一种治疗垂体腺瘤的药物组合物及其应用、药盒和包装件.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410619087.0 (22)申请日 2014.11.06 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104922672 A (43)申请公布日 2015.09.23 (73)专利权人 上海交通大学医学院附属瑞金医 院 地址 200025 上海市黄浦区瑞金二路197号 (72)发明人 吴哲褒 林绍坚 冷志根 赵卫国 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所(普通合伙) 31268 代理人 吴桂琴 (51)Int.Cl. A61K 45/00(2006.0

2、1) A61K 31/4706(2006.01) A61K 31/4709(2006.01) A61K 31/48(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 5/00(2006.01) 审查员 张伟 (54)发明名称 一种治疗垂体腺瘤的药物组合物及其应用、 药盒和包装件 (57)摘要 本发明属于生物医药技术领域， 涉及一种治 疗垂体腺瘤的药物组合物及应用、 药盒和包装 件。 所述药物组合物、 药盒及包装件含有作为联 合制剂供同时、 分开或顺序使用的氯喹/羟化氯 喹和治疗有效量的多巴胺受体激动剂， 所述多巴 胺受体激动剂为卡麦角林或溴隐亭。 本发明的药 物组合物、 药盒

3、及包装件用于治疗肿瘤时， 能获 得优于卡麦角林单独使用的药效， 提高临床治疗 的效果。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 104922672 B 2018.02.23 CN 104922672 B 1.一种治疗垂体腺瘤的药物组合物， 其特征在于， 含有作为联合制剂供同时、 分开或顺 序使用的氯喹或其衍生物和治疗有效量的卡麦角林。 2.根据权利要求1所述的治疗垂体腺瘤的药物组合物， 其特征在于， 所述氯喹以羟化形 式或者盐的形式存在， 选自盐酸盐、 硫酸盐、 磷酸盐。 3.根据权利要求1所述的治疗垂体腺瘤药物组合物， 其特征在于， 所述的氯喹衍生物选 自4-氨基喹啉类抗疟药羟化氯喹、

4、哌喹、 氨酚喹或奎那克林。 4.氯喹和卡麦角林的药物组合在制备抗垂体腺瘤药物中的用途。 5.根据权利要求4所述的用途， 其特征在于， 所述氯喹以羟化形式或者盐的形式存在， 选自盐酸盐、 硫酸盐、 磷酸盐。 6.一种抗垂体腺瘤用药盒， 其特征在于， 包括含有氯喹的第一药盒单元和含有卡麦角 林的第二药盒单元。 7.根据权利要求6所述的药盒， 其特征在于， 所述含有氯喹的第一药盒单元包括临床有 效剂量的氯喹， 所述含有卡麦角林的第二药盒包括临床有效剂量的卡麦角林。 8.一种包装治疗垂体腺瘤药物用的包装件， 包括包装空间彼此独立的含有氯喹的第一 包装单元和含有卡麦角林的第二包装单元。 9.根据权利要求

5、8所述的包装件， 其特征在于， 所述含有氯喹的第一包装单元包括临床 有效剂量的氯喹， 所述含有卡麦角林的第二包装单元包括临床有效剂量的卡麦角林。 10.根据权利要求6-7中任一项所述的药盒或权利要求8-9中任一项所述的包装件， 其 特征在于， 还包括说明书， 该说明书中规定， 所述含有临床有效剂量氯喹的单元和所述含有 临床有效剂量的卡麦角林的单元， 作为联合应用于垂体腺瘤治疗的制剂。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104922672 B 2 一种治疗垂体腺瘤的药物组合物及其应用、 药盒和包装件 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一种治疗垂体腺瘤的药物组合物及

6、其应 用、 药盒和包装件。 背景技术 0002 据报道， 垂体腺瘤的人群年发病率高达7.515/10万人， 正常人群随机MRI检查时 垂体腺瘤发现率为10%38.5%(平均22.5%)。 按照目前我国现有人口13亿来统计， 垂体腺瘤 年新增病例数多达近20万人。 垂体泌乳素腺瘤(prolactinoma) 是最常见的功能性垂体腺 瘤， 约占所有垂体腺瘤的40%60%。 根据上述数据计算， 年新增泌乳素腺瘤病例数大约为8 12万人。 事实上， 随着内分泌诊断技术、 神经影像设备和显微手术技术的不断进展， 泌乳素 腺瘤的病例数远远高于上述数据。 0003 研究显示了泌乳素腺瘤临床表现在女性为闭经-

