技术领域
本发明涉及一种用于调节营养物质吸收之方法，特别涉及一种利用人 参皂苷调节营养物质吸收之方法。
背景技术
对人类消化系统之研究中，发现通过在胃肠道中分解和消化食物可取 得相当多种营养物质。胃肠道为消化和吸收食物之重要路径。就吸收而言， 可沿着整个肠道通过扩散或通过特殊运输过程来吸收营养物质，例如葡萄 糖、氨基酸、维生素和其它较小分子。而且多数此等营养物质可通过紧密 调节机制来运输，取代自由地移经肠道内膜进入血流或淋巴中。基于目前 对于细胞生物学和生理学之理解，营养物质可利用固着在细胞膜上之特定 运输蛋白和通道来运输。
在葡萄糖运输之实例中，几乎所有细胞都具有载体媒介机制 (carrier-mediated mechanism)，以从血液中运输葡萄糖。对多数细胞而言， 是通过使用易化葡萄糖转运子家族中之一或多个葡萄糖转运子蛋白 (GLUT)之易化扩散作用来进行运输。在上述这些案例中，因为葡萄糖 内向化学梯度之结果而发生净葡萄糖运输。少数细胞类型(例如小肠黏膜 和近侧肾小管之细胞)可在所谓主动运转机制中，利用葡萄糖梯度由细胞 外溶液摄取葡萄糖，因此允许在组织腔室之葡萄糖净吸收，其中组织腔室 内的葡萄糖浓度可能低于血液中葡萄糖浓度。有两种偶合能量流动和转运 子的方法，初级主动运输需要三磷腺苷酶(ATPase)提供能量，次级主动运 输则提供了离子流从较高浓度区流到较低浓度区的能量。
根据上述之次级主动运输模式，钠离子(Na+)会结合细胞间腔上之 运输蛋白而造成运输蛋白之构形改变，可开启葡萄糖之结合位。然后，葡 萄糖和运输蛋白结合。与钠离子(Na+)和葡萄糖两者结合之运输蛋白将 进一步发生构形改变，使葡萄糖和钠离子(Na+)能进入细胞。葡萄糖之 主动运输涉及钠离子(Na+)与葡萄糖流之直接物理偶合，而带有衍生来 自钠离子(Na+)内向梯度之过程能量。由于运输过程包括电荷之净移动 (具有非电解质葡萄糖之阳离子性钠(Na+)离子)，该摄取之驱动力包括 钠离子(Na+)之化学梯度及跨膜之电位差两者。当葡萄糖逐渐累积在细 胞中，其随后通过易化扩散，通过葡萄糖浓度梯度运出至血管。同样地， 其它营养物质可利用上述运输机制加以吸收。
三七(Panax notoginseng)作为传统中药，其主要用于滋补强化脾脏 功能并可增加精力和耐力。根据目前对传统中药的认知，人参皂苷萃取自 三七或人参，可帮助脑血管扩张、增进脑血流量、降低有机体之耗氧量、 增进有机体对缺氧之抗性、降低脑血管阻力、增进有机体之免疫功能、预 防出血所造成的中风及提供抗血栓、凝血及动脉硬化之功能。
然而，三七参尚未用于调节营养物质吸收和运输。而且目前尚未有论 文或研究专注于使用由中药(特别是三七或人参)纯化之人参皂素(saponin) 化合物来调节营养物质之吸收。
发明内容
本发明提供调节受试者体内营养物质吸收之方法，其包含投予有效量 由三七(Panax notoginseng)纯化之人参皂苷化合物，用于调节运输营养 物质穿越受试者之肠道细胞。
根据本发明之具体实例，提供一种用于提高受试者体内营养物质吸收 之方法，其包括投予由三七纯化之有效量的人参皂苷化合物之步骤，用于 促进运输营养物质穿越受试者之肠道细胞。
根据本发明，提供一种用于抑制受试者体内营养物质吸收之方法，其 包括投予由三七纯化之有效量的人参皂苷化合物之步骤，用于减缓运输营 养物质穿越受试者之肠道细胞。
根据本发明，人参皂苷化合物该人参皂苷化合物是式A之达马烷型 (Dammarane)化合物：
式A
其中R1可以是至少为氢、乙酰基、吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖 -(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃木糖基、吡喃葡萄糖 -(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃木糖基之其中一个所构成；R2可以 是至少为氢、乙酰基、吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖基-(6-1)-β-D-吡喃葡萄 糖基、吡喃葡萄糖基-(6-1)-β-D-吡喃木糖基、吡喃葡萄糖-(6-1)-α-L吡喃阿 拉伯糖基、吡喃葡萄糖-(6-1)-α-L畉喃阿拉伯糖基之其中一个所构成；R3 可以是至少为氢、氢氧基、O-乙酰基、O-β-D-吡喃葡萄糖基、O-β-D-吡喃 葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃木糖 基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)--L-吡喃鼠李糖之其中一个所构成；R4可 以是至少为氢、氢氧基、O-乙酰基。
