京尼平苷的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102908356 B (45)授权公告日 2014.12.03 CN 102908356 B (21)申请号 201210351307.7 (22)申请日 2012.09.20 A61K 31/7048(2006.01) A61P 11/00(2006.01) (73)专利权人 中国科学院近代物理研究所 地址 730030 甘肃省兰州市城关区南昌路 509 号 (72)发明人 武振华 张红 王振华 王新宇 (74)专利代理机构 北京中恒高博知识产权代理 有限公司 11249 代理人 高松 (54) 发明名称 京尼平苷的应用 (57) 摘要 本发明公开了京尼平苷在制备。

2、治疗预防电离 辐射引起的放射性肺损伤药物中的应用。京尼平 苷作为制备治疗预防航空航天， 核辐射和胸部肿 瘤放射治疗时引起的放射性肺损伤， 增强机体免 疫力从而减轻辐射损伤的药物， 可为航空航天事 业， 核科技发展和胸部肿瘤放射治疗等电离辐射 引起的放射性肺损伤提供一种可供选择的辐射防 护思路。 (51)Int.Cl. 审查员 康鹏程 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书13页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102908356 B CN 102908356 B 1/1 页 2 1. 京尼平苷作为唯。

3、一活性成分在制备治疗预防电离辐射引起的放射性肺损伤药物中 的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述电离辐射为 X 射线照射。 3. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述电离辐射为重离子照射。 4. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述电离辐射为 射线照射。 5. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述治疗预防电离辐射引起的放射性肺 损伤药物的剂型为片剂、 丸剂、 颗粒剂、 胶囊、 悬浮液、 溶液、 糖浆、 注射剂、 霜剂、 软膏、 凝胶 剂、 喷雾剂、 口嚼剂或贴剂。 权 利 要 求 书 CN 102908356 B 2 1/1。

4、3 页 3 京尼平苷的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种中药成分的应用， 具体地， 涉及京尼平苷在制备治疗预防电离辐 射引起的放射性肺损伤药物中的应用。 背景技术 0002 随着国民经济及科学技术的迅速腾飞、 人民生活水平的急剧提高， 航空航天事业 的飞速发展， 核能和核技术等在医疗卫生、 科学研究、 工农业生产和国防中的大量应用， 辐 射与人们的工作和日常生活越来越密切， 受辐射的人员也越来越多， 损害也越来越严重， 潜 在的巨大危险不容忽视 丛悦， 饶亚岚， 陈肖华等。辐射诱导对小鼠巨噬细胞钙结合蛋白 S100A8 表达及调控影响的初步研究。解放军医学杂志， 2009 年第 34 期。

5、 。辐射对机体的损 伤其本质是对细胞的灭活作用， 当被灭活的细胞达到一定数量时， 躯体细胞的损伤会导致 人体器官组织发生疾病， 最终可能导致人体死亡。 躯体细胞一旦死亡， 损伤细胞也随之消失 了， 不会转移到下一代。在电离辐射或其他外界因素的影响下， 可导致遗传基因发生突变， 当生殖细胞中的 DNA 受到损伤时， 后代继承母体改变了的基因， 导致有缺陷的后代。 0003 胸部恶性肿瘤如肺癌、 食管癌、 乳腺癌等是我国最常见的恶性肿瘤， 发病率呈逐年 上升的趋势， 是我国居民最主要的死亡原因之一。 作为肿瘤治疗的基本手段之一， 放射治疗 应用历史已逾百年， 其目的在于对确定的肿瘤给予精确的电离辐。

6、射以达到杀伤肿瘤作用， 同时使周围的正常组织受到最小的损伤， 以最小的代价取得最佳的治疗效果， 提高患者的 生活质量和生存期 王淑莲， 刘跃平， 孙倩.放射肿瘤学治疗策略与实施， 天津:天津科技翻 译出版公司， 2001年第1期 。 近年来， 由于超高压治疗机的使用， 辅助工具的改进和经验的 积累， 治疗效果得到显著提高， 其局部控制率和生存率都显著提高， 目前已成为癌症治疗中 最重要的手段之一。据统计， 我国约有 70% 以上的癌症需用放射治疗， 美国统计也有 50% 以 上的癌症需用放射治疗。然而， 放射线在放疗杀伤肿瘤细胞的同时也会无选择性的损伤正 常组织细胞， 引起一系列全身和局部的副。