7、泌乳和不育， 男性为阳萎/性功能 减退等； 肿瘤增大压迫邻近结构可导致视力下降和垂体功能低下等， 严重危害患者的生存 和影响生活质量。 临床实践中， 泌乳素腺瘤首选药物治疗， 多巴胺受体激动剂 （Dopaminatic Agonist, DA） 为临床一线治疗选择， 包括卡麦角林、 溴隐亭等。 卡麦角林具有半衰期长、 副 作用小、 疗效好的特点， 在欧美国家已作为泌乳素腺瘤的首选治疗选择， 结果显示其使85% 90%的泌乳素腺瘤患者治疗有效 （血清泌乳素水平下降至正常和/或肿瘤体积缩小50%以 上） 。 对于溴隐亭治疗耐药的泌乳素腺瘤， 治疗结果显示卡麦角林治疗有效。 此外， 卡麦角林 还用于

8、尝试治疗垂体无功能腺瘤、 生长激素腺瘤和ACTH腺瘤， 但是终了结果显示， 卡麦角林 治疗该些垂体肿瘤的效果远不如泌乳素腺瘤。 因此， 尽管卡麦角林在垂体腺瘤的药物治疗 中具有重要的地位， 但对于耐药泌乳素腺瘤和治疗无效的其他垂体腺瘤仍是临床实践中需 要解决的难题； 而且实践显示， 即使是联合手术或立体定向放射治疗， 激素水平的控制和正 常垂体功能的保留仍然不理想。 因此， 进一步改善卡麦角林的治疗效果是目前临床干预方 案中急需解决的难题。 0004 目前临床使用的卡麦角林是合成的麦角衍生物， 分子式为C26H37N5O2， 对多巴胺2类 受体有特异性的高亲和力 （D2R， D3R， D4R的

9、Ki值分别为0.7nM， 1.5 nM， 9.0 nM） 。 有研究表 明： 卡麦角林选择性地激动肿瘤细胞表面的多巴胺2型受体 （D2R） ， 激动G i2抑制腺苷酸环化 酶活性导致细胞内cAMP水平下降， 从而抑制基因转录和PRL合成， 导致PRL分泌较少； 同时使 细胞内质网和高尔基体卷曲， 肿瘤细胞皱缩坏死和体积减少； 目前针对卡麦角林的作用机 制研究多集中在通过D2R激活MAPK通路诱导凋亡方面， 除此之外的作用机制， 如自噬在卡麦 角林治疗中的作用， 仍然有待研究探讨。 0005 自噬 （autophagy） 意为自体吞噬， 是细胞内的物质成分利用溶酶体被降解过程的 统称， 包括长寿

10、命蛋白和一些细胞器的降解再利用。 哺乳动物细胞自噬可以分为三种主要 方式： 大自噬、 小自噬、 分子伴侣介导的自噬。 目前， 自噬在肿瘤发生发展和放化疗中的作用 已成为近年来癌症研究领域的一个热点。 研究显示， 绝大多数肿瘤化疗药物能诱导自噬， 如 替莫唑胺、 三氧化二砷、 依托泊苷、 伊马替尼等； 这种自噬保护细胞能防止周围环境带来的 说 明 书 1/7 页 3 CN 104922672 B 3 损伤， 诱导肿瘤细胞对放化疗的耐药。 0006 氯喹 （Chloroquine） ， 分子式： C18H26ClN3， 自1944年始用于临床治疗疟疾， 逐步用于 治疗肝阿米巴病、 华支睾吸虫病、