根据本发明，人参皂苷化合物较佳为由下列组成之群中选出，包括：
式I之人参皂苷Rb1，
式I
式II之人参皂苷Rg1，
式II
式V之三七皂苷R1，
式V
式VII之化合物K，
式VII
式VIII之人参皂苷F1，
式VIII
式III之人参皂苷Rh1，
式III
或式IX之20(S)-原人参三醇(protopanaxatriol)。
式IX
根据本发明之具体实例，营养物质包括葡萄糖、氨基酸或维生素。特 定而言，该氨基酸包括精氨酸和色氨酸。该维生素包括叶酸或其它物质。
本发明之其它特色和优点将在下列说明中分别提出，且可从说明中分 别显见，或可通过本发明之实行而得知，而通过所述之要素和组合将能了 解并达成本发明之特色和优点。
应了解前述之发明内容和下列实施方式仅为示例和解释，并非为本发 明之限制。
附图说明
当结合所附的附图阅读时，将更能了解前述之发明内容以及下列实施 方式。就说明本发明之目的而言，在附图具体实例中所显示的，其为目前 较佳之说明。然而应了解，本发明并不限于所示之严格的排列和器具。
在图中：
图1为线形图，显示当Caco2单层细胞以经选择浓度之式I之纯化的 人参皂苷Rb1处理时，于Sink运输穿越基侧室所测量之葡萄糖吸收速率；
图2为线形图，显示当Caco2单层以经选择浓度之式II纯化的人参皂 苷Rg1处理时，于Sink运输穿越基侧室所测量之葡萄糖吸收速率；
图3为线形图，显示当Caco2单层以经选择浓度之式II纯化的人参皂 苷Rg1处理时，于Sink运输穿越基侧室所测量之精氨酸吸收速率；
图4为线形图，显示当Caco2单层以经选择浓度之纯化的人参皂苷- 式VII之K化合物处理时，于Sink运输穿越基侧室所测量之色氨酸吸收 速率；及
图5为线形图，显示以经选择浓度之纯化的人参皂苷-式VII之K化 合物处理Caco2单层之叶酸吸收速率。
具体实施方式
为了更佳了解本发明，本文中所使用之术语将另加以详细说明。依照 药典之定义，人参皂苷为任一不同的植物葡萄糖苷，当其与水混合或搅拌 时形成皂状泡沫，用于清洁剂、起泡剂及乳化剂。人参皂苷乃定义为萃取 自人参或三七之三萜皂素(triterpenoid saponin)化合物。
本文中所使用之术语“吸收”指营养物质经由一条穿越肠上皮进入血 液或淋巴液之通路摄取营养物质。
本文中使用之术语“纯化”指自粗制或天然形式分离重量纯度約為至 少90％，較佳逹100％，之纯化合物或物质之化学过程。“肠道细胞”一般 指包括肠细胞、黏膜细胞以及身体负责吸收营养物质之肠上皮细胞。
本发明提供调节受试者体内营养物质吸收之方法，包括投予由三七纯 化之有效量的人参皂苷化合物，以用于调节运输营养物质穿越受试者之肠 道细胞。该方法包括投予受试者有效量之人参皂苷化合物，用以调节运输 营养物质穿越胃肠道内衬之单层肠道细胞，使得受试者体内营养物质之吸 收得到调节。投予受试者之有效量的人参皂苷化合物指可在肠道细胞中维 持存活率并增加或抑制运输营养物质穿越肠道细胞之细胞膜之浓度，且较 佳为0.001至5μM。由于纯化自三七之人参皂苷化合物可提高或抑制运输 营养物质穿越单层肠道细胞，因此依照所投予之人参皂苷化合物，可经调 节该营养物质之吸收而维持受试者体内所需之营养物质吸收量。人参皂苷 化合物可调配成液劑、锭剂、药丸、胶囊和散剂，以口服投予患有营养物 质吸收问题之个体。同时，人参皂苷化合物可视情况和其它营养因子、添 加物、安定剂、载剂、结着剂和填充剂混合，以制造任何需要调节营养物 质吸收者之膳食补充品、饮料和食物。对于所属技术领域的技术人员来说， 人参皂苷化合物可和其它人参皂苷和黄耆皂苷组合或以鸡尾酒方式投予 乃显而易见，以对营养物质吸收提供协同或累进效用。此外，亦可由其它 中药植物或草本植物来纯化出纯化的人参皂苷化合物，以对营养物质吸收 功能提供相同之调节效用。
