白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶ASHPT基因及用途.pdf

白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶 (AsHPT) 基因及用途
    技术领域 本发明涉及一新的基因序列， 以及这种基因序列的制备方法和用途， 确切讲本发 明涉及白沙蒿尿黑酸叶绿基转移酶 (AsHPT) 及其制备与用途。
     背景技术 维生素 E， 又被称作生育酚。是一种动物正常繁殖所必须的物质， 能抗不育和防止 早产、 流产， 参见宋晓燕， 杨天奎 “天然维生素 E 的功能及应用” 《中国油脂》 2002， 25(6) ： 45-48。维生素 E 作为饲料添加剂， 可以提高动物的免疫力、 改善肉质、 奶质并提高繁殖能力 和缓解动物应激反应 参见 ： 肖雄 .“维生素 E 的研究与应用” 《畜禽业》 2002， 4： 24-26。维 生素 E 与人体中枢神经系统， 心血管系统有着密切的关系， 现代医学证明 ： 维生素 E 可以防 治冠心病、 高血压、 心肌梗塞、 血栓等疾病参见 ： Ajjawi I.and Shintani D.“Engineered plants with elevated vitamin E ： a nutraceutical success story” 《Trends Biotech》 2004， 22(3) ： 104-107 ； Vertuani S， Angusti A and Manfredini S. “The antioxidants and pro-antioxidants network ： An overview.” 《Cur Pharmaceutical Design》 2004， 10(14) ： 1677-1694。维生素 E 还有美容、 护肤、 防衰老、 抗癌等功效， 参见 ： 雷炳福 “我国天然维生素 E 产业化前景初探” 《中国油脂》 2003， 28(4) ： 49-51。
     维生素 E 存在于植物的不同组织 ： 包括绿色光合组织和种子等。不同植物中维生 素 E 的组成、 含量及总量有着十分大的差异 ( 参见表一 )。尿黑酸叶绿基转移酶 (HPT) 基因 是介导维生素 E 合成的关键酶基因， 控制着生育酚总量的合成。GenBank 中已公布了拟南 芥、 木薯、 玉米、 小麦、 葱、 芫荽等植物的尿黑酸叶绿基转移酶 (HPT) 基因的核苷酸序列和氨 基酸序列。
     表 1 沙蒿油与其他植物油 VE 含量 ( 单位 ： mg/kg)
     发明内容
     本发明提供一种取自沙生植物 - 白沙蒿的 HPT 基因， 以及这种基因的制备方法及用途。 白沙蒿 (Artemisia sphaerocephala krasch) 是我国特有的优良超旱生固沙植 物， 是我国沙区畜牧业的重要饲料之一。几乎所有植物油均含有维生素 E， 但含量远不及国 际上公认为植物油含维生素 E 之冠一， 小麦胚芽油。从沙篙籽中提取的沙篙油， 经测试维生 素 E 含量达到 2779.1mg/kg， 高于小麦胚芽油中维生素 E 的含量， 参见 ： 白寿宁， 云秀芳 “沙
     篙油开发利用探讨” 《粮食与油脂》 ， 2000(3) ： 31-33。
     本发明所述的白沙蒿 HPT 基因序列为基因序列表中的 SEQ 1。
     本发明所涉及的白沙蒿 HPT 基因制备方法是 ： 首先提取白沙蒿的 RNA， 再反转录 为 cDNA ； 利用 GenBank 中已公布的其它植物的 HPT 基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同 源性分析， 根据保守区设计合成一对简并引物 P1、 P2 ； 以得到的白沙蒿 cDNA 为模板扩增得 到白沙蒿 HPT 核心片段核苷酸序列 ； 根据测序得到的 HPT 基因核心片段序列分别设计白沙 蒿 HPT 基因特异引物 5’ 端外侧引物 P3 和巢式引物 P4， 分别与 GeneRacerTM 试剂盒中自带 的 5’ P 和 5’ NP 配对， 以白沙蒿 cDNA 