7、反应， 而且放化疗后， 肿瘤患者的免疫力低下， 肿 瘤细胞很容易卷土重来， 导致癌细胞转移和扩散。 因此， 我们需采取相应的措施来防治及减 少一些放疗后副作用对机体的损伤， 做好肿瘤放疗护理。 0004 人类的活动空间正不断扩大， 已经走向太空， 建立月球基地和飞往火星已被列入 21 世纪的航天计划， 而宇航员会受到地球带电粒子、 太阳宇宙射线等各种电离辐射的照射， 造成不同程度的损伤。即使是处于低地轨道上， 各种辐射对健康造成损伤的机会也要比地 球表面大 50 倍。而在更远的太空里， 充满了宇宙射线， 由于失去了天然的防护， 辐射对人 的影响会更严重。总体而言， 太空面临的辐射危险有两种。一。

8、种是长期、 低剂量的银河系宇 宙射线， 主要是质子和重离子对人体的损伤 ； 另一种是有可能遇到偶发的、 高剂量的太阳高 能粒子辐射。这两种辐射可能引起组织的物理损伤如引起皮肤、 肠、 骨髓、 肺及其他组织的 急性损伤， 引起白内障和杀死人体细胞， 降低人的免疫能力， 增加癌症的发病率和基因的破 坏。如果不加防护装置， 在太阳的辐射下， 航天员所受的辐射剂量可高达几百拉德。美国航 宇局已经认识到累积的辐射剂量 “将有可能成为人类太空探险中的最大限制因素。 ” 说 明 书 CN 102908356 B 3 2/13 页 4 0005 为了防止空间辐射对航天员健康的影响， 在以往的飞行中以物理防护为。

9、主， 普遍 采用的方法是增加舱壁的厚度。舱壁厚度增加， 可以降低舱内的辐射剂量。此外， 还有选择 合适的发射时间， 进行飞行辐射危险性分析， 及时检测辐射环境的辐射剂量等。 实验证明一 些药物具有减轻辐射损伤的作用。 在航天飞行中配备这些药物， 在辐射剂量超限时服用， 可 以阻止或减轻由于暴露于质子及重离子而产生的生物效应， 包括由这些类型电离辐射引起 的癌症、 免疫抑制和神经系统疾病等的诱导效应 雷筱芬， 陈木森黄酮类化合物抗辐射研 究进展。江西农业大学学报， 2007 年第 29 期 。由于受到飞船载荷的限制及宇航员出舱工 作时， 单靠屏蔽等物理防护很难实现， 所以应采用物理、 药物等综合。

10、措施， 来提高机体对辐 射的抵抗能力， 这是对抗辐射影响的一种积极有效的方法。 0006 核辐射， 或通常称之为放射性， 存在于所有的物质之中， 这是亿万年来存在的客观 事实， 是正常现象。核辐射是原子核从一种结构或一种能量状态转变为另一种结构或另一 种能量状态过程中所释放出来的微观粒子流。核辐射可以使物质引起电离或激发， 故称为 电离辐射。核辐射在我们生活的地球上无处不在。除来自宇宙的各种放射性射线外， 在 空气中 ( 氡 )、 地球表面 ( 岩石和土壤 )、 建筑物、 地板和墙壁、 食物和水， 以及我们身体的 各种组织器官内都存在放射性物质。自然界中存在的这些放射性物质的辐射， 包括宇宙 。

11、射线的辐射， 统称为天然辐射， 也称本底辐射 Uniter Nations Scientifi c Committee on the Effects of Atomic Radiation. Sources and Effects of Ionizi ng Radiation. UNSCEAR， 2000， Report to the General Assembly， United Nations， New York， 2001 。 自有地球以来， 天然辐射就一直存在， 人类正是在这种核辐射环境中生存、 进步和发展。 0007 放射性肺损伤是胸部恶性肿瘤放射治疗最主要的并发症， 是影响肿瘤治。

12、愈患者生 活质量的主要原因之一， 是胸部肿瘤放射治疗的主要剂量限制因素， 也是航空航天事业和 核工业发展的主要并发症之一。文献资料显示， 5%-20% 的肺癌患者放疗后出现放射性肺 损伤， 而在胸部淋巴瘤或食管癌的患者放疗后放射性肺损伤的催患率为 10%-30%。尽管国 内外学者对放射性肺损伤的研究已有一百余年的历史， 对其病变发生规律进行了多角度多 层次的研究， 然而对其发病机理尚未完全阐明， 到目前为止， 主要分为三种假说 : 小血管 及肺型细胞损伤学说 ； 自由基学说 ； 细胞因子学说。但是， 任何一种学说都不能解 释放射性肺损伤的整个病理生理过程 Yang KY， Liu Li， Zh。

13、ang Tao， et al. Inereased expressions of MMP-2 and MMP-9 in lung following 12Gy local irradiation. Chin J Radiol Med Prot， 2006 ； Yang K， Liu L， Zhang T， et al. TGF-betal transgenic mouse model of thoracic irradiation: Modulation of MMP-2 and MMP-9 in the lung tissue. J Huazhong Univ Sci Technolog M。

