胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法 【技术领域】
本发明公开了一种胚胎干细胞诱导分化为肝细胞的方法，特别是一种利用多种细胞生长因子将胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法。背景技术
胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES cells)作为一种细胞分化的技术平台，在细胞诱导分化方面具有无可比拟的优势，它是从胚胎囊胚内细胞团中分离出来的原始全能干细胞，是所有成体干细胞和成熟细胞的分化源头，具有分化为所有组织和细胞的潜能。控制ES细胞的定向分化进而为各种细胞疗法提供理想的细胞来源甚至器官的克隆，是众多研究者共同关注的问题。特别是因为人类ES细胞的建系使得干细胞研究连续两年被Science杂志评为世界十大科技进展，掀起了ES细胞的研究热潮。现在，ES细胞已经用于多种细胞诱导分化研究，如造血细胞、肌细胞、神经细胞、骨细胞等，并取得了许多成果，积累了相当的经验。
目前，肝脏功能衰竭的治疗方法中，肝细胞替代疗法(肝细胞移植、生物人工肝等)因其方法简单、疗效可靠而有望成为最理想的治疗方法，但其中的理想种子细胞——肝细胞来源问题一直难以解决，ES细胞具有免疫原性低、增殖力旺盛和可塑性强的优点，其诱导分化的肝细胞是肝细胞替代疗法中的最理想的细胞来源。但是肝细胞功能复杂，从肝前体细胞、幼稚肝细胞到成熟肝细胞还有许多阶段，不但要在定向诱导系统中证明肝细胞的出现，还要诱导并证明其成熟分化，表达正常肝细胞的功能，才能完成肝细胞替代疗法中的任务，这就造成了诱导方法复杂而且细胞培养周期很长；另外，成熟肝细胞的鉴定也缺乏特异有效的标记物，常需要几个标记物一起从不同水平来鉴定才能证明肝细胞的出现，使得鉴定过程过于复杂。由于以上原因，肝细胞在ES细胞定向诱导系统中的研究起步很晚，并且只是研究了部分细胞因子、培养条件对肝细胞分化地作用和部分肝细胞标记物对肝细胞的鉴定，而象各种细胞因子在肝细胞成熟分化中的具体作用、肝细胞分化率等许多重要问题一直未有报道。
Chinzei R等于2002年报道了小鼠ES细胞向肝细胞分化方法(Hepatology，Jul；36(1)：22-9)，其具体步骤如下：选用BL6系ES细胞，先进行拟胚体(embryonic bodys，EBs)培养5天，让ES细胞发育为EBs；第6-10天，在培养液中加入酸性纤维细胞生长因子(aFGF，20纳克/毫升)和碱性纤维细胞生长因子(bFGF，10纳克/毫升)；第10-16天，在培养液中加入肝细胞生长因子(HGF，10纳克/毫升)；第16-21天，在培养液中加入制瘤素(OSM，10纳克/毫升)，地塞米松(DEX，10-7摩尔/升)，ITS(胰岛素10微克/毫升，转铁蛋白5微克/毫升，亚硒酸5纳克/毫升)。
经过RT-PCR监测，证明在细胞诱导系统中有白蛋白基因、甲胎蛋白基因、酪氨酸氨基转移酶基因的表达，表明这些细胞表达了肝细胞特有的基因，从而证明肝细胞的出现；经过蛋白质印迹法(westen blot)监测，发现在诱导的细胞中有白蛋白合成，证明诱导的肝细胞可以表达成熟肝细胞的某些功能，如白蛋白合成功能。
但是，上述胚胎干细胞诱导分化为肝细胞的方法存在以下的不足：诱导方法步骤2中，aFGF和bFGF两种细胞生长因子中，只用对肝细胞发生及生长作用较好的aFGF即可；培养系统中未选择采用促进肝细胞发生及生长的关键细胞生长因子，导致肝细胞分化率不高。发明内容
本发明的目的就是提供一种细胞生长因子运用更加合理和高分化率的胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的。ES细胞经过拟胚体(embryonic bodys EBs)悬浮发育后，植入胶原(白明胶)处理过的培养板或培养瓶中使其贴壁生长，开始自然分化；然后在不同时间段分别加入分化生长因子(TGF)，甲胎蛋白(AFP)，酸性纤维细胞生长因子(aFGF)，肝细胞生长因子(HGF)，制瘤素(OSM)，地塞米松(DEX)，以及胰导素、转铁蛋白、亚硒酸(ITS)进行肝细胞定向诱导。
