,
375:130-140.]。Ezrin蛋白在丙型肝炎病毒(HCV)的感染过程中能够被HCV
包膜E2蛋白诱导磷酸化，磷酸化的Ezrin蛋白能够调节细胞骨架从而介导了
HCV的有效感染[TerenceN.Bukong,KarenKodys,andGyongyiSzabo.Human
Ezrin-Moesin-RadixinProteinsModulateHepatitisCVirusInfection.Hepatology,
2013,58:1569-1579]。可见Ezrin蛋白在参与病毒感染与致病过程中的重要作
用。
目前还没有任何关于埃兹蛋白分子在JEV感染中作用的报道，对于该分
子进行深入研究不仅能够提升对JEV感染与致病机制的认识，也可以为预防
与治疗JEV感染提供新的思路与靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗乙型脑炎病毒感染的新靶点。
本发明的另一目的在于提供埃兹蛋白(Ezrin)分子的新用途，特别是在
抗乙型脑炎病毒感染中的应用。
本发明的第三目的在于提供干扰Ezrin蛋白分子表达的siRNA。
本发明的主要技术方案是：
本发明，以人脑微血管内皮细胞(HBMEC)作为靶细胞，采用RNA干扰技
术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制JEV感染人脑微血管内皮
细胞(HBMEC)的宿主因子，从而保护血脑屏障的功能。本实验选择了一组参
与或调节宿主细胞跨膜转运的分子来进行筛选，这些分子在宿主细胞的跨膜
物质运输，囊泡的内吞与分泌以及对细胞骨架的调节过程中发挥着重要作用，
它们往往也是在病毒感染过程中易被病毒“劫持”并利用的分子。这些分子
包括：ADAM金属蛋白酶(ADAM10)、ADP核糖基化因子6(ARF6)、网格
蛋白轻链A(CLTA)、网格蛋白轻链B(CLTB)、网格蛋白重链(CLTC)、epsin
蛋白1(EPN1)、epsin蛋白2(EPN2)、埃兹蛋白(Ezrin)、Flotillin蛋白1(FLOT1)、
Flotillin蛋白2(FLOT2)、GTP酶激活蛋白(GRAF1)、白细胞介素2受体
(IL2RB)、突触结合蛋白1(SYT1)、突触结合蛋白2(SYT2)。通过检索
NCBIGeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件
对这些基因进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列，然后设
计siRNA，通过下调这些分子，来观察对JEV感染的影响。
我们发现埃兹蛋白(Ezrin)在JEV感染HBMEC中发挥着重要的作用，
下调Ezrin的表达，能明显抑制JEV的感染。
本发明的第一方面，提供了埃兹蛋白(Ezrin)作为一种抗乙型脑炎病毒
感染的新靶点。
本发明的第二方面，提供了埃兹蛋白(Ezrin)在制备预防或治疗乙型脑
炎病毒感染药物中的应用。
进一步地，本发明还提供埃兹蛋白(Ezrin)在制备预防或治疗乙型脑炎
药物中的应用。
本发明所述的埃兹蛋白(Ezrin)在制备预防或治疗乙型脑炎病毒感染药
物中的应用，该药物具体是指能够抑制或下调Ezrin的表达量的试剂。
所述的抑制下调Ezrin的表达量的试剂可以是siRNA、shRNA、包含siRNA、
shRNA的重组载体(如质粒)等。
本发明的第三方面，本发明提供了埃兹蛋白(Ezrin)的干扰RNA在制备
预防或治疗乙型脑炎病毒感染药物中的应用，或埃兹蛋白(Ezrin)在制备预
防或治疗乙型脑炎药物中的应用，所述的药物为干扰RNA(siRNA)，其序列
如下：
GUUGGAAUACCUGAAGAUUGC(SEQIDNO:22)、
GCGGCAACAGCUGGAAACAGA(SEQIDNO:23)、
CCUGAUUCUCGCGAUUAUUCU(SEQIDNO:24)。
其中，以如SEQIDNO:23所示的siRNA下调Ezrin的表达量效果最佳，
且降低乙型脑炎病毒对HBMEC细胞的感染最为明显。
本发明筛选到能够抑制乙型脑炎病毒感染HBMEC细胞的一个新的宿主
细胞分子Ezrin。Ezrin基因下调以后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑
制了乙型脑炎病毒对HBMEC细胞的感染。
因此本发明为临床预防和治疗因乙型脑炎病毒感染所导致的血脑屏障的
失能提供了新的靶点和治疗方案。
附图说明
图1为转染有效siRNA后的干扰效率及细胞毒性检测，图中主坐标轴表示干
扰效率，次坐标轴表示对细胞毒性的影响；
CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；