14、ed Sci. 2006 。 然而幸运的是， 放射性肺损伤的病理学 特征却有比较一致的结论 : 放射性肺损伤的发生过程中， 肺泡基底膜的损伤导致炎症因子 和细胞在肺泡腔内及肺间质聚集， 肺泡上皮细胞脱落、 表面活性物质的丢失及胶原的沉积 最终导致了肺泡塌陷及肺间质纤维化。显然， 在这一演变过程中， 以 IV 型胶原为主要成分 的肺泡基底膜损伤对于肺间质纤维化的形成是十分必要的， 是放射性肺泡炎和肺间质纤维 化病理变化的关键事件。而包括肺泡基底膜在内的细胞外基质 (extracellular matrix， ECM) 的代谢失衡在放射性肺损伤的发生过程中可能发挥了关键作用， 这是通过调节 ECM。

15、 合 成与分解代谢实现的。 0008 综上所述， 研究电离辐射引起的放射性肺损伤的发生发展机制， 并以此为基础 说 明 书 CN 102908356 B 4 3/13 页 5 寻找预防或治疗放射性肺损伤的途径， 是目前国内外肿瘤放射治疗学者热切期待解决的 问 题 RubinP， JohnstonCJ， WilliamsJP， et al. A Perpetual caseade of cytokines postirradiation leads to Pulmonary fi brosis.Int J Radiat oncol Biol Phys.1995 ； ShapiroDL， Fink。

16、elsteinJN， RubinP， et al. Radiation indueed secretion of surfactant from cell cultures of type Pneumocytes: an invitro model of radiation toxicity.Int J Radiat oncol Biol Phys. 1984。 面对这种现象， 各种化学药 物和生物制剂应运而生， 天然药物制剂也在预防和治疗辐射副反应中发挥了积极的作用， 研究发现许多天然药物及其代谢产物具有明显的辐射防护作用 潘自强。辐射防护的现状 与未来 . 北京 : 原子能出版社， 199。

17、7 年 赵斌， 张军帅， 刘培勋。辐射防护剂研究现状及 其进展， 核化学与放射化学。2012 年第 1 期 。 0009 京尼平苷 (geniposide)， 别名栀子苷， 羟异栀子苷， 栀子糖苷， 异栀子苷等， 白色 结晶， 分子式 C17H24O10， 分子量 388.37， 是一种从杜仲科植物杜仲 （Eucommia ulmoides Oliver） 叶中提取的环烯醚萜葡萄糖苷， 易溶于水， 是栀子的主要药效成分， 含量随产地的 不同在 3%-8% 左右， 广泛存在于植物组织细胞中， 如杜仲科杜仲属植物杜仲的皮、 叶和雄 花， 茜草科植物龙船花叶和小枝， 栀子的果实， 伞房花耳草等 杨轶。

18、舜， 张彤， 于筛成。 京尼平 的研究进展及其药理价值。中成药， 2011 年第 1 期 ， 目前， 京尼平苷的提取方法一般采用 氯仿、 无水乙醇等有机溶剂在索氏提取瓶中提取， 得到栀子中总的活性成分栀子总苷， 然后 再上硅胶柱分离， 用一定比例的甲醇、 氯仿混合液洗脱， 洗脱液在丙酮中进行重结晶得京尼 平苷晶体， 一般 100g 栀子果中可分离得到 4.0g 左右的京尼平苷 朱冬春， 黄赵刚， 夏泉等。 栀子中京尼平苷提取方法考察。时珍国医国药， 2009 年第 7 期 。京尼平苷结构如下 : 0010 0011 京尼平苷具有缓泻、 镇痛、 利胆、 抗炎、 治疗软组织损伤以及抑制胃液分泌和降。

19、低 胰淀粉酶等作用 倪慧艳， 朝晖， 傅海珍 . 栀子的研究与开发概述 . 中国中药杂志， 2006 年 第 31 期 ， 不同条件的发酵， 可以制成天然食用着色剂栀子蓝和栀子红， 也是用于治疗心脑 血管、 肝胆等疾病及糖尿病的原料药物。现代研究表明， 京尼平苷及其代谢产物对消化系 统、 心血管系统和中枢神经系统疾病均有显著疗效 张陆勇， 秀慧芳。栀子西红花总甙对神 经、 心血管及呼吸系统的影响。中国药科大学学报。2000 年第 31 期 ， 此外， 京尼平苷及其 代谢产物还有一定的抗炎和治疗软组织损伤的作用 谭玉林， 鲍同柱， 柳琴等。京尼平苷对 大鼠软骨细胞增殖的影响。中国组织工程研究与临。