11、肺吸虫病、 结缔组织病等， 以及用于治疗光敏性疾患， 如日 晒红斑症。 研究显示， 氯喹与核蛋白有较强的结合力， 通过喹啉环上带负电的7-氯基与DNA 的鸟嘌呤上的2-氨基接近， 使氯喹插入到DNA的双螺旋两股之间， 与DNA形成复合物， 从而阻 止DNA的复制与RNA转录。 有研究表明， 氯喹进入溶酶体后发生质子化， 从而提高溶酶体的PH 值， 抑制溶酶体的功能， 因此被认为是自噬晚期的抑制剂； 羟化氯喹是氯喹的衍生物， 为4- 氨基喹啉类， 通常用于治疗盘状红斑狼疮及系统性红斑狼疮。 羟化氯喹也是溶酶体的酸化 抑制剂， 可以阻断自噬体与溶酶体的整合， 因此， 亦认为是自噬晚期的抑制剂。 0

12、007 迄今为止， 尚未见有关多巴胺受体激动剂 （尤其是卡麦角林） 诱导垂体腺瘤细胞发 生自噬以及联合应用氯喹用以增强治疗效果的报道。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种治疗垂体腺瘤的药物组合物及其应用、 药盒和包装件。 具体涉及一种多巴胺受体激动剂的增效药物； 尤其涉及含有作为联合制剂的氯喹及其衍生 物与多巴胺受体激动剂治疗垂体腺瘤的药物组合物及其应用、 药盒和包装件。 0009 本发明的治疗垂体腺瘤的药物组合物， 含有作为联合制剂供同时、 分开或顺序使 用的治疗有效量的氯喹和多巴胺受体激动剂， 所述多巴胺受体激动剂优选为卡麦角林或溴 隐亭； 0010 上述的药物组合物中， 氯喹可以

13、以羟化形式或者盐的的形式存在， 包括但不限于 盐酸盐、 硫酸盐、 磷酸盐等； 0011 本发明中， 所述的氯喹衍生物是以氯喹为母核的衍生物， 包括但不限于其他4-氨 基喹啉类抗疟药， 如羟化氯喹(Hydroxychloroquine)、 哌喹 （Piperaquine） 、 氨酚喹 （Amodiaquine Hydrochloride） 、 奎那克林 （quinacrine） 等； 0012 所述的药物组合物中， 多巴胺受体激动剂包括但不限于卡麦角林、 溴隐亭、 诺果宁 等。 0013 本发明中， 优选的提供了所述的氯喹和卡麦角林的药物组合可用于制备治疗垂体 腺瘤药物； 0014 所述氯喹和卡

14、麦角林的药物组合中， 含有氯喹和卡麦角林； 该药物组合中的氯喹 可以以羟化形式或者盐的的形式存在， 包括但不限于盐酸盐、 硫酸盐、 磷酸盐等； 0015 所述氯喹和卡麦角林的药物组合中， 以氯喹为母核的衍生物， 包括但不限于其他 4-氨基喹啉类抗疟药， 如羟化氯喹(Hydroxychloroquine)、 哌喹 （Piperaquine） 、 氨酚喹 （Amodiaquine Hydrochloride） 、 奎那克林 （quinacrine） 等； 0016 所述的药物组合物中， 多巴胺受体激动剂包括但不限于卡麦角林、 溴隐亭、 诺果宁 等。 0017 本发明还提供了一种治疗垂体腺瘤的药盒，

15、 包括含有氯喹的第一药盒单元和含有 卡麦角林的第二药盒单元； 0018 其中， 所述含有氯喹的第一药盒单元包括临床有效剂量的氯喹， 所述含有卡麦角 林的第二药盒包括临床有效剂量的卡麦角林。 说 明 书 2/7 页 4 CN 104922672 B 4 0019 本发明同时提供了一种包装抗垂体腺瘤药物用的包装件， 包括包装空间彼此独立 的含有氯喹的第一包装单元和含有卡麦角林的第二包装单元； 0020 其中， 所述含有氯喹的第一包装单元包括临床有效剂量的氯喹， 所述含有卡麦角 林的第二包装单元包括临床有效剂量的卡麦角林。 0021 本发明中， 所述的药盒或包装件中， 还包括说明书， 该说明书中规定