为模板， 进行 5’ 外侧和巢式 PCR 扩增反应， 得到 5’ 末 端核苷酸序列 ； 同样根据测序得到的白沙蒿 HPT 基因核心片段序列分别设计白沙蒿 HPT 基 因特异引物 3’ 端外侧引物 P5 和巢式引物 P6， 分别与 GeneRacerTM 试剂盒中自带的 3’ P和 3’ NP 配对， 以白沙蒿 cDNA 为模板， 进行 3’ 外侧和巢式 PCR 扩增， 得到 3’ 末端核苷酸序列 ； 根据已克隆到的白沙蒿 HPT 5’ 和 3’ 末端核苷酸序列， 设计与该基因编码区两端特异的引 物 P7、 P8， 扩增得到白沙蒿 HPT 基因的全长翻译区核苷酸序列。
     在引物的 5’ 端分别加入 XbaI 和 XhoI 酶切位点序列， 便于后期的基因编码区与植 物表达载体重组。 本发明具体采用的相关引物均由大连宝生物合成 ( 宝生物工程有限公司， 辽宁省 大连市经济技术开发区东北二街 19 号， 邮编 116600)， 序列如下 ：
     上游引物 P1 ：
     5’ -CACACRRTWATWGGMACWGC-3’ -3’ ，
     下游引物 P2 ：
     5’ -YTCWGCRTARAAKAGCTTCC-3’ ；
     P3 为 ： 5’ -TACTGCAAATCCTAACACCAAAAACC-3’
     P4 为 ： 5’ -TCAGAGCAATGAGACCGGATAACGCC-3’ ，
     5’ P为： 5’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’ ，
     5’ NP 为 ： 5’ -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’ ；
     P5 为 ： 5’ -ATGGTACCGGTACACACAGTCTTGGC-3’ ，
     P6 为 ： 5’ -AGGGTACTACCGATTTGTATGGAAGC-3’ ，
     3’ P为： 5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’ ，
     3’ NP 为 ： 5’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’ 。
     P7 ： 5’ -CGTCTAGAATGCTAAACTCAGATGAAAGG-3’
     P8 ： 5’ -CGCTCGAGTCAGATGAAAGGAAAAATG-3’
     其中 ： R ＝ A or G ； Y ＝ C or T ； K ＝ G or T ； W ＝ A or T ； M ＝ A or C。
     本发明所涉及的白沙蒿 HPT 基因可在油料作物的转基因工作中应用， 也可在牧草 等作物的转基因工作中应用， 也可在除油料作物和牧草等作物外的其它植物的转基因工作 中应用， 可在除植物外的其它生物的转基因工作中应用。
     维生素 E 对于人类和动物具有不可忽视的营养价值， 而它同时在植物体中具有 重要生理功能。维生素 E 可提高植物的抗氧化作用， 能通过清除脂质过氧化物所产生的 自由基而稳定生物膜的脂双层， 使细胞免受过氧化物的伤害， 维生素 E 可以独立或协同细 胞中其他抗氧化产物， 参与各种抗氧化作用， 有效地保护细胞， 是一种有效的抗氧化剂，
     参见 ： Brigelius-Floh ER and Traber M G..“Vitamin E ： Function and metabolism” 《The FASEB》 1999， 13 ： 1145-1155.。同时还具有信号传导， 参与光电子循环等作用， 参 见： Munne-Bosch S， “Function and metabolism of tocopherols and tocotrienols in plants” 《The FASEB》 2002， 16 ： 1028-1039。