人参皂苷化合物可通过任何标准方法或此项技术领域中已知之方法 或知识来制备。根据本发明，纯化自三七之人参皂苷化合物包括人参皂苷。 上述这些物质可通过所属技术领域的技术人员已知之现有的萃取和分离 方法加以纯化。根據本發明，该人参皂苷化合物係式A之逹馬烷型化 合物：
式A
其中R1可以是至少为氢、乙酰基、吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖 -(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃木糖基、吡喃葡萄糖 -(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃木糖基之其中一个所构成；R2可以 是至少为氢、乙酰基、吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖基-(6-1)-β-D-吡喃葡萄 糖基、吡喃葡萄糖基-(6-1)-β-D-吡喃木糖基、吡喃葡萄糖-(6-1)-α-L吡喃阿 拉伯糖基、吡喃葡萄糖-(6-1)-α-L畉喃阿拉伯糖基之其中一个所构成；R3 可以是至少为氢、氢氧基、O-乙酰基、O-β-D-吡喃葡萄糖基、O-β-D-吡喃 葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃木糖 基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)--L-吡喃鼠李糖之其中一个所构成；R4可 以是至少为氢、氢氧基、O-乙酰基。
根据本发明之具体实例，取得人参皂苷化合物的方法包括磨碎三七之 根部；利用醇萃取磨碎物而产生醇萃取物；分离并纯化此三七根部之醇萃 取物，而得到五种已知之人参皂苷，其包括：
式I之人参皂苷Rb1(以下称为Rb1)，
式I
式II之人参皂苷Rg1(以下称为Rg1)，
式II
式III之人参皂苷Rh1(以下称为Rh1)，
式III
式IV之人参皂苷Re(以下称为Re)，
式IV
及式V之三七皂苷R1(Notoginsenoside R1以下称为R1)。
式V
根据本发明之具体实施例，三七之醇萃取物可利用吸附性树脂、硅胶 及逆相层析法加以分离和纯化。然后，人参皂苷Rb1及Rg1可进一步以柚 苷酶(naringinase)水解产生代谢物，其包括
式VI之人参皂苷F2(以下称为GF2)，
式VI
式VII之化合物K(以下称为CK)，
式VII
式VIII之人参皂苷F1(以下称为GF1)，
式VIII
及式IX之20(S)-原人参三醇(以下称为Rga)
式IX
由于纯化自三七之人参皂苷化合物可提高或抑制运输营养物质穿越 肠道细胞之细胞膜，因此依照所投予之人参皂苷化合物之群组，该营养物 质之吸收可经调节而维持个体内所需之营养物质吸收量。人参皂苷化合物 可调配成液剂、锭剂、药丸、胶囊和散剂，以口服投予患有营养物质吸收 问题或吸收不良症候群之个体，其改变肠子吸收足够之营养物质进入血液 的能力。例如，在制备液剂之实例中，可将人参皂苷化合物之一溶于任何 溶剂，较佳为溶入共溶剂以产生含任一人参皂苷化合物之液剂<例如，将 大约10毫克的任一人参皂苷化合物溶入1毫升的TranscutolP>。同时， 可视情况将人参皂苷化合物和其它营养因子、添加物、安定剂、载剂、结 着剂及填充剂混合，以制造膳食补充品、饮料、食物和动物饲料。
本发明提供一种提高受试者体内营养物质吸收之方法，其包含投予由 三七纯化之有效量的人参皂苷化合物之步骤，用于促进运输营养物质穿越 受试者之肠道细胞。该营养物质包括葡萄糖、氨基酸或维生素，其中该氨 基酸为精氨酸或色氨酸；该维生素包括叶酸及其它。
根据本发明之具体实例，提高葡萄糖之吸收是通过投予浓度为0.001 至5μM之人参皂苷化合物来促进运输葡萄糖穿越受试者肠道细胞；其中 该人参皂苷化合物包括式I之Rb1、式VII之CK、式VIII之GF1或式IX 之Rga。
根据本发明之具体实例，提高精氨酸之吸收是通过投予浓度为0.001 至5μM之人参皂苷化合物来促进运输精氨酸穿越受试者之肠道细胞；其 中该人参皂苷化合物包括式I之Rb1、式II之Rg1、式VII之CK、式III 之Rh1、式VIII之GF1或式IX之Rga。