16、， 所述含有临 床有效剂量氯喹的单元和所述含有临床有效剂量的卡麦角林的单元， 作为联合应用于垂体 腺瘤治疗的制剂。 0022 本发明进行了下述的， 如， 卡麦角林诱导大鼠MMQ、 GH3细胞和人源垂体腺瘤细胞发 生自噬的体外试验； 氯喹联合卡麦角林对细胞自噬和细胞凋亡的影响试验， 并采用Western Blot法检测LC3、 p62、 caspase8、 caspase3/7、 PARP等表达； 在小鼠动物体内证实两者联合应 用对肿瘤生长的抑制效果， 结果表明， 所述氯喹和卡麦角林联合用于肿瘤生长的抑制， 能显 著增加对垂体腺瘤的治疗效果； 0023 本发明的试验中， 将氯喹与卡麦角林的组合物

17、用于大鼠MMQ、 GH3细胞和人源垂体 腺瘤细胞， 结果显示， 比单独使用卡麦角林对细胞的抑制作用更明显； 0024 本发明的试验结果还表明， 所述氯喹与卡麦角林联用干预的方案， 能显著增加 LC3B和P62的表达， 同时细胞凋亡明显增多； 另外， 在体水平证实了两者联合干预的方案对 肿瘤生长抑制的增敏效果。 0025 本发明提供了氯喹的制药新用途， 即作为肿瘤化疗增敏剂， 和卡麦角林联用增加 其对垂体腺瘤的抑制作用， 能提高临床疗效； 所述药物组合物、 药盒及包装件含有作为联合 制剂供同时、 分开或顺序使用的治疗有效量的氯喹和治疗有效量的卡麦角林； 该药物组合 物、 药盒及包装件用于治疗垂体

18、肿瘤时， 能获得优于卡麦角林单独使用的药效。 0026 为了便于理解， 以下将通过具体的附图、 实施例对本发明进行详细地描述。 需要特 别指出的是， 这些描述仅仅是示例性的描述， 并不构成对本发明范围的限制。 依据本说明书 的论述， 本发明的许多变化、 改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。 另外， 本发明 引用了公开文献， 这些文献是为了更清楚地描述本发明， 它们的全文内容均纳入本文进行 参考， 就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。 附图说明 0027 图1. 卡麦角林诱导大鼠MMQ和GH3细胞发生自噬， 通过蛋白水平验证LC3-II的表 达， 共聚焦显微镜下观察GFP-LC3-

19、II的形成， 以及电镜下证实存在自噬体。 0028 图2. 卡麦角林抑制mTOR信号通路， 从mTOR上游的磷酸化AKT下降以及下游的 p70s6k及4EBP1下降都证实了卡麦角林对mTOR通路的影响。 0029 图3.氯喹联合卡麦角林的体外试验 0030 在大鼠MMQ细胞株， 氯喹联合卡麦角林增加细胞凋亡， 采用WesternBlot验证凋亡 水平PARP， 自噬水平p62及LC3的变化， 同时Annexin-V法与caspase3/7检测细胞凋亡水平增 加。 在人原代垂体腺瘤细胞株中也同样使用Western Blot验证凋亡水平PARP， 自噬水平 p62及LC3的变化， 以及细胞活性AT

20、P检测法， 均表明联合治疗显著增加细胞死亡。 0031 图4.在小鼠动物体内证实两者联合应用对肿瘤生长的抑制效果。 说 明 书 3/7 页 5 CN 104922672 B 5 具体实施方式 0032 实施例1， 卡麦角林诱导大鼠MMQ和GH3细胞发生自噬实验 0033 实验材料： 0034 大鼠垂体瘤细胞株MMQ （ATCC） 于37 C， 5 % CO2条件下常规培养， 培养基为含2.5 % 胎牛血清 （Gibco） 加12.5%的马血清的DMEM/F12 （Gibco） ； 卡麦角林购自Tocris(英国)， 母 液100mM由DMSO配制； GFP-LC3质粒来自于Addgene。 C