20、床康复， 2011 年第 41 期 。京尼平苷除 了药用以外， 在其它领域也得到广泛的应用， 如可用作植物增产剂、 生物检测剂等。京尼平 说 明 书 CN 102908356 B 5 4/13 页 6 苷及其代谢产物具有很强的药理活性， 近十几年来， 国内外学者在京尼平苷的有效成份、 提取物分析、 药理及应用方面做了大量的研究， 取得了可喜的成绩， 但有关京尼平苷及其 代谢产物对胸部肿瘤放射治疗、 航空航天和核辐射等电离辐射引起的放射性肺损伤影响的 相关研究至今未见报道。 发明内容 0012 本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷， 提供了一种京尼平苷的新应用 ： 京 尼平苷在制备治疗预防电离。

21、辐射引起的放射性肺损伤药物中的应用。 0013 京尼平苷作为制备治疗预防航空航天， 核辐射和胸部肿瘤放射治疗时电离辐射引 起的放射性肺损伤， 增强机体免疫力从而减轻辐射损伤的药物， 可为航空航天事业， 核科技 发展和胸部肿瘤放射治疗引起的放射性肺损伤提供一种可供选择的辐射防护思路。 0014 为了解决上述技术问题， 本发明提供了如下的技术方案 ： 0015 京尼平苷在制备治疗预防电离辐射引起的放射性肺损伤药物中的应用。 0016 具体地， 所述电离辐射为 X 射线照射。 0017 具体地， 所述电离辐射为重离子照射。 0018 具体地， 所述电离辐射为 射线照射。 0019 具体地， 所述治疗。

22、预防电离辐射引起的放射性肺损伤药物的剂型为片剂、 丸剂、 颗 粒剂、 胶囊、 悬浮液、 溶液、 糖浆、 注射剂、 霜剂、 软膏、 凝胶剂、 喷雾剂、 口嚼剂或贴剂。 0020 本发明所述的京尼平苷是从中药杜仲叶中提取分离获得， 可采用任何已公开文献 或专利方法提取制备。 0021 本发明具有以下有益效果 ： 0022 本发明的有益效果是 ： 本发明所述的京尼平苷采用任何适合的方式应用于航空航 天， 核辐射和放射治疗联合应用于患者， 都可以减轻因电离辐射所致的放射性肺损伤症状， 如组织水肿、 炎症、 疼痛、 造血功能异常 （如白细胞降低） 、 腺体功能障碍、 致癌等等多种典型 不良反应症状 ； 。

23、并可明显缓解航空航天， 核辐射和肿瘤放射治疗时引起的放射性肺损伤， 增 强机体免疫力， 从而减轻辐射损伤的药物， 为航空航天事业， 核科技发展和胸部肿瘤放射治 疗提供一种可供选择的辐射防护思路。 附图说明 0023 附图用来提供对本发明的进一步理解， 并且构成说明书的一部分， 与本发明的实 施例一起用于解释本发明， 并不构成对本发明的限制。在附图中 ： 0024 图 1 是京尼平苷对 X 射线照射所致小鼠放射性肺损伤的组织病理学变化图 ； 0025 在图 1 中， A: 正常肺组织 B: 京尼平苷 100 mg/kg C: 单纯放疗组 D: 京尼平苷 100 mg/kg+ 放疗 ； 0026 。

24、图 2 是京尼平苷对 12C6+ 束照射所致小鼠放射性肺损伤的组织病理学变化图 ； 0027 在图 2 中， A: 正常肺组织 B: 京尼平苷 100 mg/kg C: 单纯放疗组 D: 京尼平苷 100 mg/kg+ 放疗 ； 0028 图 3 是京尼平苷对 X 射线照射所致小鼠正常肺组织损伤的病理学变化图 ； 0029 在图 3 中， A: 正常肺组织 B: 京尼平苷 100 mg/kg C: 单纯放疗组 D: 京尼平苷 说 明 书 CN 102908356 B 6 5/13 页 7 100 mg/kg+ 放疗。 具体实施方式 0030 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明， 应当理解。

25、， 此处所描述的优选实 施例仅用于说明和解释本发明， 并不用于限定本发明。 0031 实施例 1 ： 京尼平苷对 X 射线照射治疗恶性肿瘤时引起的放射性肺损伤、 机体免疫 力下降的缓解作用。 0032 1.1 实验材料 0033 京尼平苷， 购自上海源叶生物科技有限公司， 纯度 98% （HPLC 法测定） 。Lewis 肺 癌细胞株， 购自中国典型培养物保藏中心 ( 武汉大学保藏中心 )， 接种于 C57BL/6 小鼠右腋 部皮下传代保存。 0034 1.2 实验方法 0035 于超净工作台上， 取荷瘤传代鼠脱颈椎处死， 固定于板上。 用碘酊及酒精消毒动物 皮肤， 切开皮肤， 选择肿瘤生长良。

