一种制备白术倍半萜复合物的方法 技术领域 本发明属于药物成分分离纯化领域， 具体涉及超临界萃取耦合分馏技术制备白术 倍半萜复合物的方法。
背景技术 倍半萜 (sesquiterpenes) 是指分子中含 15 个碳原子的天然萜类化合物。一般通 式为 C15H24， 分子量为 204。倍半萜在植物体内常以醇、 酮、 内酯等衍生物形式存在于挥发油 中， 是挥发油中高沸点部分的主要组成部分， 多具有较强的香气和生物活性， 是医药、 食品、 化妆品工业的重要原料。
白术为菊科植物白术 (Atractylodes macrocephala koidz) 的干燥根茎， 是临床 应用最广泛的药材之一， 中医认为其性温， 味辛、 苦， 具有补脾、 益胃、 燥湿、 和中的功效。白 术主要含有挥发油， 主要由月桂烯、 罗勒烯、 柠檬烯、 α- 蒎烯等单萜类成分 ( 分子中碳原子 数通常小于 15， 分子量小于 204) ； δ- 蛇床烯、 榄香烯、 雪松烯、 丁香烯等倍半萜类组分 ； 以 及苍术醇、 苍术酮、 白术内酯、 3-β- 乙酰氧基苍术酮、 3-β- 羟基苍术酮等以醇、 酮、 内酯等 形式存在的倍半萜衍生物组成。倍半萜是白术挥发油的主要有效部位， 其中又以苍术酮含 量最高， 常被用作倍半萜类化合物的代表性指标。 现代药理研究表明， 白术倍半萜化合物具 有细胞毒性， 能抑制肝毒细胞对肝组织的破坏作用， 修复肝损伤。
白术挥发油的传统提取方法多采用水蒸汽蒸馏制备， 水蒸气蒸馏法提取时间长， 挥发油中小分子单萜类物质极易氧化降解， 产生过氧化物， 进一步诱发苍术酮等倍半萜化 合物发生氧化反应， 严重影响所萃取的倍半萜复合物的稳定 性。 为将白术挥发油中的单萜 化合物脱除， 进一步提高苍术酮含量， 通常采取柱层析或精馏方法进行。 柱层析分离步骤繁 琐， 要使用大量的有机溶剂， 对环境和人体健康都有一定的不利影响。 而普通精馏过程中热 敏性物质容易分解， 尤其是苍术酮因长时间加热而氧化降解， 尽管分子蒸馏可以克服这个 缺陷， 但因费用昂贵， 难以工业化应用。
随着超临界 CO2 萃取技术的兴起， 也逐渐应用到白术挥发油的萃取上。中国专利 “苍术酮、 含苍术酮的植物及苍术酮提取物在制备抗流感病毒药物中的用途” (CN1857358A) 公开了一种采用超临界 CO2 从苍术药材中萃取苍术酮的方法， 但未对其中的单萜化合 物进行脱除。中国专利 “白术挥发油部位的抗炎成分制备及其在制备抗炎药物的用 途” (CN1682897) 采用超临界 CO2 萃取获得白术挥发油部位， 再经硅胶柱层析、 C18 硅胶反相 柱层析分离精制， 得到白术内酯 I 和白术炔类组分。这些专利尽管使用到了超临界萃取方 法， 但是由于超临界 CO2 萃取苍术酮等倍半萜成分的同时， 也萃取出一些挥发性的小分子单 萜类成分， 如要进一步纯化， 则涉及到多次柱层析， 流程复杂。
超临界 CO2 分馏根据变温回流原理， 通过改变 CO2 的密度， 使多元混合组分在 CO2 中 产生溶解度差异而进行分离， 特别适合热敏性， 沸点相近、 性质相似的同系物的分离。采用 超临界 CO2 萃取白术挥发油， 再进入超临界分馏柱中分馏。由于单萜类成分分子量较小， 而 苍术酮等倍半萜化合物分子量较大， 在超临界 CO2 中溶解度不同。基于此， 本申请通过设置
不同的分馏温度与分馏压力， 使单萜与倍半萜产生较大的溶解度差异， 分离为单萜成分与 倍半萜复合物两个馏分段， 再收集不含单萜的倍半萜馏分段。超临界 CO2 萃取与分馏技术 耦合起来， 为超临界 CO2 介质中白术挥发油的脱萜与倍半萜复合物制备提供了一条新途径， 具有技术与应用的新颖性和创造性。 发明内容