本发明的胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，aFGF和bFGF两种细胞生长因子中，仅采用了对肝细胞作用较好的aFGF，同时，细胞诱导培养系统中选择采用了促进肝细胞发生及生长的细胞生长因子TGF、AFP，使培养系统中的细胞生长因子得到优化，肝细胞分化率得到了大幅的提高。具体实施方式
高分化率是ES细胞向肝细胞定向诱导分化的最终要求，本发明研究了各种细胞因子、培养条件对肝细胞分化的具体作用和针对多种肝细胞标记物对肝细胞的鉴定，并对诱导培养系统中肝细胞的分化率进行了研究，明确了各种细胞因子在肝细胞成熟分化中的作用、肝细胞成熟分化的鉴定指标，并力求得到较高的肝细胞分化率。下面对本发明的胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法作进一步的描述。
本发明可以按如下所述来选择细胞诱导培养所需试剂及器材：
1、ES细胞：选用中山大学实验动物中心建系的BALB/c系小鼠的ES细胞；
2、细胞培养试剂：
ES细胞培养基：Dubeco’s Modified Eagle’s Medium(glucose，4.5g/L)(Gibicol，Bra，USA)，20％胎牛血清(四季清，杭州)，0.1mmol/L 2-巯基乙醇(Gibicol，Bra，USA)，25mM HEPES(Gibco BRL，USA)，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco BRL，USA)，1000U/mL重组小鼠白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)(Gibicol，Bra，USA)；
EB及EB分化培养基：Dubeco’s ModifieEagle’sMedium(glucose，4.5g/L)(Gibicol，Bra，USA)，20％胎牛血清(四季清，杭州)，0.1mmol/L 2-巯基乙醇(Gibicol，Bra，USA)，25mM HEPES(Gibco BRL，USA)，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco BRL，USA)；
细胞生长因子：小鼠转化生长因子(transforming growth factor，TGF)(sigma，USA)，小鼠甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)(sigma，USA)，小鼠酸性纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor，aFGF)(sigma，USA)，小鼠肝细胞生长因子(hepatocyte growthfactor，HGF)(sigma，USA)，小鼠制瘤素oncnstatinM，OSM)(sigma，USA)，地塞米松(dexamethasone，DEX)(sigma，USA)，胰岛素(insulin)，(sigma，USA)，转铁蛋白(transferrin)(Gibco BRL，USA)，亚硒酸(selenious acid，)(天津市化学试剂研究所)，白明胶(Sigma，USA)。
具体诱导及鉴定过程为：(一)ES细胞的肝细胞定向分化培养：
1、ES细胞培养：将保存在液氮中的ES-BLAB/c细胞取出，立即置于37-39℃的环境中解冻复苏，离心弃上清去除DMSO以及残存的胰酶，加入ES培养基吹散，以2×104cells/ml的密度将细胞转至一次性塑料培养瓶中，每天换液一次，每2-3天传代一次；
