技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种治疗垂体腺瘤的药物组合物及其应用、药盒和包装件。
背景技术
据报道，垂体腺瘤的人群年发病率高达7.5~15/10万人，正常人群随机MRI检查时垂体腺瘤发现率为10%~38.5%(平均22.5%)。按照目前我国现有人口13亿来统计，垂体腺瘤年新增病例数多达近20万人。垂体泌乳素腺瘤(prolactinoma) 是最常见的功能性垂体腺瘤，约占所有垂体腺瘤的40%~60%。根据上述数据计算，年新增泌乳素腺瘤病例数大约为8~12万人。事实上，随着内分泌诊断技术、神经影像设备和显微手术技术的不断进展，泌乳素腺瘤的病例数远远高于上述数据。
研究显示了泌乳素腺瘤临床表现在女性为闭经-泌乳和不育，男性为阳萎/性功能减退等；肿瘤增大压迫邻近结构可导致视力下降和垂体功能低下等，严重危害患者的生存和影响生活质量。临床实践中，泌乳素腺瘤首选药物治疗，多巴胺受体激动剂（Dopaminatic Agonist, DA）为临床一线治疗选择，包括卡麦角林、溴隐亭等。卡麦角林具有半衰期长、副作用小、疗效好的特点，在欧美国家已作为泌乳素腺瘤的首选治疗选择，结果显示其使85%~90%的泌乳素腺瘤患者治疗有效（血清泌乳素水平下降至正常和/或肿瘤体积缩小50%以上）。对于溴隐亭治疗耐药的泌乳素腺瘤，治疗结果显示卡麦角林治疗有效。此外，卡麦角林还用于尝试治疗垂体无功能腺瘤、生长激素腺瘤和ACTH腺瘤，但是终了结果显示，卡麦角林治疗该些垂体肿瘤的效果远不如泌乳素腺瘤。因此，尽管卡麦角林在垂体腺瘤的药物治疗中具有重要的地位，但对于耐药泌乳素腺瘤和治疗无效的其他垂体腺瘤仍是临床实践中需要解决的难题；而且实践显示，即使是联合手术或立体定向放射治疗，激素水平的控制和正常垂体功能的保留仍然不理想。因此，进一步改善卡麦角林的治疗效果是目前临床干预方案中急需解决的难题。
目前临床使用的卡麦角林是合成的麦角衍生物，分子式为C26H37N5O2，对多巴胺2类受体有特异性的高亲和力（D2R，D3R，D4R的Ki值分别为0.7nM，1.5 nM，9.0 nM）。有研究表明：卡麦角林选择性地激动肿瘤细胞表面的多巴胺2型受体（D2R），激动Gαi2抑制腺苷酸环化酶活性导致细胞内cAMP水平下降，从而抑制基因转录和PRL合成，导致PRL分泌较少；同时使细胞内质网和高尔基体卷曲，肿瘤细胞皱缩坏死和体积减少；目前针对卡麦角林的作用机制研究多集中在通过D2R激活MAPK通路诱导凋亡方面，除此之外的作用机制，如自噬在卡麦角林治疗中的作用，仍然有待研究探讨。
自噬（autophagy）意为自体吞噬，是细胞内的物质成分利用溶酶体被降解过程的统称，包括长寿命蛋白和一些细胞器的降解再利用。哺乳动物细胞自噬可以分为三种主要方式：大自噬、小自噬、分子伴侣介导的自噬。目前，自噬在肿瘤发生发展和放化疗中的作用已成为近年来癌症研究领域的一个热点。研究显示，绝大多数肿瘤化疗药物能诱导自噬，如替莫唑胺、三氧化二砷、依托泊苷、伊马替尼等；这种自噬保护细胞能防止周围环境带来的损伤，诱导肿瘤细胞对放化疗的耐药。
氯喹（Chloroquine），分子式：C18H26ClN3，自1944年始用于临床治疗疟疾，逐步用于治疗肝阿米巴病、华支睾吸虫病、肺吸虫病、结缔组织病等，以及用于治疗光敏性疾患，如日晒红斑症。研究显示，氯喹与核蛋白有较强的结合力，通过喹啉环上带负电的7-氯基与DNA的鸟嘌呤上的2-氨基接近，使氯喹插入到DNA的双螺旋两股之间，与DNA形成复合物，从而阻止DNA的复制与RNA转录。有研究表明，氯喹进入溶酶体后发生质子化，从而提高溶酶体的PH值，抑制溶酶体的功能，因此被认为是自噬晚期的抑制剂；羟化氯喹是氯喹的衍生物，为4-氨基喹啉类，通常用于治疗盘状红斑狼疮及系统性红斑狼疮。羟化氯喹也是溶酶体的酸化抑制剂，可以阻断自噬体与溶酶体的整合，因此，亦认为是自噬晚期的抑制剂。