21、hloroquine （CQ） 购自sigma （美国） ， 母 液 100 mM 超纯水配； MTS及ATP检测细胞活性试剂购自Promega （美国） ； RIPA裂解液、 PMSF 购自碧云天生物生物技术研究所 （江苏） ； Protease Inhibitor Cocktail购自Merck公司 （德国） 。 0035 实验方法： 0036 1） 细胞培养及给药 0037 细胞悬浮于常规培养基中， 并调节细胞密度为1106细胞/孔接种于6孔培养板 中； 0038 培养24后加入含药培养基， 使卡麦角林的终浓度为50M， 空白对照组含DMSO 0.3%； 0039 将给药后的细胞于37

22、C， 5 %CO2条件下培养24小时； 0040 2） 蛋白提取： 0041 临用前将PMSF （100mM， 1:100） 及Protease Inhibitor Cocktail Set （1:200） 加入RIPA裂解液； 0042 6孔板培养的细胞取1ml收集于1.5ml EP管， 2000rpm离心5min， 弃上清， 加入150l 裂解液冰浴裂解20min； 裂解后12000rpm离心5min； 吸取上清进行定量， 同时取部分上清， 加 入1/4体积的上样缓冲液 （5） ， 90-95煮10min； 变性后的蛋白保存于-80冰箱中； 0043 3） Western Blot 检测L

23、C3-II的表达 0044 上样量： BCA蛋白定量药盒对各组提取的蛋白样品进行定量， 校正后蛋白样品上样 量为40g； 0045 电泳方法： 80 V恒压电泳40分钟进行样品的浓缩； 120 V电泳1小时进行样品的分 离， 根据marker判断电泳程度； 0046 转膜： 采用湿转， 170mA， 横流转膜2小时； 0047 抗体杂交： 首先用5%的BSA （封闭液） 在37 C摇床上封闭1小时； 用封闭液将一抗按 说明书稀释， 将转好的膜在杂交袋中4 C杂交过夜； TBST洗膜四次 （37 C摇床， 每次5mL， 5min） ； 用封闭液将二抗稀释， 在杂交袋中37 C摇床杂交1小时； T

24、BST洗膜四次后进行化学发 光检测； 0048 化学发光检测： 采用增强型化学发光法 （ECL法） 进行目的蛋白的检测； 0049 实验结果： 0050 图1 （A） 显示了选取的代表性的实验结果， 结果显示， 在MMQ细胞上卡麦角林增加了 细胞LC3-II的表达； 0051 4） GFP-LC3表达检测 0052 转染GFP-LC3质粒： 说 明 书 4/7 页 6 CN 104922672 B 6 0053 细胞悬浮于常规培养基中， 并调节细胞密度为5105细胞/孔接种于12孔培养板 中； 0054 1、 转染前一天细胞换新的培养基， 2、 制备DNA-Lipofectamine 2000

25、复合物， 如 下: a、 用50ul无血清培养基稀释DNA （0.8g） ， 轻轻混匀； b、 Lipofectamine 2000使用前， 轻 轻混匀， 用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000， 轻轻混匀， 室温孵育5分钟； c、 将a+b的液体加在一起， 轻轻混匀， 室温孵育20分钟， 使DNA-Lipofectamine 2000复合物 形成； 3、 将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中， 轻轻前后摇匀； 4、 放入 37度孵箱中培养2448h后， 1： 10传代， 加入G418筛选。 加入G418的量最好设几个梯度

26、或者转 染前做MTT， 找好G418对你所转细胞致死量的浓度； 0055 5、 待细胞在G418作用下， 长满后冻存 （保种） ， 再克隆化培养： 将细胞消化后计数50 个细胞， 加入22ml完全培养基中， 混匀， 分装在96孔板中 （200ul/孔） ， 第二天在显微镜下， 寻 找孔中有单个细胞的孔并做标记， 等做标记的孔长满后， 消化、 转移到4孔或6孔培养板中； 0056 筛选稳定的GFP-LC3后， 加药处理24h， 甩片后样本用4%的多聚甲醛固定， 1XPBS冲 洗3遍后与共聚焦下观察并拍照 （如图1 B所示） ； 0057 5） . 电镜样品准备： 0058 上述细胞培养给药后24