NT：转染non-targetingsiRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；
siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的HBMEC细胞组(实验组)。
图2为免疫荧光法检测各宿主分子下调后对JEV感染的影响，其中A为下调
各分子后对病毒感染性影响的免疫荧光检测图，荧光所示为JEV包膜蛋白阳
性的细胞，B为下调各分子后对病毒感染的抑制率图；
CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；
NT：转染non-targetingsiRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；
siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的HBMEC细胞组(实验组)。
图3为Ezrin下调后对JEV感染的影响，其中A为WesternBlot检测Ezrin蛋
白的表达图，B为荧光定量PCR法检测JEV病毒量图；
CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；
NT-CTRL：转染non-targetingsiRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；
Ezrin：转染针对Ezrin基因的siRNA(SEQIDNO:23)的HBMEC细胞组。
图4为转染Ezrin分子的不同干扰序列后的干扰效率及对JEV感染性的影响
图，A为Ezrin基因的mRNA水平检测图，B为JEV病毒量检测图；
CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)；
NT-CTRL：转染non-targetingsiRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)；
Ezrin-22：转染针对Ezrin基因的siRNA(SEQIDNO:22)的HBMEC细胞
组；
Ezrin-23：转染针对Ezrin基因的siRNA(SEQIDNO:23)的HBMEC细胞
组；
Ezrin-24：转染针对Ezrin基因的siRNA(SEQIDNO:24)的HBMEC细胞
组。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于
此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中
未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：
实验室指南》(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的
条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否
则百分比和份数按重量计算。
实施例1：
1设计、合成各宿主细胞分子的特异性siRNA序列。
1.1针对各个目的基因，检索NCBIGeneBank得到全序列和mRNA序列，
利用现有的网络资源及常用软件对各目的基因进行生物学分析，选择编码区
作为siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的
blast功能与人类基因组序列进行对比，确保无同源性；排除antisense链的5’端
连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何一段连续14个碱基与其
它基因配对的潜在siRNA。并利用设计软件进行预评估测定，选择3个最佳的
动力学参数靶点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，见表1。
1.2单链siRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。
表1.siRNA靶点的设计
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2siRNA序列筛选与干扰效果鉴定
2.1RNA转染
转染步骤参照Lipofectamine2000说明书
1)提前12-16小时将HBMEC细胞(购自Sciencell，保藏号：1000)铺在
24孔细胞培养板上培养，使得转染时细胞密度为80％-90％。
2)取2μLLipofectamine2000加入50μLopti-MEM中并轻柔混匀，室温孵
育5分钟；另取5μL浓度为5μM的干扰RNA和50μLopti-MEM混合。孵育