迄今为止，尚未见有关多巴胺受体激动剂（尤其是卡麦角林）诱导垂体腺瘤细胞发生自噬以及联合应用氯喹用以增强治疗效果的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗垂体腺瘤的药物组合物及其应用、药盒和包装件。具体涉及一种多巴胺受体激动剂的增效药物；尤其涉及含有作为联合制剂的氯喹及其衍生物与多巴胺受体激动剂治疗垂体腺瘤的药物组合物及其应用、药盒和包装件。
本发明的治疗垂体腺瘤的药物组合物，含有作为联合制剂供同时、分开或顺序使用的治疗有效量的氯喹和多巴胺受体激动剂，所述多巴胺受体激动剂优选为卡麦角林或溴隐亭；
上述的药物组合物中，氯喹可以以羟化形式或者盐的的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；
本发明中，所述的氯喹衍生物是以氯喹为母核的衍生物，包括但不限于其他4-氨基喹啉类抗疟药，如羟化氯喹(Hydroxychloroquine)、哌喹（Piperaquine）、氨酚喹（Amodiaquine Hydrochloride）、奎那克林（quinacrine）等；
所述的药物组合物中，多巴胺受体激动剂包括但不限于卡麦角林、溴隐亭、诺果宁等。
本发明中，优选的提供了所述的氯喹和卡麦角林的药物组合可用于制备治疗垂体腺瘤药物；
所述氯喹和卡麦角林的药物组合中，含有氯喹和卡麦角林；该药物组合中的氯喹可以以羟化形式或者盐的的形式存在，包括但不限于盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；
所述氯喹和卡麦角林的药物组合中，以氯喹为母核的衍生物，包括但不限于其他4-氨基喹啉类抗疟药，如羟化氯喹(Hydroxychloroquine)、哌喹（Piperaquine）、氨酚喹（Amodiaquine Hydrochloride）、奎那克林（quinacrine）等；
所述的药物组合物中，多巴胺受体激动剂包括但不限于卡麦角林、溴隐亭、诺果宁等。
本发明还提供了一种治疗垂体腺瘤的药盒，包括含有氯喹的第一药盒单元和含有卡麦角林的第二药盒单元；
其中，所述含有氯喹的第一药盒单元包括临床有效剂量的氯喹，所述含有卡麦角林的第二药盒包括临床有效剂量的卡麦角林。
本发明同时提供了一种包装抗垂体腺瘤药物用的包装件，包括包装空间彼此独立的含有氯喹的第一包装单元和含有卡麦角林的第二包装单元；
其中，所述含有氯喹的第一包装单元包括临床有效剂量的氯喹，所述含有卡麦角林的第二包装单元包括临床有效剂量的卡麦角林。
本发明中，所述的药盒或包装件中，还包括说明书，该说明书中规定，所述含有临床有效剂量氯喹的单元和所述含有临床有效剂量的卡麦角林的单元，作为联合应用于垂体腺瘤治疗的制剂。
本发明进行了下述的，如，卡麦角林诱导大鼠MMQ、GH3细胞和人源垂体腺瘤细胞发生自噬的体外试验；氯喹联合卡麦角林对细胞自噬和细胞凋亡的影响试验，并采用Western Blot法检测LC3、p62、caspase8、caspase3/7、PARP等表达；在小鼠动物体内证实两者联合应用对肿瘤生长的抑制效果，结果表明，所述氯喹和卡麦角林联合用于肿瘤生长的抑制，能显著增加对垂体腺瘤的治疗效果；
本发明的试验中，将氯喹与卡麦角林的组合物用于大鼠MMQ、GH3细胞和人源垂体腺瘤细胞，结果显示，比单独使用卡麦角林对细胞的抑制作用更明显；
本发明的试验结果还表明，所述氯喹与卡麦角林联用干预的方案，能显著增加LC3B和P62的表达，同时细胞凋亡明显增多；另外，在体水平证实了两者联合干预的方案对肿瘤生长抑制的增敏效果。
本发明提供了氯喹的制药新用途，即作为肿瘤化疗增敏剂，和卡麦角林联用增加其对垂体腺瘤的抑制作用，能提高临床疗效；所述药物组合物、药盒及包装件含有作为联合制剂供同时、分开或顺序使用的治疗有效量的氯喹和治疗有效量的卡麦角林；该药物组合物、药盒及包装件用于治疗垂体肿瘤时，能获得优于卡麦角林单独使用的药效。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1. 卡麦角林诱导大鼠MMQ和GH3细胞发生自噬，通过蛋白水平验证LC3-II的表达，共聚焦显微镜下观察GFP-LC3-II的形成，以及电镜下证实存在自噬体。