根据本发明之具体实例，提高色氨酸之吸收是通过投予浓度为0.001 至5μM之人参皂苷化合物来促进运输色氨酸穿越受试者之肠道细胞；其 中该人参皂苷化合物包括式VII之CK或式IX之Rga。
根据本发明之具体实例，提高叶酸之吸收是通过投予浓度为0.001至 5μM之人参皂苷化合物来促进运输叶酸穿越受试者之肠道细胞；其中该人 参皂苷化合物包括式VII之CK或式I之Rb1。
另一方面，本发明提供一种抑制受试者体内营养物质吸收之方法，包 含投予有效量由三七纯化之人参皂苷化合物之步骤，以减缓运输营养物质 穿越受试者之肠道细胞。该营养素包括葡萄糖或维生素；其中该维生素包 括叶酸及其它。
根据本发明，抑制葡萄糖之吸收是通过投予浓度为0.001至5μM之人 参皂苷化合物来减缓运输葡萄糖穿越受试者之肠道细胞；其中该人参皂苷 化合物包括式II之Rg1或式III之Rh1。
根据本发明，抑制叶酸之吸收是通过投予浓度为0.001至5μM之人参 皂苷化合物来减缓运输叶酸穿越受试者之肠道细胞；其中该人参皂苷化合 物包括式II之Rg1或式III之Rh1。
根据本发明，抑制叶酸之吸收是通过投予浓度为0.001至5μM之人参 皂苷化合物来减缓运输叶酸穿越受试者之肠道细胞；其中人参皂苷化合物 包括式II之Rg1或式III之Rh1。
本发明更特定地通过下列实例加以解释。然而，应了解本发明不应以 任何方式受限于上述这些实例。
实例1：纯化的人参皂苷对葡萄糖吸收之调节效用
细胞培养
为了评估纯化的人参皂苷化合物对经过肠腔摄取营养物质之效用，将 Caco-2细胞放置在可渗透滤膜上生长以作为实验模型。Caco-2细胞取自人 类结肠癌并在两周后同时分化成类肠上皮细胞表现型。这些细胞形成具有 发展良好之紧密连接之单层，并经详细评估可作为活体外模型，以用于研 究营养物质和药物两者在小肠腔内细胞间之运输。
Caco-2细胞购自于美国菌株保存中心(American Type Culture Collection)。将上述这些细胞放置在Dulbecco氏修饰Eagle培养基 (DMEM)中，其含有4.5g/L葡萄糖和25mM之Hepes，及添加10％胎 牛血清、100U/mL青霉素G和10g/L链霉素。每两天更换一次培养基。 每个月定期检查上述这些细胞之霉浆菌。将衍生自人类大肠癌之Caco-2 细胞株用于供研究药物在胃肠道中吸收之活体外模型系统。在半透膜上培 养Caco-2细胞，以分化成高度官能化上皮细胞屏障，与小肠柱状上皮细 胞具有显著型态及生化相似性。因此Caco-2细胞单层可用于研究多种化 合物之膜运输性质。将培养盘以磷酸缓冲生理食盐水(PBS)清洗一次， 接着加入胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsine-EDTA)持续10分钟，以胰蛋白 酶消化细胞。使用35-μm滤网盖(Falcon 2235)分离并过滤经胰蛋白酶消 化之细胞以得到单细胞，之后再接种细胞以进行下一步实验。
细胞存活率分析
为了检测纯化的人参皂苷对于Caco-2细胞是否具有毒性，使用分别 添加有1％和10％FBS之培养基来进行细胞存活率分析。将细胞以各孔具 有5000个细胞之浓度接种在96孔盘中。为了消除细胞生长之边际效应， 细胞只接种在盘中间区之60孔，而在盘周围区域之36孔只填充入100μl PBS。一旦细胞附着在盘上，以含有不同剂量(0、1、10、20和50μM) 之纯化的人参皂苷的培养基培养细胞。三天后，利用含有相同化合物之新 鲜培养基替代培养基，并在进行细胞存活率分析前再培养2天。
利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8，日本熊本市Dojindo实验室)分析 来判断细胞存活率，该分析是根据具有细胞增生试剂WST-8之活细胞内 的NADH之氧化还原反应，通过脱氢酶在细胞内粒线体之电子还原链 (ETC)中还原WST-8，而得到黄色之甲臜(formazan)产物，其可溶于 组织培养基。细胞内之脱氢酶活性所产生之甲臜染剂量是和活细胞的数量 成正比。因此，由ELISA判读机在波长450nm所检测之吸光值愈高，显 示愈多数量之活细胞的存在。