27、h， 将提取蛋白后剩余1ml细胞培养液收集于15ml离心管 中， 2000rpm离心10min， 后加入2.5%戊二醛中， 送复旦大学电镜中心检测； 结果如图1 （C） 所 示。 0059 实施例2， 卡麦角林抑制mTOR信号通路实验 0060 实验材料： 同实施例1。 0061 Western Blot 检测Polyclonal anti-phospho-AKT, anti-AKT, anti-phospho- p70s6k, anti-p70s6k, anti-phospho-4EBP1, anti-4EBP1, anti-phospho-mTOR, 和 anti-mTOR的表达； 006

28、2 实验方法同实施案例1中的蛋白检测方法， 图2显示了选取的代表性的实验结果， 结果显示， 在MMQ细胞上卡麦角林对mTOR通路存在的抑制作用。 0063 实施例3， 氯喹联合卡麦角林的体外试验 0064 1.MMQ细胞MTS实验检测CAB+CQ药效 （如图3 A所示） 0065 1） 细胞悬浮于常规培养基中， 并调节细胞密度为1104细胞/孔接种于96孔培养 板中， 加入含药培养基分4组， 分别为DMSO,CAB,CQ及CAB+CQ组， 每组5个副孔， 使卡麦角林的 终浓度为50M， CQ的终浓度为20uM， 空白对照组含DMSO 0.3%； 0066 2） 将给药后的细胞于37 C， 5

29、%CO2条件下培养24小时； 0067 3） 每孔加入20l MTS溶液， 继续在培养箱中培养4小时； 0068 4） 以检测波长490nm测定吸光度的值， 计算细胞的生长抑制率， N=5， 实验平行三 次； 0069 2.MMQ细胞通过Annexin-V， caspase3， 及Western Blot检测CAB+CQ药效 （如图3 B- D所示） ； 0070 2， 检测PARP,LC3， P62等关键蛋白 0071 1） 细胞悬浮于常规培养基中， 并调节细胞密度为1106细胞/孔接种于6孔培养板 中， 加入含药培养基分4组， 分别为DMSO,CAB,CQ及CAB+CQ组， 每组5个副孔，

30、 使卡麦角林的终 说 明 书 5/7 页 7 CN 104922672 B 7 浓度为50M， CQ的终浓度为20uM， 空白对照组含DMSO 0.3%； 0072 2） 将给药后的细胞于37 C， 5 %CO2条件下培养24小时； 0073 3） 收集1ml细胞悬液， 冰PBS洗一遍， 加入含Annexin-V-PE 和7AAD 10ul/ml避光孵 育15min后流式细胞仪检测； 0074 4） 每组分别取10000细胞加入白色96孔板， 加入Promega caspase3/7检测试剂， 摇 床孵育10min后， 再避光孵育15分钟， 酶标仪检测化学发光； 0075 5） 收集剩余1ml

31、细胞的蛋白， 检测PARP,LC3， P62等关键蛋白， 方法同实施例1； 0076 3.人原代垂体腺瘤细胞检测CAB+CQ药效 0077 1） 原代细胞培养 0078 （1） .手术中取出人的垂体瘤标本放置于无血清培养液中送至实验室， 0079 （2） .用Hank s液洗涤三次， 并剔除脂肪， 结缔组织， 血液等杂物， 0080 （3） .用手术剪将组织剪成小块 （1mm3） ， 再用Hank s液洗三次， 转移至小青霉素瓶 中， 0081 （4） .视组织块量加入5-6倍体积的0.25%胰酶液， 37中消化20-40分钟， 每隔5分 钟振荡一次， 或用吸管吹打一次， 使细胞分离， 008