26、好、 无坏死或液化的瘤组织， 加入无菌生理盐水， 用组织匀 浆器制成含 3000 万 /ml 左右的细胞悬液， 于 120 只 C57BL/6 小鼠右后肢腹股沟部位皮下接 种上述瘤细胞悬液 0.2 ml/ 只， 接种部位皮肤先用碘酊及酒精消毒。接种后 10 天， 选择已 有肿瘤组织生长且瘤组织直径大于 1cm 的小鼠， 随机分为 9 组， 每组 12 只， 分别为荷瘤对照 组、 单纯放疗组、 顺铂组、 京尼平苷 1 mg/kg 组、 京尼平苷 10 mg/kg 组、 京尼平苷 100 mg/kg 组、 京尼平苷 1 mg/kg+ 放疗组、 京尼平苷 10 mg/kg+ 放疗组、 京尼平苷 10。

27、0 mg/kg+ 放疗组。 分组后放疗各组小鼠每日以深部 X 射线治疗机全身照射 (Philips 公司， 德国 )， 照射剂量 2 Gy， 照射后京尼平苷各组小鼠灌胃给予相应剂量京尼平苷， 其余各组灌胃给予等体积蒸馏 水。每天一次， 连续 5 天。 0036 末次照射后 24 小时， 脱颈椎处死小鼠， 断开气管获取全肺， 取部分左肺中部组织 放入4%中性甲醛固定， 石蜡包埋， 用于HE染色， 观察组织病理学变化， 部分右肺用于羟脯氨 酸， DNA 损伤以及细胞凋亡等生化检测。羟脯氨酸的测定采用南京建成生物技术公司的碱 水解试剂盒， 按照产品说明书进行操作。简而言之， 取 30-100 mg 。

28、肺组织， 加入 1 ml 水解液 在100裂解20min， 用活性炭吸附有色杂质后， 离心， 取上清1 ml， 依次加入试剂1、 2、 3， 充 分反应后取上清1ml在550 nm处， 1cm光径， 蒸馏水调零， 比色， 测各管吸光度。 羟脯氨酸含 量 (g/mg) ( 测定管吸光度空白管吸光度 )/( 标准管吸光度空白管吸光度 ) 标 准管含量 水解液总体积 / 组织质量 ； 剩余部分冰冻保存， 用于细胞因子 TNF-， TGF- 的 ELISA 检查， 测定采用南京建成生物技术公司的羟脯氨酸测定试剂盒， 按照产品说明书 进行操作。 0037 具体操作步骤如下 ： 分别设空白孔 ( 空白对照。

29、孔不加样品及酶标试剂， 其余各步 操作相同 )、 标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50l， 待测样品孔中 先加样品稀释液 40l， 然后再加待测样品 10l( 样品最终稀释度为 5 倍 )。加样将样品 加于酶标板孔底部， 尽量不触及孔壁， 轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置 37温育 30 分 钟。将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用， 小心揭掉封板膜， 弃去液体， 甩干， 每 孔加满洗涤液， 静置 30 秒后弃去， 如此重复 5 次， 拍干。每孔加入酶标试剂 50l， 空白孔 除外。37温育 30 分钟， 将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用， 小。

30、心揭掉封板 说 明 书 CN 102908356 B 7 6/13 页 8 膜， 弃去液体， 甩干， 每孔加满洗涤液， 静置 30 秒后弃去， 如此重复 5 次， 拍干， 每孔先加入 显色剂 A50l， 再加入显色剂 B50l， 轻轻震荡混匀， 37避光显色 15 分钟， 每孔加终止 液 50l， 终止反应 ( 此时蓝色立转黄色 )。以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的吸 光 (OD 值 ) 。 0038 小鼠肺组织细胞 DNA 损伤检测采用碱性单细胞电泳分析法 (Single cell micro gel electrophoresis (SCGE)， 或称 comet assay。

31、)。这是一种测定单个哺乳动物细 胞 DNA 损伤的快速、 简便和灵敏的方法 McKelvey-Martin VJ， Green MH， Schmezer P， Pool-Zobel BL， De Meo MP， Collins A. The single cell gel electrophoresis assay (comet assay): a European review. Mutat Res. 1993 ； 288(1):47-63.。 实验按Franke 等 Franke SI， Pra D， da Silva J， et al. Possible repair action of。

32、 Vitamin C on DNA damage induced by methyl methanesulfonate， cyclophosphamide， FeSO4 and CuSO4 in mouse blood cells in vivo. Mutat Res. 2005 ； 583(1):75-84. 方案进行。 具体内容如下 ： 在砂纸打磨过的或磨砂载玻片上涂一层 0.5% 的常熔点琼脂糖 (normal melting agarose， NMA)， 4 C 下使其凝固。小鼠肺组织细胞 10 l 与 100 l 低融点琼 脂糖 （LMA， 0.75% in PBS） 在37C混合均。