在96格式盘之每个孔中加入10μl CCK-8试剂以进行CCK-8分析。 然后以铝箔纸覆盖测定盘并再培养两小时后，使用ELISA判读机于波长 450nm测量吸光值。
葡萄糖摄取分析
将Caco-2细胞(5×104)接种在48-孔盘中并保持在培养基(含有10％ FBS、1％非必需氨基酸、L-麸氨酰胺、青霉素G(100U/mL)和两性霉素 B(amphotericin B)(2.5μg/mL)之DMEM)中于37℃培养10天，使细胞 分化。每两天更换一次培养基。然后以PBS清洗细胞，之后补充含有5％ FBS之培养基及显示浓度(0.01、0.1和l μM)之纯化的人参皂苷并持续 48小时。以PBS对Caco-2细胞洗掉剩余之葡萄糖并在葡萄糖缓冲液(80 mM氯化钠(NaCl)、100mM甘露醇(mannitol)、20mM三(羟甲基)氨基 甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、pH 7.4、3mM磷酸氢二钾(K2HPO4)、1mM氯化 钙(CaCl2)、1mg/mL胎牛血清蛋白(BSA))中放置1小时。利用含有 2μCi/mL之14C-葡萄糖和未标定冷葡萄糖(unlabeled cold glucose)之0.2ml 葡萄糖缓冲液来取代葡萄糖缓冲液以开始葡萄糖的摄取，得到最终葡萄糖 浓度为25mM。移除葡萄糖缓冲液并在指定时间区间以PBS清洗来终止 葡萄糖摄取。在0.2mL之0.2N NaOH中溶解细胞并将20μL之细胞溶离 液转置至含有过滤底盘之UniFilter盘中(Perkim-Elmer，Wellesley，MA， USA)并于37℃真空烘箱中干燥。将UniFilter盘底密封并将25μL之计 数溶液加到每个孔中。使用具有黏性之盘黏着剂以代替封盖，且每个样本 之放射性是使用微盘液体闪烁计数器(TopCount，Packard NXT，Packard BioScience Company，Meriden，CT，USA)加以计算。计算出累积在细胞内 之葡萄糖含量並除以蛋白质浓度，所得摄取速率是以每分钟每毫克细胞蛋 白质之纳摩尔葡萄糖(nmol/min/mg)来表示。蛋白质浓度可利用标准二辛可 宁酸(Bicinchoninic acid；BCA)蛋白质分析来测定。加入2μCi之L-[14C]- 葡萄糖以测量非特定葡萄糖的摄取，并与每个测定值中相减，而得到特定 葡萄糖摄取量。
葡萄糖吸收分析
就葡萄糖的分析，将0.3ml(105细胞/ml)之Caco2细胞接种于各培养 室(transwell)之顶室(apical chamber)并于基侧室(basolateral chamber)加入 1ml的培养基(如上述)。以Costar培养室插片(No.3414，Corning Incorporated，NY，USA)将24-孔盘之各孔分离成顶室(定义为插片上方之小 室)及基侧室(定义为插片下方之小室)。每隔两天更换各培养室之顶室和基 侧室中之培养基。为了确定培养室中形成的Caco2单层胞膜之紧密结合完 整性，使用Millicell-ERS(Millipore EVOM-6；World Precision Instrument， Sarasota，FL，USA)进行穿膜电阻值(Trans-Epithelial Electrical Resistance)(TEER)分析以测量穿越培养室之顶室和基侧室间单层细胞膜之 TEER。当测量的TEER到达300至450Ωcm2于培养的14至21天在细胞 底侧具有分化的刷状缘存在时，则表示该Caco2单层已准备好可进行葡萄 糖吸收试验。取得各实验前、实验中及实验后之TEER值，以验证所收集 数据之一致性。