本发明的目的在于提供一种白术挥发油脱除单萜并制备倍半萜复合物的方法。
根据本发明的目的， 具体而言， 采用超临界 CO2 萃取白术挥发油， 并结合超临界 CO2 分馏挥发油， 使白术挥发油的单萜成分与倍半萜复合物按分子量大小依次分离。该分馏过 程有别于传统分馏， 不是根据混合组分的沸点， 而是根据混合组分在超临界 CO2 中的溶解度 大小进行分离。 其原理是， 先采用超临界 CO2 萃取白术挥发油， 再进入超临界分馏柱中分馏。 溶有白术挥发油的超临界 CO2 沿分馏柱上升过程中， 温度升高， 超临界 CO2 的密度降低， 由于 白术挥发油在超临界 CO2 相中分配系数的差异， 分子量较大的倍半萜的溶解度比分子量较 小的单萜的溶解度下降得更多。倍半萜成分不断从超临界 CO2 析出， 形成回流， 回流液与上 升组分进行热量与质量交换， 结果使倍半萜不断落下而富集， 单萜组分不断上升而导出分 馏柱。 基于此原理， 分别截取分子量较低的单萜组分馏分与分子量较高的倍半萜组分， 使白 术挥发油的萃取与脱萜连续完成， 以解决现有技术纯化步骤繁琐的不足之处。 本发明所述白术挥发油脱萜并制备倍半萜复合物的方法， 包括以下步骤 ：
1) 将白术药材放入超临界萃取器中， 在设定的温度、 压力下进行萃取， 萃取物随超 临界 CO2 流体进入分馏柱中 ；
2) 在一定分馏压力下， 在分馏柱上施加一个由低至高的温度梯度， 控制超临界 CO2 流体在一定流速下对挥发油进行分段分馏 ；
3) 挥发油经分馏后分离为单萜组分与倍半萜复合物两个馏分段， 经减压后依次进 入分离器， 收集倍半萜复合物馏分段， CO2 经转子计量计计量后排空。
所述的白术药材为菊科植物白术 (Atractylodes macrocephala koidz) 的干燥根 茎。
所述的萃取压力为 15 ～ 30MPa， 优选为 20 ～ 30MPa。
所述的萃取温度为 308 ～ 348K， 优选为 308 ～ 328K。
所述分馏温度为 313 ～ 358K， 优选为 313 ～ 343K， 分为四段控温， 温度梯度为 10K。
所述的分馏压力为 25 ～ 30MPa， 优选为程序升压的方式， 从 25MPa 升压至 30MPa， 每 20min 升高 1MPa， 30MPa 下保持 20min。
所述的超临界 CO2 流速为 2 ～ 10L/min， 优选 CO2 流速为 2 ～ 5L/min。
所述的分离压力为 5MPa， 分离温度为 323K。
所述的倍半萜复合物是倍半萜与倍半萜衍生物的混合物， 其中苍术酮的质量百分 数不低于 50％。
与现有技术相比， 本发明的特点和优点在于 ：
(1) 采用温度梯度和压力调节的方法， 白术挥发油在萃取器、 分馏柱中完成萃取、 吸附、 分馏、 解附过程， 使倍半萜复合物与单萜类成分实现连续分离。
(2) 获得不含单萜的倍半萜复合物， 其中苍术酮的质量分数得以提高， 达到国家五
类中药新药的要求。
(3) 白术挥发油的整个萃取分馏过程在都在化学惰性的超临界 CO2 溶媒中完成， 整 个过程温度低， 不易发生氧化与降解反应， 同时也不需要进行溶剂后处理， 不会产生溶剂残 留， 脱除单萜后的倍半萜复合物能完全保持生物活性， 符合当前药品与食品绿色化开发趋 势。 附图说明
图 1 显示本发明制备纳米脂质体的方法的一种实施方式的流程图， 1CO2 钢瓶 ； 2热 交换器 1 ； 3 冷机 ； 4 高压泵 1 ； 5 热交换器 2 ； 6 萃取釜 ； 7 热交换器 3 ； 8 分馏柱 ； 9 热交换器 4； 10 分离器 ； 11 量筒 ； 12 转子流量计 ； V1， V2， 止回阀 ； V3 回压调节阀 ； T1 ～ T4 ： 分馏柱分 馏段