结束后，将稀释的Lipofectamine2000转染试剂加入稀释的RNA中，并轻柔
吹吸混匀。室温孵育20min后，加入HBMEC细胞中，补加400μLopti-MEM，
使得RNA终浓度为50nM。
3)转染后6-8小时更换含有双抗的新鲜培养基。
2.2实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各宿主分子的mRNA水平
1)TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，具体步骤如下：
转染48小时后，去培养上清，在细胞中加入1mlTRIzol，充分混合室温
裂解细胞3-5分钟。加入1/5体积的氯仿，手动剧烈混合15秒。于4℃、12,000
转离心15分钟。取上层水相并转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，充
分混合，室温沉淀10分钟。于4℃、12,000转离心10分钟。弃上清，加入
1ml预冷的75％乙醇。于4℃、12,000离心5分钟。充分弃上清，室温晾干
RNA沉淀，加入DEPC处理水溶解沉淀，得到总RNA。
2)利用takara反转录试剂盒获取对照组与干扰组细胞的cDNA，具体步
骤如下：
在PCR管中加入如下反应体系，
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轻柔混合混匀，置于37℃反应15分钟，然后置于85℃加热5秒钟灭活
逆转录酶。
3)荧光定量RT-PCR检测
利用takara的SYBRPremixExTaq试剂盒进行反应，反应体系如下，
SYBRPremixExTaq10μL
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利用RotorGene3000A仪器进行两步法扩增，95℃预变性2min，进行40
个PCR循环，95℃5秒，60℃30秒。
3细胞毒性实验
采用CCK-8方法检测转染siRNA后对细胞增殖的影响，具体步骤如下：
收集对数生长期细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。待细胞过夜
贴壁后，转染各siRNA，培养48小时后检测细胞增殖情况。弃去原有培养基，
每孔加入含10μLCCK-8的新鲜培养基110μL，培养3h后用多功能酶标仪在
450nm波长检测各孔吸光度值。实验独立重复3次，计算平均值。
4JEV病毒感染HBMEC细胞
4.1HBMEC细胞的JEV病毒感染实验
HBMEC细胞转染RNA后72小时，进行JEV病毒感染实验。将培养上
清吸出，用预温PBS润洗2次，以MOI＝1的病毒量接种JEV，37℃孵育2h
后弃去病毒液，并用预温PBS润洗3次，加入新鲜培养基继续培养。
4.2免疫荧光染色检测JEV抗原表达
HBMEC细胞感染病毒后继续培养48h，采用免疫荧光法检测病毒抗原的
表达，具体步骤如下：
1)细胞固定：将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每
孔加入100μl预冷甲醇，于-20℃条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细胞
3次。
2)透膜：固定后的细胞每孔加入100μl0.1％TritonX-100，室温孵育15
min，用预冷PBS洗涤3次。
3)封闭：每孔加入100μl3％BSA，于室温下孵育1h。
4)一抗孵育：每孔加入JEV特异性鼠源单抗(1:500稀释)100μl，室温
孵育1h，用预冷的PBS洗涤3次。
5)二抗孵育：每孔加入AF488荧光标记抗鼠IgG(1:1000稀释)100μl，
室温避光孵育1h，用预冷的PBS避光洗涤2次。
6)标记细胞核：每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:5000，PBS稀释)，
室温避光孵育15min，用预冷的PBS避光洗涤3次。
7)荧光显微镜下检测并计算绿色AF488阳性细胞克隆数。
4.3蛋白免疫印迹。
(1)用蛋白裂解液分别提取对照组与Ezrin干扰组HBMEC细胞的总蛋白。
(2)蛋白质定量后分别将30ug蛋白加到12.5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶中电
泳，并截取相应条带用电转仪转到PVDF膜上。
(3)蛋白的非特异性位点用5％的脱脂牛奶封闭，然后用Ezrin抗体封闭，
4℃过夜，用TBST缓冲液洗三遍，洗去一抗。
(4)然后用HRP标记的二抗室温孵育2小时，继而用TBST缓冲液洗三遍。
(5)最后，利用显色液显色并拍照分析.