33、匀， 滴在载玻片上。 加上盖玻片后于4C放置一 段时间使其凝固。去掉盖玻片， 再加一层 LMA 并加盖玻片， 凝固后小心去掉盖玻片。将包埋 了细胞的载玻片小心置入细胞裂解液(内含1%月桂酰肌氨酸钠、 2.5mol/L NaCl、 100mmol/ L EDTA-Na2 和 10mmol/L Tris-HCl， pH10， 临用前加入 10%DMSO 和 1%Triton X-100) 中， 于 4 C 下放置约 1 小时。取出载玻片置于水平电泳槽中， 加入电泳缓冲液 ( 内含 1mmol/ L EDTA-Na2 和 300mmol/L NaOH)， 放置 20 分钟后， 调整缓冲液液面使电压达。

34、 25V， 电流达 300mA， 电泳 20min。电泳完毕， 小心将载玻片浸于中和液 (0.4mol/L Tris-HCl， pH7.5)， 放 置 5 分钟， 再换新的中和液， 同样放置 5 分钟， 以排除碱对 EB（溴化乙锭） 染色的干扰。取 出后用20g/mlEB 染色， 加盖玻片， 并尽快在荧光显微镜下进行观察和拍照。荧光显微镜下 激发光波长为 515-560nm， 滤光片波长为 590nm。未损伤肺细胞的 DNA 为圆形， 而受到损伤 的肺细胞 DNA 带有彗星样尾巴。每只小鼠照片中随机选用 100 个细胞， 利用 CASP 软件对 DNA 损伤情况进行分析。此软件分析结果中拖尾细。

35、胞的平均尾长和拖尾率作为 DNA 损伤评 价指标Konca K， Lankoff A， Banasik A， et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 2003。 0039 细胞平均尾长 = 每个细胞拖尾长度 / 测定细胞数 0040 细胞凋亡检测采用流式细胞分析法。具体方法是将新鲜肺组织用眼科剪尽量剪 碎， 200 目筛过滤。PBS 洗涤 2 次后用 75冷乙醇在 4 C 冰箱固定 24 h 以上。离心除去 固定液， 加碘化丙啶 (Propid。

36、iumiodide， PI) 染色液 0.5mL( 含 0.3 mg/mL RNAase， 20g mL PI)， 常温避光染色 30min 后， FASCan 型流式细胞仪 (USA) 检测， 激发光波长为 488nm， 每 个样品测定 10000 个细胞。采用分析软件 FlowJo71(CA) 计算出凋亡细胞的百分比。以 t 检验进行组间统计学分析。 0041 1.3 实验结果 0042 结果表明 （表1） ， X射线照射可致小鼠肺组织细胞DNA损伤， 细胞凋亡率明显升高， 京尼平苷本身对 DNA 损伤和细胞凋亡率没有明显影响， 但 1-100 mg/kg 的京尼平苷能够抑 制 X 射线照。

37、射所致肺组织细胞 DNA 损伤和细胞凋亡率的增加， 且有明显的剂量效应关系。 说 明 书 CN 102908356 B 8 7/13 页 9 此外， 研究结果也表明 （表 2） ， X 射线照射可致小鼠肺组织中羟脯氨酸含量急剧升高， 肺损 伤关键细胞因子 TNF- 和 TGF- 含量迅速提高， 京尼平苷本身对肺组织没有损伤和副作 用， 但1-100 mg/kg的京尼平苷能够抑制X射线照射所致肺组织中羟脯氨酸含量的提高， 并 抑制细胞因子TNF-和TGF-含量的升高， 且有明显的剂量效应关系 ； 组织病理学结果也 显示 （如图 1 所示） ， X 射线照射可小鼠肺组织产生一定程度的损伤， 肺泡壁。

38、有所增厚， 产生 大量炎性细胞 (C)， 京尼平苷本身对肺组织没有损伤和副作用 (B)， 但和正常对照组相比， 1-100 mg/kg 的京尼平苷能够明显减轻 X 射线照射所致肺组织的损伤程度 (D)。表明京尼 平苷对 X 射线照射所致的放射性肺组织电离损伤有明显的保护作用。 0043 0044 与荷瘤对照组比较 ： #P0.01。与单纯放疗组比较 ：*P0.05，*P0.01。 0045 说 明 书 CN 102908356 B 9 8/13 页 10 0046 与荷瘤对照组比较 ： #P0.01。与单纯放疗组比较 ：*P0.05，*P0.01。 0047 实施例 2 ： 京尼平苷对重离子束。