图 2 显示超临界 CO2 萃取的白术挥发油的质谱总离子流图。
图 3 显示超临界 CO2 分馏后的白术倍半萜复合物的质谱总离子流图。 具体实施方式
为了更好地理解本发明的实质， 以下实施例用于详细说明本发明的技术内容， 但 不应理解为对本发明保护范围的限制。
实施例 1 白术挥发油的脱萜与倍半萜复合物制备
1. 白术挥发油的萃取分馏过程
苍术酮对照品， 深圳海王生物股份公司提供。
实验装置 ： 超临界 CO2 萃取分馏设备由江苏华安超临界公司制造， 装置由 CO2 供给 系统、 萃取器、 分馏柱和分离器等组成。 萃取器容积为 1L， 分馏柱高 2m， 内径 20mm， 柱内填有 不锈钢箔团， 分为四段控温。阀门 V1， V2 控制萃取器、 分馏柱与分离器相连的管路， 阀门 V3 控制分馏柱压力。整个系统最大承受压力 35MPa， 最高承受温度 368K。
Agilent 6890 气相色谱 ： 美国安捷伦公司 ； 岛津 GCMS-QP2010Plus 气相色谱 - 质 谱联用仪， 日本岛津公司
制备方法 ： 在一种实施方式中， 本发明涉及的白术挥发油的脱萜与倍半萜复合物 制备的方法可以在超临界 CO2 萃取分馏装置中完成， 详细流程图如图 1 所示。
将 200g 白术药材装入萃取器内胆中， 封盖。打开 CO2 钢瓶， CO2 气体经冷机 3 冷却 成液体后， 由高压计量泵 4 加压后进入萃取器 6。 在 25MPa、 308K 的萃取条件下萃取挥发油。 开启阀门 V2， 关闭阀门 V1， 超临界 CO2 携带着挥发油由底部进入分馏柱。调节阀门 V3， 控制 分馏压力为 25MPa， 分馏柱上由底部向顶端施加一个由低到高的温度梯度为 313K ～ 323K ～ 333K ～ 343K。按每 20min 升高 1MPa 的程序升压方式， 提高分馏压力直至 30MPa， 并保持 20min。分馏组分从柱顶随超临界 CO2 进入到分离器 10， 在 5MPa， 323K 下解析。CO2 流量控 制在 5L/min， 经转子流量计 12 排空。分别收集 1h 馏分与 2h 馏分， 采用气相色谱测定馏分 中单萜与苍术酮的含量。
2. 单萜与苍术酮的测定
采用气相色谱测定超临界分馏物中单萜与苍术酮的含量。色谱条件为 ： 色谱柱 ： HP-5MS， 石英毛细管柱 (30m×250μm×0.25μm) ； 进样口温度 ： 250 ℃， FID 检测器温度 ：280℃ ； 柱温 ( 程序升温 ) ： 80℃ (1min) → (5℃ /min) → 200℃ ； 分流比 1 ∶ 50 ； 载气 ： N2， 流量 ： 1.0ml/min。
白术挥发油经分馏后， 馏分中单萜与苍术酮的含量如表 1 所示。
表 1 超临界萃取分馏脱萜过程
本例结果显示， 经过超临界分馏， 白术挥发油按分子量大小分离为两个馏分段， 第 一个馏分段， 主要是含有分子量小于 204， 即碳原子数小于 15 的单萜类组分， 其中总含量为 30.43％， 苍术酮的含量为 15.46％。第二个馏分段的单萜类 化合物全部脱除， 主要含有分 子量大于等于 204 的倍半萜， 及其倍半萜的酮、 醛、 内酯的衍生物， 其中苍术酮的含量达到 52.13％， 脱萜效果显著。
实施例 2 白术挥发油的萃取