图2. 卡麦角林抑制mTOR信号通路，从mTOR上游的磷酸化AKT下降以及下游的p70s6k及4EBP1下降都证实了卡麦角林对mTOR通路的影响。
图3.氯喹联合卡麦角林的体外试验
在大鼠MMQ细胞株，氯喹联合卡麦角林增加细胞凋亡，采用WesternBlot验证凋亡水平PARP，自噬水平p62及LC3的变化，同时Annexin-V法与caspase3/7检测细胞凋亡水平增加。 在人原代垂体腺瘤细胞株中也同样使用Western Blot验证凋亡水平PARP，自噬水平p62及LC3的变化，以及细胞活性ATP检测法，均表明联合治疗显著增加细胞死亡。
图4.在小鼠动物体内证实两者联合应用对肿瘤生长的抑制效果。
具体实施方式
实施例1，卡麦角林诱导大鼠MMQ和GH3细胞发生自噬实验
实验材料：
大鼠垂体瘤细胞株MMQ（ATCC）于37 °C，5 % CO2条件下常规培养，培养基为含2.5 % 胎牛血清（Gibco）加12.5%的马血清的DMEM/F12（Gibco）；卡麦角林购自Tocris(英国)，母液100mM由DMSO配制；GFP-LC3质粒来自于Addgene。Chloroquine（CQ）购自sigma（美国），母液 100 mM 超纯水配；MTS及ATP检测细胞活性试剂购自Promega（美国）；RIPA裂解液、PMSF购自碧云天生物生物技术研究所（江苏）；Protease Inhibitor Cocktail购自Merck公司（德国）。
实验方法：
1）细胞培养及给药
细胞悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为1×106细胞/孔接种于6孔培养板中；
培养24后加入含药培养基，使卡麦角林的终浓度为50µM，空白对照组含DMSO 0.3%；
将给药后的细胞于37 °C，5 %CO2条件下培养24小时；
2）蛋白提取：
临用前将PMSF（100mM，1:100）及Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅲ （1:200）加入RIPA裂解液；
6孔板培养的细胞取1ml收集于1.5ml EP管，2000rpm离心5min，弃上清，加入150µl裂解液冰浴裂解20min；裂解后12000rpm离心5min；吸取上清进行定量，同时取部分上清，加入1/4体积的上样缓冲液（5×），90-95℃煮10min；变性后的蛋白保存于-80℃冰箱中；
3）Western Blot 检测LC3-II的表达
上样量：BCA蛋白定量药盒对各组提取的蛋白样品进行定量，校正后蛋白样品上样量为40µg；
电泳方法：80 V恒压电泳40分钟进行样品的浓缩；120 V电泳1小时进行样品的分离，根据marker判断电泳程度；
转膜：采用湿转，170mA，横流转膜2小时；
抗体杂交：首先用5%的BSA（封闭液）在37°C摇床上封闭1小时；用封闭液将一抗按说明书稀释，将转好的膜在杂交袋中4°C杂交过夜；TBST洗膜四次（37°C摇床，每次5mL，5min）；用封闭液将二抗稀释，在杂交袋中37°C摇床杂交1小时；TBST洗膜四次后进行化学发光检测；
化学发光检测：采用增强型化学发光法（ECL法）进行目的蛋白的检测；
实验结果：
图1（A）显示了选取的代表性的实验结果，结果显示，在MMQ细胞上卡麦角林增加了细胞LC3-II的表达；
4） GFP-LC3表达检测
转染GFP-LC3质粒：
细胞悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为5×105细胞/孔接种于12孔培养板中；