39、照射治疗恶性肿瘤时引起的放射性肺损伤， 机体 免疫力下降的缓解作用 0048 2.1 实验材料 ： 京尼平苷， 购自上海源叶生物科技有限公司， 纯度 99.8%（HPLC 法 测定） 。 U14宫颈癌细胞株， 购自中国医学科学院北京药物研究所， 接种于昆明种小鼠腹腔传 代保存。 0049 2.2 实验方法 ： 0050 取已接种 7 天的 U14 宫颈癌腹水的传代小鼠， 消毒腹部皮腹后用无菌注射器取乳 白色腹水， 加入 5 倍体积的注射用生理盐水稀释。小鼠 120 只， 消毒右后支腹股沟部位皮肤 后， 皮下接种上述瘤细胞悬液0.2ml。 接瘤后第10日， 选取肿瘤包块长径大于1 cm小鼠， 随。

40、 机分为 9 组， 每组 12 只， 分别为荷瘤对照组、 单纯放疗组、 顺铂组、 京尼平苷 1 mg/kg 组、 京 尼平苷 10 mg/kg 组、 京尼平苷 100 mg/kg 组、 京尼平苷 1 mg/kg+ 放疗组、 京尼平苷 10+ 放 疗组、 京尼平苷 100 mg/kg+ 放疗组。分组后放疗各组小鼠每日以中国科学院近代物理研究 所的兰州重离子加速器 (HIRFL) 产生 12C6+ 离子辐照肿瘤部位， 引出能量为 80MeV/u， 采用了 脊形过滤器来获得展宽Bragg峰。 每次辐照的间隔时间为48 h， 照射剂量4 Gy， 连续辐照3 次。每次照射后京尼平苷各组小鼠灌胃给予相应剂。

41、量京尼平苷， 其余各组灌胃给予等体积 蒸馏水。于末次照射后 24 小时， 脱颈椎处死小鼠， 断开气管获取全肺， 取部分左肺中部组织 放入4%中性甲醛固定， 石蜡包埋， 用于HE染色， 观察组织病理学变化， 部分右肺用于羟脯氨 酸等生化指标的测定， DNA 损伤检测以及细胞凋亡检测。 0051 小鼠肺组织细胞 DNA 损伤测定和细胞凋亡检测方法、 小鼠肺组织病理学观察， 羟 脯氨酸和细胞因子 TNF-， TGF- 测定参照实施例 1。以 t 检验进行组间统计学分析。 说 明 书 CN 102908356 B 10 9/13 页 11 0052 2.3 实验结果 0053 与常规低LET射线治疗肿。

42、瘤相比， 高LET重离子束照射治疗肿瘤是提出较晚， 但已 应用于临床的治疗措施。 重离子与常规射线不同， 它是重带电粒子， 因此具有一些独特的物 理性质， 其用于肿瘤的临床治疗较低 LET 射线具有明显优势。可以归结为 ： 物理剂量深 度分布比 X 射线、 光子、 中子好， 在射程末端有一个 Bragg 峰 ( 能量沉积集中区 )， 因 此， 可以利用重离子能量损失集中于射程末端的特性， 在肿瘤治疗时， 可以通过调节它们的 能量使离子停止在肿瘤的指定部位， 达到对肿瘤的最大杀伤效应， 而在肿瘤前面离子穿过 的正常组织， 受到的损伤较小， 至于肿瘤后面的正常组织， 因为离子已经停在肿瘤部位， 所。

43、 以是不受影响的 ； 在靶区相对生物效应高、 氧增比低， 比质子、 光子好 ； 射程岐离与横 向散射小， 比质子好 ； 利用正电子发射断层照相术 (PET) 技术可以实时监测， 这是高能重 离子独有的特点 ； 由于重离子的带电性决定了它们可以采用磁扫描技术导引束流对肿 瘤实行精确 “适形治疗” ； 亚致死损伤修复小 ； 辐射敏感性不依赖细胞周期时相。在生 物效应方面， 重离子治疗时其相对生物效应(RBE)高， 对肿瘤乏氧细胞的杀伤力比低LET射 线大。对细胞生长周期依赖较小。在物理方面， 重离子束在通过介质时， 速度会逐渐降低而 损失其能量并形成明显的电离吸收峰 (Bragg)， 峰的深浅及宽。

44、度均可通过特殊装置调节以 适应大小形状不同的病灶， 重离子在体内到达的位置也便于观察确定。 这些特征， 为重离子 在治疗肿瘤方面的应用提供了比传统射线更为优越的条件 罗光辉， 李文建， 苏兴桂. 重离 子与其他放射治疗肿瘤的比较 . 广东医学 . 2007 ； 28（1） ： 159-161 。 0054 尽管重离子照射较常规低 LET 射线照射治疗肿瘤有明显优势， 但当前较难做到精 确的适形照射， 另外对于机体深部肿瘤组织照射时离子束穿过机体正常组织以及照射过程 中形成的次级射线难免会对机体正常组织造成伤害。 实验结果表明 （表3） ， 12C6+ 束照射也可 致严重的肺组织细胞 DNA 损。