本实施例考察白术挥发油的萃取过程。将 200g 白术药材装入萃取器内胆中， 封 盖。打开 CO2 钢瓶， CO2 气体经冷机 3 冷却成液体后， 由高压计量泵 4 加压后进入萃取器 6。 在 25MPa、 308K 的萃取条件下萃取出挥发油后， 开启阀门 V1， 关闭阀门 V2， 超临界 CO2 携带着 挥发油进入到分离器 10， 在 5MPa， 323K 下解析。CO2 流量控制在 5L/min， 经转子流量计 12 排空。收集萃取出的挥发油， 采用气相色谱测定组分中单萜与苍术酮的含量， 结果如表 2 所 示。
表 2 超临界萃取白术挥发油
本例结果显示， 超临界 CO2 萃取白术挥发油， 主要成分是含月桂烯、 罗勒烯、 柠檬 烯、 α- 蒎烯等单萜类成分， δ- 蛇床烯、 榄香烯、 雪松烯、 丁香烯等倍半萜类组分， 苍术醇、 苍术酮、 白术内酯 A、 白术内酯 B、 3-β- 乙酰氧基苍术酮、 3-β- 羟基苍术酮等以醇、 酮、 内酯 等形式存在的倍半萜的衍生物。其中单萜总含量为 8.66％， 苍术酮的含量为 36.65％， 尚需 进一步纯化。
实施例 3 萃取压力对白术挥发油萃取影响
本例考察萃取压力对白术挥发油的影响。将 200g 白术药材装入萃取器内胆中， 封 盖。按实施例 2 的方法与参数， 在 308K 的温度下， 控制超临界 CO2 压力 为 15 ～ 30MPa， 萃 取出挥发油后， 采用气相色谱测定馏分中单萜与苍术酮的含量， 结果如表 3 所示。
表 3 萃取压力对白术挥发油萃取影响
本实施例结果表明， 在较低压力下， 挥发油萃取率较低， 主要成分是分子量较低的 单萜成分， 苍术酮含量很低。随着压力的升高， 对挥发油组分的溶解度增加， 苍术酮等分子 量较大的组分逐渐被萃取出来， 萃取率增加， 苍术酮的含量增加， 而单萜类相对含量下降。 当压力增加到 20MPa 时， 萃取率达到 1.98％， 苍术酮的含量增加为 22.45％。当萃取压力进 一步增大， 挥发油组分基本已经萃取出来， 萃取率不再增加， 单萜与苍术酮的含量基本保持 不变。因此， 优选萃取压力为 20 ～ 30MPa， 此时挥发油被完全萃取出来。
实施例 4 萃取温度对白术挥发油萃取的影响
本例考察萃取压力对白术挥发油的影响。将 200g 白术药材装入萃取器内胆中， 封 盖。按实施例 2 的方法与参数， 在 308K ～ 348K 的温度下， 控制超临界 CO2 压力为 25MPa， 萃 取出挥发油后， 采用气相色谱测定馏分中单萜与苍术酮的含量， 结果如表 4 所示。
本实施例结果表明， 白术挥发油的萃取与组分含量与温度相关。温度升高， 超临 界 CO2 的密度下降， 对白术挥发油的溶解能力下降， 挥发油的萃取率下降。同时， 密度的下 降， 对于分子量大的组分溶解度的影响比分子量小的组分更大， 苍术酮的溶解度下降比单 萜类成分下降得更多， 表现为萃取物中苍术酮的含量逐渐减小， 而单萜类成分的含量反而 增加的现象。随着温度的增加， 苍术酮含量下降的趋势更加明显。因此， 优选萃取温度在 308K ～ 328K， 所制备的挥发油单萜成分小于 20％。
表 4 萃取温度对白术挥发油萃取影响
实施例 5 分馏温度对白术挥发油脱萜影响
本例考察分馏温度对白术挥发油脱萜的影响。将 200g 白术药材装入萃取器内胆 中， 封盖。按实施例 1 的方法与参数， 分馏压力为 25MPa， 温度梯度为 308K ～ 358K。分别收
集 1h 馏分与 2h 馏分， 采用气相色谱测定馏分中单萜与苍术酮的含量， 结果如表 5 所示。