1、转染前一天细胞换新的培养基， 2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下: a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀； b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟； c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成； 3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀； 4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度；
5、待细胞在G418作用下，长满后冻存（保种），再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔），第二天在显微镜下，寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中；
筛选稳定的GFP-LC3后，加药处理24h，甩片后样本用4%的多聚甲醛固定，1XPBS冲洗3遍后与共聚焦下观察并拍照（如图1 B所示）；
5）. 电镜样品准备：
上述细胞培养给药后24h，将提取蛋白后剩余1ml细胞培养液收集于15ml离心管中，2000rpm离心10min，后加入2.5%戊二醛中，送复旦大学电镜中心检测；结果如图1（C）所示。
实施例2，卡麦角林抑制mTOR信号通路实验
实验材料：同实施例1。
Western Blot 检测Polyclonal anti-phospho-AKT, anti-AKT, anti-phospho-p70s6k, anti-p70s6k, anti-phospho-4EBP1, anti-4EBP1, anti-phospho-mTOR, 和anti-mTOR的表达；
实验方法同实施案例1中的蛋白检测方法，图2显示了选取的代表性的实验结果，结果显示，在MMQ细胞上卡麦角林对mTOR通路存在的抑制作用。
实施例3，氯喹联合卡麦角林的体外试验
1.MMQ细胞MTS实验检测CAB+CQ药效（如图3 A所示）
1）细胞悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为1×104细胞/孔接种于96孔培养板中，加入含药培养基分4组，分别为DMSO,CAB,CQ及CAB+CQ组，每组5个副孔，使卡麦角林的终浓度为50µM，CQ的终浓度为20uM，空白对照组含DMSO 0.3%；
2）将给药后的细胞于37 °C，5 %CO2条件下培养24小时；
3）每孔加入20µl MTS溶液，继续在培养箱中培养4小时；
4）以检测波长490nm测定吸光度的值，计算细胞的生长抑制率，N=5，实验平行三次；
2.MMQ细胞通过Annexin-V，caspase3，及Western Blot检测CAB+CQ药效（如图3 B-D所示）；
2，检测PARP,LC3，P62等关键蛋白
1）细胞悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为1×106细胞/孔接种于6孔培养板中，加入含药培养基分4组，分别为DMSO,CAB,CQ及CAB+CQ组，每组5个副孔，使卡麦角林的终浓度为50µM，CQ的终浓度为20uM，空白对照组含DMSO 0.3%；
2）将给药后的细胞于37 °C，5 %CO2条件下培养24小时；
3）收集1ml细胞悬液，冰PBS洗一遍，加入含Annexin-V-PE 和7AAD 10ul/ml避光孵育15min后流式细胞仪检测；
4）每组分别取10000细胞加入白色96孔板，加入Promega caspase3/7检测试剂，摇床孵育10min后，再避光孵育15分钟，酶标仪检测化学发光；
5）收集剩余1ml细胞的蛋白，检测PARP,LC3，P62等关键蛋白，方法同实施例1；
3.人原代垂体腺瘤细胞检测CAB+CQ药效