2、ES细胞发育为EBs：ES细胞换用Ebs培养基，将细胞转至玻璃培养瓶中用摇动培养法培养，每1小时摇动细胞一次，使其悬浮生长发育为EBs，第2-3天每3小时摇动一次，第4-5天每1小时摇动一次；EBs的发育分化期间每1-2天换液一次，摇动培养法培养5天，开始培养EBs的当天作为细胞分化的第一天；
EBs培养时换用玻璃培养瓶是因为玻璃培养瓶未经过促细胞黏附作用处理，瓶底光滑，易于EBs悬浮生长；摇动培养法操作时，开始培养EBs的第一天非常重要，因为此时的ES细胞尚处在向EBs分化的初期，ES细胞黏附性强的特点使其容易贴壁，此时的悬浮生长对EBs的发育及形成良好的EBs结构非常重要，贴壁不但影响ES细胞向EBs的发育分化，还会阻碍正常EBs结构的形成及EBs的生长；第2-3天则影响相对较小，第4-5天又因为EBs重量增大易于贴壁，又要十分注意1小时摇动一次；本试验未选用悬滴培养法，是因为摇动培养法产生EBs数量充足，而悬滴培养法产生的EBs数量非常小，难以满足本实验RT-PCR和ICC等方法检测对大量分化细胞的需求。
3、肝细胞定向诱导分化：EBs悬浮发育生长5天后，于第6天转至0.1％白明胶处理过的6孔培养板和24孔培养板上，让其充分贴壁生长分化，每2天换液一次，胚体贴壁并向四周生长分化，白明胶在此处的作用是模拟体内细胞基质的作用；第7天-第11天，加入aFGF，终浓度为100ng/ml；第7天-19天，加入TGF，终浓度为20ng/ml；AFP，终浓度为20ng/ml；第11天-第19天，加入HGF和OSM，终浓度为20ng/ml和10ng/ml，10-7M地塞米松，5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，5μg/ml亚硒酸。
设立两组对照组：(1)自第七天开始，只用EBs培养液，不加入aFGF、HGF、OSM等生长因子，其他培养条件同细胞因子组，使EBs细胞自然分化；(2)用前述文献中的诱导方法进行ES细胞向肝细胞方向的诱导。
肝细胞鉴定：
1、细胞分化形态观察：进行EBs培养的第一天作为细胞分化的第一天，每天在显微镜下观察细胞生长状态，EBs发育状况，贴壁生长后细胞分化类型及生长状态，观察是否有典型肝细胞形态结构的细胞出现。
2、AFP、ALB、TAT、G6P基因在培养系统中表达的RT-PCR检测：从ES细胞分化的第1天开始，每隔1天，至19天为止.即于第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19天收集生长因子组和对照组分化的细胞，常规冻存于液氮中，于第19天时一起进行以上四中基因的RT-PCR检测，总RNA提取和RT-PCR步骤按试剂盒说明。
3、上清中AFP、ALB和尿素浓度的测定：从ES细胞分化的第1天到19天，每天收集生长因子组和对照组培养上清液3毫升，于4℃保存，第15天时用放射免疫法测定AFP、ALB的浓度，用自动生化分析仪进行尿素浓度的测定，并进行生长因子组和对照组不同时间段分析。
4、AFP、ALB、CK8、CK18鉴定：EBs贴壁分化后第2天开始，即第7、9、11、13、15、17、19天在24孔板中培养的分化细胞进行间接免疫荧光和SABC法免疫细胞化学检测，观察各种肝细胞特异指标表达和肝细胞形态结构以及空间分布规律。
5、对定向诱导分化第19天的细胞进行DAB显色的SAB法免疫细胞化学染色后，不进行苏木素复染，对ALB、CK8和CK18三个指标的阳性细胞数和全部培养系统中细胞数计数并算出三种阳性细胞率，计算三者的平均数，即为肝细胞分化率。AFP虽为幼稚肝细胞的标记物，但是因为它在软黄囊和一些内胚层前体细胞中也有表达，为了提高肝细胞分化率计算的精确性，不将AFP阳性细胞率计算在内。经过细胞分化率计算得到：本发明的诱导分化方法肝细胞分化率为31.6％；对照组(1)的分化率为依次分别为8.2％，对照组(2)的分化率为15.6％。从分化率结果可以看出，本发明的诱导方法在分化效率方面有很大的提高。
另外，利用本ES细胞诱导系统，只要改变细胞因子的部分成分即可进行向造血细胞、神经细胞、骨细胞等细胞方向的定向诱导。