本实施例结果表明 ： 保持较高的柱顶温度可以使萃取出的倍半萜析出回落， 提高 回流比， 增加了选择性。但由于在高温下， 苍术酮会降解， 而且再增加柱顶温度会使分馏速 度过慢， 消耗超临界 CO2 的量增多， 脱萜效果与苍术酮含量无明显提高。因此， 综合脱萜效 果与从经济性考虑， 柱顶温度定在 343K 为宜。柱底温度定为 313K， 与萃取温度相近， 可降 低能耗。柱内控温段数对分离效果也有影响， 控温段数越多， 回流次数越多。均匀增加的温 度梯度， 能产生相对 稳定的内回流， 有利于提高分离效率。因此， 分馏温度优选为 313K ～ 343K， 分为四段控温， 温度梯度为 10K。
表 5 分馏温度对倍半萜复合物制备的影响
实施例 6 分馏压力对白术挥发油脱萜影响
本例考察分馏压力对白术挥发油脱萜的影响。将 200g 白术药材装入萃取器内胆 中， 封盖。按实施例 1 的方法与参数， 分馏压力为 25 ～ 30MPa， 分馏温度为 313K ～ 323K ～ 333K ～ 343K。 分别收集 1h 馏分与 2h 馏分， 采用气相色谱测定馏分中单萜与苍术酮的含量， 结果如表 6 所示。
考虑到操作的方便， 采取了萃取与分馏压力保持一致的方法。 在较低压力下， 分馏 速度较慢， 轻质成分例如单萜成分同时分配在两个馏分段内， 分离度较低。随着压力的增 大， 白术挥发油在超临界 CO2 中的溶解度增加， 但是轻质成分与重质成分在超临界 CO2 中的 溶解度的差异减少， 降低了分离效果。当压力升高到 28MPa 后， 分馏对重质成分倍半萜的分 离效果不佳。 根据白术挥发油轻重组分的组成特点， 借鉴超临界色谱程序升压的办法， 采取 微小幅度阶梯式调节压力对组分进行选择性萃取的方法， 这相当于进行多轮分馏， 同时保
证单萜轻质成分与倍半萜重质成分的分离度， 同时可以减少超临界 CO2 的消耗， 缩 短分馏 时间。因此分馏压力优选程序升压的方式， 从 25MPa 以每 20min 升压 1MPa 的方式升压到 30MPa， 并保留 20min。白术油经分馏分离后， 单萜成分已完全脱除， 苍术酮的含量达到 50％ 以上， 满足中国药典关于五类中药中间体的含量要求。
表 6 分馏压力对倍半萜复合物制备的影响
实施例 7 热质传递对白术挥发油脱萜的影响
本例考察热质传递对白术挥发油脱萜的影响。将 200g 白术药材装入萃取器内胆 中， 封盖。按实施例 1 的方法与参数， CO2 流速控制为 2 ～ 10L/min， 分馏压力为程序升压 ： 25MPa → 30MPa(20min)(1MPa/20min)， 温度梯度为 313K ～ 323K ～ 333K ～ 343K。分别收集 1h 馏分与 2h 馏分， 采用气相色谱测定馏分中单萜与苍术酮的含量， 结果如表 7 所示。
分馏柱内的热量与质量的传递交换直接影响白术挥发油的脱萜效果。当流速为 10L/min 时候， 虽然加快了白术挥发油在流体中扩散速率， 但造成了热质传递的不充分， 引 起返混， 降低分离效果。尽可能使白术挥发油在超临界 CO2 中接近饱和状态， 这就要求保持 较小而稳定的流速， 以延长馏分在柱内回流时 间。因此， 优选 CO2 流速为 2 ～ 5L/min， 可使 CO2 与挥发油两相接近平衡状态， 增大了回流比， 提高了热质传递效率， 有利于单萜与倍半 萜化合物的分离。
表 7 热质传递对白术挥发油脱萜的影响
实施例 1 ～ 7 表明， 超临界 CO2 萃取耦合分馏技术提供了一条白术单萜脱除与倍 半萜制备的一条新途径， 实现了白术挥发油的萃取与倍半萜成分富集同时完成， 有效克服 了传统方法萃取与分离白术挥发油流程复杂、 需使用大量有机溶剂、 倍半萜在分离过程中 容易降解的缺陷， 所制备的倍半萜复合物中苍术酮的含量大于 50％， 达到国家药典关于中 药新药中间体的质量要求。