32、2 （5） .加入3-5ml培养液以终止胰酶消化作用 （或加入胰酶抑制剂） ， 0083 6.静置5-10分钟， 使未分散的组织块下沉， 取悬液加入到离心管中， 0084 （7） .1000rpm， 离心10分钟， 弃上清液， 0085 （8） .加入Hank s液5ml， 冲散细胞， 再离心一次， 弃上清液， 0086 （9） .加入培养液1-2ml （视细胞量） ， 血球计数板计数， 0087 （10） .将细胞调整到5105/ml左右， 转移至25ml细胞培养瓶中， 37下培养； 0088 2） 药物敏感试验 （ATP法） 0089 （1） 细胞悬浮于常规培养基中， 并调节细胞密度为11

33、04细胞/孔接种于96孔培养 板中， 加入含药培养基分4组， 分别为DMSO,CAB,CQ及CAB+CQ组， 每组5个副孔， 使卡麦角林的 终浓度为50M， CQ的终浓度为20uM， 空白对照组含DMSO 0.3%； 0090 （2） 将给药后的细胞于37 C， 5 %CO2条件下培养24小时； 0091 （3） 每孔加入CellTiter-GLO溶液， 摇床上孵育2分钟， 室温避光孵育15分钟； 0092 （4） 酶标仪检测化学发光； 0093 （5） 结果如图3 （E） 及经5个病人的在72h的统计图 （图 （F） ） 所示； 0094 3） 蛋白检测 0095 方法同实施例1， 原代细胞

34、分为DMSO,CAB,CQ及CAB+CQ组， 药物作用24h后收集蛋 白， 检测LC3， P62及PARP的表达水平， 结果如图3 （G） 以及经5个病人的在24的p62/GAPDH的灰 度统计图 （H） 所示 0096 本发明实验结果表明在MMQ细胞及人原代垂体瘤细胞株上氯喹 （CQ） 增加卡麦角 林的细胞毒作用。 0097 实施例4， 小鼠动物体内实验证实联合应用对肿瘤生长的抑制效果 0098 实验材料： 裸鼠购置于SLAC （上海） ， 其余同上述实施例； 0099 选取 5-7 周的小鼠； . 收集对数生长的肿瘤细胞， 用无血清基质10ml， 于1500 转/ 分， 离心3min， 连

35、续洗 3 次， 最后用无血清基质混匀， 用血球计数器计算肿瘤细胞数 说 明 书 6/7 页 8 CN 104922672 B 8 量( 平均 5 个中方格的细胞计数104即是肿瘤数/ 毫升) ； 计算肿瘤细胞总数后， 再将 肿瘤细胞密度调至107 个/ml， 每只小鼠腋下接种 100ul(即 1106个肿瘤细胞)， 2周左 右可扪及肿瘤小节结； .待肿瘤体积长至约100mm3时， 分组DMSO， CAB， CQ及CAB+CQ组， 给予 CAB （0.25mg/kg） ， CQ （100mg/kg） 口服， 每两天给药一次， 且用游标卡尺量肿瘤纵横大小( 单 位： mm)； .给药21天后， 常

36、规处理裸鼠， 取瘤体称重， 拍照， 并将肿瘤切块保存冻存管及4%的 福尔马林中； 按下述步骤提取肿瘤组织总蛋白; 0100 1. ） 研磨： 剪碎组织， 加入200ul裂解液， 研磨至组织无肉眼可见碎片； 0101 2） 吸取至EP管中： 吸取组织悬液至EP管中， 用200ul裂解液冲洗研磨器， 把组织混 悬液尽量都冲下来， 吸入EP管中， 重复一次， 共600ul组织混悬液， 冰上裂解1h； 0102 3） 4， 20,000g （或最大） 离心30分钟， 取上清 （沉淀为细胞大碎片和核碎片, 上清 即为总蛋白） ; 0103 4） 如上述方法采用BCA法测组织蛋白浓度； 0104 Western Blot法检测组织蛋白中的PARP， p62， LC3及beta-tubulin； 实验结果表 明， CQ与CAB联合干预能促进细胞的死亡， 抑制肿瘤细胞生长。 说 明 书 7/7 页 9 CN 104922672 B 9 图1 说 明 书 附 图 1/3 页 10 CN 104922672 B 10 图2 说 明 书 附 图 2/3 页 11 CN 104922672 B 11 图3 图4 说 明 书 附 图 3/3 页 12 CN 104922672 B 12