在葡萄糖吸收分析中，Caco2细胞单层是以含有5％FBS及不同浓度 (1、0.1及0.01μM)之纯化的人参皂苷之培养基预先处理2天，之后将 Caco2细胞单层进一步置于葡萄糖吸收缓冲液(80mM NaCl、100mM mannitol、20mM Tris-HCl、pH 7.4、3mM K2HPO4、1mM CaCl2、1mg/mL BSA)中培养1小时。利用新鲜的葡萄糖吸收缓冲液替代基侧室的培养基并 以含有2μCi/mL之D-[14C]-葡萄糖(60 Ci/mmol，American Radiolabeled Chemicals，ARC，St.Louis，MO，USA)和未标定的冷葡萄糖(unlabeled cold glucose)之0.2ml葡萄糖缓冲液来替代顶室的培养基以开始葡萄糖的吸 收，得到最终葡萄糖浓度为25mM。每隔5或10分钟区间由基侧室连续 取五个10-μL样本。抽取样本后将相同量之样本缓冲液加回基侧室，以维 持一定的缓冲液体积。将样本转置于含有过滤底盘之UniFilter盘中 (Perkim-Elmer，Wellesley，MA，USA)并于37℃真空烘箱中干燥。将 UniFilter盘底密封并将25μL之计数溶液加到各孔中。在封盖之位置使用 具有黏性之盘黏着剂，并使用微盘液体闪烁计数器(TopCount，Packard NXT，Packard BioScience Company，Meriden，CT，USA)加以计算每个样本 之放射性。试验化合物对葡萄糖吸收之效用是以在相对时间(以分钟计算) 累积在基侧室之葡萄糖的纳摩尔数(nmol/min)所表示。计算在各图之图形 数据从零时开始至终点之直线斜率以取得葡萄糖吸收速率。
在细胞存活率分析中，浓度为0.1至50μM之纯化的人参皂苷在含有 10％FBS的培养基中，对Caco2细胞不具有毒性。然而浓度为10至50μM 之Rg1在含有1％FBS的培养基中，则对Caco2细胞展现了细胞毒性。因 此，在后续实验投予不会对细胞存活率及形态有反向效用之浓度范围之纯 化的人参皂苷。较佳地，可投予浓度范围为0.01至0.5μM之纯化的人参 皂苷。
由表1所示之葡萄糖吸收分析结果，发现纯化的人参皂苷例如式I之 Rb1、式VII之CK、式II之Rg1、式III之Rh1、式VIII之GF1或式IX之 Rga对于运输葡萄糖穿越Caco2细胞单层具有调节效用。亦即，纯化的人 参皂苷增进或抑制了葡萄糖运输穿越Caco2细胞单层。葡萄糖之运输速率 经计算为曲线梯度，表示在相对时间(以分钟计算)于培养室之基侧室所测 量为μM之葡萄糖总量。请参照图1，当Caco2细胞以浓度为0.1至5μM 之式I的Rb1处理，则会增加葡萄糖的运输速率。
另一方面，如表1所示，两种纯化的人参皂苷式II之Rg1及式III之 Rh1均显示对葡萄糖吸收有抑制效用。请参照图2，当Caco2细胞单层以 浓度为0.01至1μM之式II的Rg1处理，则会明显的抑制葡萄糖运输。纯 化的人参皂苷对运输葡萄糖穿越Caco2细胞单层之调节效用列于下表1 中，其中箭头朝上代表对葡萄糖运输具提高效用，而箭头朝下代表对葡萄 糖运输具抑制效用。
表1：经纯化的人参皂苷对葡萄糖摄取之调节效用 化合物(μM) 运输速率(nmol/min) 百分比(％) * 控制组 2.1814±0.0584 100 -
Rb1 1 0.1 0.01 3.4250±0.4805 2.8107±0.1982 2.2306±0.1034 157.01 128.85 102.26 ↑ ↑ ↑ CK 1 0.1 0.01 2.9008±0.2184 2.8689±0.2783 3.3164±0.1911 132.98 131.52 152.03 ↑ ↑ ↑ Rg1 1 0.1 0.01 2.1089±0.2097 1.2763±0.1907 1.1317±0.1299 96.68 58.51 51.88 ↓ ↓ ↓ Rh1 1 0.1 0.01 1.3310±0.8356 1.6329±0.1976 1.3568±0.1090 61.02 74.86 62.20 ↓ ↓ ↓ GF1 1 0.1 0.01 3.2862±0.3429 3.3551±0.3248 3.0783±0.9550 150.65 153.80 141.12 ↑ ↑ ↑ Rga 1 0.1 0.01 2.2689±0.2598 3.6462±0.4105 2.5454±0.7808 104.01 167.15 116.69 ↑ ↑ ↑
因此，结论是可利用投予由三七纯化之人参皂苷，包括式I之Rb1、 式II之Rg1、式VII之CK、式III之Rh1、式VIII之GF1或式IX之Rga 来调节葡萄糖之吸收。
实例2：纯化的人参皂苷对精氨酸吸收之调节效用