1）原代细胞培养
（1）.手术中取出人的垂体瘤标本放置于无血清培养液中送至实验室，
（2）.用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物，
（3）.用手术剪将组织剪成小块（1mm3），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中，
（4）.视组织块量加入5-6倍体积的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离，
（5）.加入3-5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂），
6.静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中，
（7）.1000rpm，离心10分钟，弃上清液，
（8）.加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液，
（9）.加入培养液1-2ml（视细胞量），血球计数板计数，
（10）.将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养；
2）药物敏感试验（ATP法）
（1）细胞悬浮于常规培养基中，并调节细胞密度为1×104细胞/孔接种于96孔培养板中，加入含药培养基分4组，分别为DMSO,CAB,CQ及CAB+CQ组，每组5个副孔，使卡麦角林的终浓度为50µM，CQ的终浓度为20uM，空白对照组含DMSO 0.3%；
（2）将给药后的细胞于37 °C，5 %CO2条件下培养24小时；
（3） 每孔加入CellTiter-GLO溶液，摇床上孵育2分钟，室温避光孵育15分钟；
（4） 酶标仪检测化学发光；
（5）结果如图3（E）及经5个病人的在72h的统计图（图（F））所示；
3）蛋白检测
方法同实施例1，原代细胞分为DMSO,CAB,CQ及CAB+CQ组，药物作用24h后收集蛋白，检测LC3，P62及PARP的表达水平，结果如图3（G）以及经5个病人的在24的p62/GAPDH的灰度统计图（H）所示
本发明实验结果表明在MMQ细胞及人原代垂体瘤细胞株上氯喹（CQ）增加卡麦角林的细胞毒作用。
实施例4，小鼠动物体内实验证实联合应用对肿瘤生长的抑制效果
实验材料：裸鼠购置于SLAC（上海），其余同上述实施例；
选取 5-7 周的小鼠；. 收集对数生长的肿瘤细胞，用无血清基质10ml，于1500 转/ 分，离心3min，连续洗 3 次， 最后用无血清基质混匀，用血球计数器计算肿瘤细胞数量( 平均 5 个中方格的细胞计数×104即是肿瘤数/ 毫升) ；计算肿瘤细胞总数后，再将肿瘤细胞密度调至107 个/ml， 每只小鼠腋下接种 100ul(即 1×106个肿瘤细胞)， 2周左右可扪及肿瘤小节结；.待肿瘤体积长至约100mm3时，分组DMSO，CAB，CQ及CAB+CQ组，给予CAB（0.25mg/kg），CQ（100mg/kg）口服，每两天给药一次，且用游标卡尺量肿瘤纵横大小( 单位：mm)；.给药21天后，常规处理裸鼠，取瘤体称重，拍照，并将肿瘤切块保存冻存管及4%的福尔马林中；按下述步骤提取肿瘤组织总蛋白;
1.）研磨：剪碎组织，加入200ul裂解液，研磨至组织无肉眼可见碎片；
2） 吸取至EP管中：吸取组织悬液至EP管中，用200ul裂解液冲洗研磨器，把组织混悬液尽量都冲下来，吸入EP管中，重复一次，共600ul组织混悬液，冰上裂解1h；
3）4℃，20,000g（或最大）离心30分钟，取上清（沉淀为细胞大碎片和核碎片, 上清即为总蛋白）;
4）如上述方法采用BCA法测组织蛋白浓度；
Western Blot法检测组织蛋白中的PARP，p62，LC3及beta-tubulin；实验结果表明， CQ与CAB联合干预能促进细胞的死亡，抑制肿瘤细胞生长。