4.4RT-PCR检测细胞中JEV病毒量
HBMEC细胞感染病毒后继续培养48h，采用TRIzol提取对照组与干扰
组细胞的总RNA，并逆转录获得cDNA，通过RT-PCR检测JEV病毒量。具
体步骤同2.2所示。
实验结果：
1设计、合成并筛选有效的siRNA
针对各个目的基因序列，我们设计了多个RNA干扰靶点序列，并利用设
计软件进行预评估测定，选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程，
每一基因共合成3条干扰序列，如表1所示。
采用体外转染的方法，将各个基因的干扰RNA转染到HBMEC细胞中去，
48h后通过RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，最终筛选到干扰效果最佳
的siRNA序列进行后续实验，其干扰效率如表2所示，其中加粗数据表示为干
扰效率最高，其对应序列为抑制相应基因表达的最佳siRNA序列。
表2RT-PCR法检测siRNA干扰序列对相关宿主基因的下调效率
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注：CTRL：不转染任何siRNA的HBMEC细胞组(空细胞组)
NT：转染non-targetingsiRNA的HBMEC细胞组(阴性对照组)
siRNA：转染针对各目的基因的siRNA的HBMEC细胞组(实验组)。
2siRNA干扰后的干扰效率以及细胞毒性检测
挑选出的针对各宿主分子的有效siRNA转染HBMEC细胞，转染后48h
通过RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，同时采用CCK8检测转染后对
HBMEC细胞毒性的影响。
结果如图1所示，转染有效siRNA组与CTRL组相比，转染各siRNA后
能够明显抑制相应基因的表达水平(P＜0.01)。转染EzrinsiRNA(SEQID
NO:23)的抑制效率可达到61％。
细胞毒性实验表明，各siRNA转染后并没有产生明显的细胞毒性(P＞
0.05)，对细胞正常的生理功能未产生影响，可用于后续实验。
3siRNA干扰后对JEV病毒感染的影响
转染各宿主分子的有效siRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后，感染
相同剂量的JEV病毒，感染48h后，采用免疫荧光法检测各宿主分子下调后
对JEV感染的影响，发现与对照组相比，转染EzrinsiRNA(SEQIDNO:23)
使Ezrin基因下调后，JEV包膜蛋白抗原阳性的细胞数明显减少，提示Ezrin
基因的下调能够降低JEV对HBMEC细胞的感染(图2A)。通过计算病毒量发
现，Ezrin基因下调后对病毒感染的抑制率最高，达到62.35％，而下调其余宿
主分子后，对JEV感染的抑制率较低(图2B)。
为明确Ezrin对JEV感染的抑制作用，在转染Ezrin分子siRNA后，通过
免疫印迹法检测Ezrin蛋白分子的表达，并在感染JEV后通过RT-PCR检测JEV
病毒量。结果显示，转染Ezrin分子siRNA(SEQIDNO:23)后，能够明显抑
制Ezrin蛋白分子的表达(图3A)。与对照组相比，Ezrin蛋白表达下调后，
HBMEC细胞中的病毒量也显著下降(图3B)，与免疫荧光法检测结果相一致。
这些结果表明，与对照细胞相比，下调Ezrin基因后JEV对HBMEC细胞的
感染能力明显下降，病毒量减少。
进一步，分别转染三条Ezrin分子的siRNA观察对病毒感染性的影响。
结果表明不同的siRNA对Ezrin分子的下调效率不同(图4A)，其中siRNA
(SEQIDNO:23)的干扰效率最高，与前面的结果相一致。检测干扰后对JEV
感染性的影响发现，随着对Ezrin分子的下调效率的增高，对JEV感染的抑制
率也在升高(图4B)，呈现一定的剂量梯度效应，提示Ezrin分子在JEV感染
HBMEC中发挥着重要作用。因此，Ezrin可作为抑制JEV对HBMEC细胞感
染的新的宿主靶点。
通过以上实验结果证明：本发明筛选到能够抑制JEV感染HBMEC细胞
的一个新的宿主细胞分子Ezrin。Ezrin基因下调以后，不影响细胞正常的生理
功能，但明显抑制了JEV对HBMEC细胞的感染。因此本发明为临床预防和
治疗因JEV感染所导致的血脑屏障的失能提供了新的靶点和治疗方案。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不
限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下
还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请
权利要求所限定的范围内。
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