     由于白沙蒿生长在干旱荒漠地区， 长期经历干旱、 高温、 冻害等逆境胁迫， 使其自 身进化出一定的防御机制， 而提高维生素 E 合成量。其维生素 E 含量提高的作用机制之一 有可能是其 HPT 基因核苷酸编码的氨基酸在催化活性上有特殊性。而我国西北、 华北、 东北 荒漠半荒漠地区的特有植物白沙蒿所具有的抗风沙， 耐旱、 耐寒、 有极强的耐瘠薄性特性， 使白沙蒿 HPT 成为是一种可对植物， 如油料作物， 或者牧草作物， 或其它的植物， 甚至非植 物的其它生物进行基因改造的最佳材料。
     本发明中， 经相关实验表明， 采用白沙蒿的叶片提取其 RNA 较采用白沙蒿的其它 组织提取 RNA 更为方便， 并且本发明提取的 HPT 基因在叶片中表达， 因此在植物抗逆过程中 发挥着更重要的作用。 。 具体实施方式
     以下提供具体实施方式及相关实验数据 ：
     一、 以白沙蒿为材料提取 RNA， 反转录为 cDNA。
     白沙蒿 (Artemisia sphaerocephala) 种子采自内蒙古阿拉善左旗， 播种在营养钵 内， 置于温室， 按常规方法培养， 3 周龄时， 取幼嫩的叶片为材料， 按上海生工 (( 上海生工生 物工程技术服务有限公司， 上海市松江区车墩工业区香闵路 698 号， 邮编 201611)UNIQ-10 柱式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒说明书进行 RNA 提取。按照按宝生物 ( 宝生物工程有限公 司， 辽宁省大连市经济技术开发区东北二街 19 号， 邮编 116600)PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行反转录， 得到 cDNA。
     根据通常的作法， 一般多是采用植物的籽种提取 RNA。但实验表明， 采用白沙蒿的 籽种提取 RNA 非常的困难， 经常无法实现操作， 经反复试验表明， 采用白沙蒿的叶片， 特别 是用 3 周龄的嫩叶提取会有极好的效果。
     二、 核心片段 RT-PCR 扩增
     参照宝生物 Taq 使用说明书进行， 在 200μl 的离心管中加入下列反应液 ：
     振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增反应结束后用 1％的琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测。将目的片段与克隆载 体的连接， 转化至 E.coli DH5α 感受态细胞， 经菌落 PCR 鉴定后选取阳性克隆由上海生工 进行测序， 得到 837bp 核心片段。
     三、 白沙蒿 HPT 基因 5’ 和 3’ 末端的克隆 (5’ -RACE 和 3’ -RACE)
     3.1 白沙蒿总 RNA 反转录前处理 ( 按照 Invitrogen RACE 试剂盒操作指南进行 )
     3.1.1 白沙蒿总 RNA 脱磷酸基团
     脱磷酸基团反应 ：
     (1) 取 1.5ml 离心管置于冰上， 依次加入下列试剂 ：
     (2) 轻轻混匀， 短暂离心收集液体。 (3)50℃温育 1h， 短暂离心后置于冰上。RNA 沉淀反应 ：
     (1) 加入 90μl DEPC 水、 100μl 酚∶氯仿 (25 ∶ 24)， 漩涡震荡 30s。
     (2)20℃下 12000rpm 离心 5min， 吸取上清 ( 约 100μl) 转移至新的离心管中。 -1
     (3) 依次加入 2μl 10mg· ml Mussel Glycogen、 10μl 3mol· L-1NaAc(pH5.2) 和 220μl 95％乙醇， 颠倒混匀， 冰浴 10min。
     (4)4 ℃、 12000rpm 离心 20min， 弃上清， 小心不要弃掉沉淀， 加入 500μl 70 ％乙 醇， 颠倒混匀。
     (5)4℃、 12000rpm 离心 20min， 小心吸去乙醇， 再次离心弃去残留乙醇。
     (6)20℃下干燥沉淀 1-2min， 加入 7μl DEPC 水溶解， 为下步去帽反应备用。
     3.1.2 白沙蒿 mRNA 去除帽子结构
     去帽反应 ：
     (1) 取 1.5ml 离心管置于冰上， 依次加入下列试剂 ：