45、伤和细胞凋亡。1-100 mg/kg 京尼平苷可剂量依赖性地抑制放 疗所致的肺组织细胞 DNA 损伤和细胞凋亡。此外， 研究结果也表明 （表 4） ， 重离子束辐照可 致小鼠肺组织中羟脯氨酸含量急剧升高， 肺损伤关键细胞因子 TNF- 和 TGF- 含量迅速 提高， 京尼平苷本身对肺组织没有损伤和副作用， 但1-100 mg/kg的京尼平苷能够抑制 12C6+ 束照射所致的肺组织中羟脯氨酸含量的提高， 并抑制细胞因子 TNF- 和 TGF- 含量的升 高， 且有明显的剂量效应关系 ； 组织病理学结果也显示 （如图 2 所示） ， 碳离子束照射可导 致小鼠肺组织产生一定程度的损伤， 肺泡壁明显增。

46、厚， 并产生大量炎性细胞 (C)， 京尼平苷 本身对肺组织没有损伤和副作用 (B)， 但和正常对照组相比 (A)， 1-100 mg/kg 的京尼平苷 能够明显减轻重离子束照射所致肺组织的损伤程度 (D)。这些结果表明京尼平苷及其代谢 产物对重离子束辐照所致放射性肺损伤有明显的保护作用。 0055 说 明 书 CN 102908356 B 11 10/13 页 12 0056 与荷瘤对照组比较 ： #P0.01。与单纯放疗组比较 ：*P0.05，*P0.01。 0057 说 明 书 CN 102908356 B 12 11/13 页 13 0058 与荷瘤对照组比较 ： #P0.01。与单纯放。

47、疗组比较 ：*P0.05，*P0.01。 0059 实施例 3 ： 京尼平苷对 射线放疗时引起肺损伤的辐射防护作用 0060 3.1 实验材料京尼平苷， 购自上海源叶生物科技有限公司， 纯度 99.8% （HPLC 法测 定） 。 H22肝癌细胞株， 购自中国医学科学院北京药物研究所， 接种于昆明种小鼠腹腔传代保 存。 0061 3.2 实验方法 ： 0062 取已接种 7 天的 H22 肝癌腹水的传代小鼠， 消毒腹部皮腹后用无菌注射器取乳白 色腹水， 加入 5 倍体积的注射用生理盐水稀释。小鼠 120 只， 消毒右后支腹股沟部位皮肤 后， 皮下接种上述瘤细胞悬液 0.2ml。接瘤后第 10 。

48、日， 选取肿瘤包块长径大于 1cm 小鼠， 随 机分为 9 组， 每组 12 只， 分别为荷瘤对照组、 单纯放疗组、 紫杉醇组、 京尼平苷 1 mg/kg 组、 京尼平苷 10 mg/kg 组、 京尼平苷 100mg/kg 组、 京尼平苷 1 mg/kg+ 放疗组、 京尼平苷 10+ 放 疗组、 京尼平苷 100 mg/kg+ 放疗组。分组后放疗各组小鼠每日以 60Co 射线辐照小鼠右 后肢肿瘤部位， 每次照射剂量 2Gy， 每天一次连续照射 6 天。每次照射后京尼平苷各组小鼠 灌胃给予相应剂量京尼平苷， 其余各组灌胃给予等体积蒸馏水。于末次照射后 24 小时， 脱 颈椎处死小鼠， 断开气管获。

49、取全肺， 取部分左肺中部组织放入 4% 中性甲醛固定， 石蜡包埋， 用于 HE 染色， 观察组织病理学变化， 部分右肺用于羟脯氨酸等生化指标、 DNA 损伤以及细胞 凋亡的检测。 0063 小鼠肺组织细胞 DNA 损伤测定和细胞凋亡检测方法、 小鼠肺组织病理学观察， 羟 脯氨酸和细胞因子 TNF-， TGF- 测定参照实施例 1。以 t 检验进行组间统计学分析。 0064 3.3 实验结果 0065 射线照射也是肿瘤放疗的常用手段之一， 但已有研究表明， 辐射本身也可导致 肿瘤的发生 韩玲， 蔡建明， 李百龙， 等 . 60Co 射线照射诱发小鼠恶性肿瘤 . 第二军医大 说 明 书 CN 102908356 B 13 12/13 页 14 学学 .2003 ； 24(7):745-。