精氨酸吸收分析
在测量精氨酸穿越Caco2细胞单层之运输中，将培养室(transwells) 之顶、基两侧以包含137mM NaCl、10mM Hepes、0.3mM磷酸二氢钠 (NaH2PO4)、0.3mM K2HPO4、5.4mM氯化钾(KCl)、2.8mM CaCl2、1mM 硫酸镁(MgSO4)、10mM葡萄糖，调整至pH值7.4之精氨酸培养缓冲液 清洗。然后，将细胞层放置在培养缓冲液，在37℃预先培养1小时。顶室 (apicall chamber)和基侧室(basolateral chamber)中培养缓冲液之体积 分别为0.2和0.9ml。在进行运输实验前，对两室中之细胞更换新鲜培养 基。以含有10mM L-精氨酸之溶液(其中包含0.125μCi/mL之L-[3H]-精氨 酸)更换顶侧之培养溶液以开始运输实验。在指定时间区间，从底侧移除 10μL-溶液样本并使用微盘液体闪烁计数器(TopCount，Packard NXT)计 算各样本之放射性。在抽取样本后将相同量之缓冲液加回基侧室，以维持 一定的缓冲液体积。并使用[3H]-甘露醇之摄取来校正穿越单层膜之分子的 非特定运输。结果是以精氨酸运输在相对时间(以分钟计算)穿越Caco-2细 胞单层之纳摩尔数(nmol/min)所表示。
由表2所示之精氨酸吸收分析结果发现纯化的人参皂苷，例如式I之 Rb1、式VII之CK、式II之Rg1、式III之Rh1、式VIII之GF1或式IX之 Rga，对运输精氨酸穿越Caco2细胞单层具有调节效用。纯化的人参皂苷 对Caco2细胞中精氨酸运输之调节效用列于下表2中，其中箭头朝上代表 对精氨酸运输具提高效用。
表2：经纯化的人参皂苷对精氨酸运输之调节效用 化合物(μM) 运输速率(nmol/min) 百分比(％) * 对照组 10.6855±0.2523 100 - CK 1 0.1 0.01 14.1530±0.9315 14.9247±1.4850 12.8943±0.3197 132.45 139.67 120.67 ↑ ↑ ↑ Rb1 1 0.1 16.1484±0.6228 11.8699±1.9300 151.12 111.08 ↑ ↑
0.01 9.6487±0.9377 90.30 Rh1 1 0.1 0.01 14.3209±0.7418 11.6615±0.8085 11.2792±0.7768 134.02 109.13 105.56 ↑ ↑ ↑ Rg1 1 0.1 0.01 18.3265±0.8965 22.5370±0.8912 13.5583±1.1940 171.51 210.91 126.89 ↑ ↑ ↑ GF1 1 0.1 0.01 10.3711±0.6574 12.6865±0.2964 13.5425±1.8630 97.06 118.73 126.74 ↑ ↑ Rga 1 0.1 0.01 10.1920±1.2390 10.7555±0.4532 12.6265±0.9875 95.38 100.66 118.16 ↑
结论是可利用投予由三七纯化之人参皂苷包括式I之Rb1、式II之 Rg1、式VII之CK、式III之Rh1、式VIII之GF1或式IX之Rga来调节 精氨酸之吸收。
实例3：纯化的人参皂苷对色氨酸吸收之调节效用
色氨酸吸收分析
除了使用含有137mM氯化胆碱、10mM Hepes、0.6mM磷酸二氢钾 (KH2PO4)、5.4mM KCl、2.8mM CaCl2、1mM MgSO4和10mM葡萄糖 之色氨酸培养缓冲液，并使其pH值调整至7.4以外，使用类似于实例2 中之实验程序来测量色氨酸分子穿过Caco-2膜之摄取。结果是以色氨酸 运输在相对时间(以分钟计算)穿越Caco-2细胞单层之纳摩尔数(nmol/min) 所表示。
由表3中所示之色氨酸吸收分析结果发现纯化的人参皂苷，例如式 VII之CK及式II之Rg1，对于运输精氨酸穿越Caco2细胞单层具有调节 效用。亦即，经纯化的人参皂苷可增进运输精氨酸穿越Caco2细胞单层。 关于图4，当Caco2细胞单层以浓度为0.01至0.1μM之式VII CK处理， 则色氨酸运输速率增加。如表3中所示，当Caco2细胞单层以浓度为0.001 至0.1μM之式III Rg1处理，则色氨酸运输速率增加。经纯化的人参皂苷 对运输色氨酸穿越Caco2细胞单层之调节效用列于下表3中。