     (2) 轻轻混匀， 短暂离心收集液体。
     (3)37℃温育 1h， 短暂离心后置于冰上。
     RNA 沉淀反应 ： 方法同 3.1.1。
     3.1.3 去帽后的白沙蒿 mRNA 和 RNA oligo 连接
     连接反应 ：
     (1) 在含有 0.25μg GeneRacerTM RNA Oligo 的离心管中加入 7μl 上述反应液， 轻轻混匀， 短暂离心收集液体。
     (2)65℃温育 5min， 消除 RNA 二级结构。
     (3) 冰浴 2min， 短暂离心。
     (4) 依次加入以下试剂 ：
     (5) 轻轻混匀， 短暂离心。 (6)37℃温育 1h， 短暂离心后置于冰上。 RNA 沉淀反应 ： 方法同 3.1.1。沉淀用 10μl DEPC 水溶解。3.2 第一链 cDNA 的合成 (1) 在上述获得的 10μl ligated RNA 中加入下列试剂 ：
     (2) 轻轻混匀， 短暂离心收集液体。 (3)65℃温育 5min 以除去 RNA 二级结构， 冰浴 1min， 短暂离心收集液体。 (4) 于冰上依次加入下列试剂 ：
     (5) 轻轻混匀， 短暂离心收集液体。 (6)25℃温育 5min， 50℃温育 1h， 70℃温育 5min， 冰浴 2min， 短暂离心收集液体。 -1 (7) 加入 1μl RNase H(2U·μl )， 37℃温育 20min， 短暂离心收集液体。 (8)-20℃保存备用或即可进行 5’ 和 3’ 外侧 PCR 扩增反应。 3.3 白沙蒿 HPT 基因 5’ 末端克隆 外侧 PCR 反应 在 200μl 离心管中加入下列反应液 ：振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增
     巢式 PCR 反应 取 1μl 上述 PCR 产物为模板， 加入下列反应液进行巢式 PCR
     振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增反应结束后用 1.0 ％琼脂糖凝胶电泳， 检测目的条带。回收 PCR 产物并连接至 pGM-T 载体， 转化大肠杆菌 DH5α， 进行蓝白斑筛选以及菌体 PCR， 将阳性克隆送去上海生工 测序。
     3.4 3’ 末端 PCR 扩增
     外侧 PCR 反应
     在 200μl 离心管中加入下列反应液 ：
     振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增
     巢式 PCR 反应 取 1μl 上述 PCR 产物为模板， 加入下列反应液进行巢式 PCR
     振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增反应结束后用 1.0 ％琼脂糖凝胶电泳， 检测目的条带。回收 PCR 产物并连接至 pGM-T 载体， 转化大肠杆菌 DH5α， 进行蓝白斑筛选以及菌体 PCR， 将阳性克隆送去测序。
     经过测序， 5’ 和 3’ RACE 巢式 PCR 扩增产物分别为 446bp 和 300bp， 与前述所得到 的白沙蒿 HPT 基因核心片段都有部分核苷酸重叠， 并且在与 GeneBank 中比对发现扩增出来 的片段与其他植物 HPT 基因 5’ 和 3’ 端具有同源性。因此， 扩增得到的 5’ 和 3’ RACE-PCR 产物分别为同一 cDNA 的 5’ 和 3’ 端。
     四、 PCR 扩增翻译区全长序列
     根据已克隆到的白沙蒿 HPT 基因的 5’ 和 3’ 末端核苷酸序列， 设计与该基因编码 区两端特异的引物 P7、 P8， 扩增得到白沙蒿 HPT 基因的全长翻译区核苷酸序列。在引物的 5’ 端分别加入 XbaI 和 XhoI 酶切位点序列， 便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。
     在 200μl 的离心管中加入下列反应液 ：