表3：经纯化的人参皂苷对色氨酸运输之调节效用 化合物(μM) 运输速率(nmol/min) 百分比(％) * 对照组 12.430±0.8103 100 - CK 0.1 0.01 18.050±0.5557 13.050±0.5655 145.21 104.99 ↑ ↑ Rg1 0.1 0.01 0.001 17.710±0.5948 16.590±1.4190 16.180±2.8700 142.48 133.47 130.17 ↑ ↑ ↑
结论是可利用投予由三七纯化之人参皂苷，包括式II之Rg1或式VII 之CK来调节色氨酸之吸收。
实例4：纯化的人参皂苷对叶酸摄取之调节效用
叶酸摄取分析
将Caco2细胞以类似上列实例1葡萄糖摄取分析中所描述之方法进行 叶酸摄取试验。在叶酸摄取试验中，以含有5％FBS和浓度0.1μM之纯化 的人参皂苷之培养基，将Caco2细胞预处理2天，之后将细胞置于叶酸摄 取缓冲液(添加有0.14g/L CaCl2、0.1g/L MgCl2和0.1g/L MgSO4，pH6.0 之Hank氏平衡盐溶液)培养1小时。然后开始吸取缓冲液，并加入0.2ml 新鲜叶酸摄取缓冲液含有2μCi/mL放射性叶酸(3，5，7，9-3H-叶酸，25 mCi/mmol，ARC))及冷的未标定叶酸以开始摄取，得到最终浓度5μM之 叶酸。在指定时间区间移除摄取缓冲液以终止摄取。然后以冰冷的PBS 清洗细胞三次并加入0.2mL之0.2N NaOH使细胞溶解，接着于65℃培养 20分钟。将20μL细胞溶解液转移至含过滤底盘之UniFilter盘 (Perkim-Elmer)并如前面实例1中所述之计数来判断细胞内的3H-叶酸 摄取。计算出叶酸在细胞内之累积量并除以蛋白质浓度，所得摄取速率是 以每分钟每毫克细胞蛋白质中之皮可摩尔(picomoles)(pmol/min/mg)所 表示。蛋白质浓度是利用上述之标准二辛可宁酸(Bicinchoninic acid；BCA) 蛋白质分析来测定。
请参照图5及表4，发现以浓度0.1μM之式VII之CK或式I之Rb1处理之Caco2细胞比含有未处理Caco-2细胞之对照组展现出较高的叶酸 摄取。如表4所示，以浓度0.1μM的式II之Rg1或式III之Rh1处理之Caco2 细胞相反来说具有较低的叶酸摄取。纯化的人参皂苷对Caco-2细胞内叶 酸摄取之调节效用列于表4，其中箭头朝上代表对叶酸摄取具提高效用， 而箭头朝下代表对叶酸摄取具抑制效用。
表4：经纯化的人参皂苷对叶酸摄取之调节效用 化合物 运输速率(pmol/mg/min) 百分比(％) 对照组 0.1M CK 1.8600±2.2480 2.7630±3.206 100 148.55 - ↑ 对照组 0.1M Rb1 1.7210±0.1611 1.8710±0.0320 100 108.72 - ↑ 对照组 0.1M Rh1 1.7210±0.1611 0.8494±0.453 100 49.36 - ↓ 对照组 0.1M Rg1 1.7210±0.1611 1.0780±0.1534 100 62.64 - ↓
结论是可利用投予由三七纯化之人参皂苷，包括式I之Rb1、式II之 Rg1、式VII之CK或式III之Rh1来调节叶酸之摄取。
尽管上列实例描述了调节大肠癌细胞之营养物质吸收，但本发明应并 不受限于此。只要肠道细胞和胃肠系统之细胞具有相似之营养物质运输机 制，亦可预期这些细胞能从本发明提出之人参皂苷化合物之调节效用中得 到利益。而且本发明所述之人参皂苷除了在葡萄糖和叶酸吸收中扮演调节 角色外，其同样可应用于调节营养物质(包括维生素、氨基酸、荷尔蒙、 生长因子及其它细胞代谢之重要元素)之吸收。再者，可相互交换施行具 体实例中所描述之营养物质吸收试验和营养物质摄取试验，用于评定和评 估本发明所纯化的人参皂苷对个人营养物质吸收之调节效用。
所属技术领域的技术人员应了解，在不悖离其广泛的发明概念下，上 述具体实例可做改变。因此应了解，本发明并不受限于本文中所揭示之特 定具体实例，但希望将上述这些修正涵盖在如权利要求定义之本发明的精 神和范畴内。