     振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增反应结束后用 1％的琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测。
     胶纯化和回收获得的目的基因产物， 连接到 pGM-T Vector， 转化至 E.coliDH5α 感受态细胞， 经菌落 PCR 鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序， 得到 1146bp HPT 全长 基因翻译区序列。
     背景技术 维生素 E， 又被称作生育酚。是一种动物正常繁殖所必须的物质， 能抗不育和防止 早产、 流产， 参见宋晓燕， 杨天奎 “天然维生素 E 的功能及应用” 《中国油脂》 2002， 25(6) ： 45-48。维生素 E 作为饲料添加剂， 可以提高动物的免疫力、 改善肉质、 奶质并提高繁殖能力 和缓解动物应激反应 参见 ： 肖雄 .“维生素 E 的研究与应用” 《畜禽业》 2002， 4： 24-26。维 生素 E 与人体中枢神经系统， 心血管系统有着密切的关系， 现代医学证明 ： 维生素 E 可以防 治冠心病、 高血压、 心肌梗塞、 血栓等疾病参见 ： Ajjawi I.and Shintani D.“Engineered plants with elevated vitamin E ： a nutraceutical success story” 《Trends Biotech》 2004， 22(3) ： 104-107 ； Vertuani S， Angusti A and Manfredini S. “The antioxidants and pro-antioxidants network ： An overview.” 《Cur Pharmaceutical Design》 2004， 10(14) ： 1677-1694。维生素 E 还有美容、 护肤、 防衰老、 抗癌等功效， 参见 ： 雷炳福 “我国天然维生素 E 产业化前景初探” 《中国油脂》 2003， 28(4) ： 49-51。
     维生素 E 存在于植物的不同组织 ： 包括绿色光合组织和种子等。不同植物中维生 素 E 的组成、 含量及总量有着十分大的差异 ( 参见表一 )。尿黑酸叶绿基转移酶 (HPT) 基因 是介导维生素 E 合成的关键酶基因， 控制着生育酚总量的合成。GenBank 中已公布了拟南 芥、 木薯、 玉米、 小麦、 葱、 芫荽等植物的尿黑酸叶绿基转移酶 (HPT) 基因的核苷酸序列和氨 基酸序列。
     表 1 沙蒿油与其他植物油 VE 含量 ( 单位 ： mg/kg)
     维生素 E 存在于植物的不同组织 ： 包括绿色光合组织和种子等。不同植物中维生 素 E 的组成、 含量及总量有着十分大的差异 ( 参见表一 )。尿黑酸叶绿基转移酶 (HPT) 基因 是介导维生素 E 合成的关键酶基因， 控制着生育酚总量的合成。GenBank 中已公布了拟南 芥、 木薯、 玉米、 小麦、 葱、 芫荽等植物的尿黑酸叶绿基转移酶 (HPT) 基因的核苷酸序列和氨 基酸序列。
     表 1 沙蒿油与其他植物油 VE 含量 ( 单位 ： mg/kg)
    【发明内容】
    本发明提供一种取自沙生植物 - 白沙蒿的 HPT 基因， 以及这种基因的制备方法及用途。 白沙蒿 (Artemisia sphaerocephala krasch) 是我国特有的优良超旱生固沙植 物， 是我国沙区畜牧业的重要饲料之一。几乎所有植物油均含有维生素 E， 但含量远不及国 际上公认为植物油含维生素 E 之冠一， 小麦胚芽油。从沙篙籽中提取的沙篙油， 经测试维生 素 E 含量达到 2779.1mg/kg， 高于小麦胚芽油中维生素 E 的含量， 参见 ： 白寿宁， 云秀芳 “沙
     篙油开发利用探讨” 《粮食与油脂》 ， 2000(3) ： 31-33。
     本发明所述的白沙蒿 HPT 基因序列为基因序列表中的 SEQ 1。
     本发明所涉及的白沙蒿 HPT 基因制备方法是 ： 首先提取白沙蒿的 RNA， 再反转录 为 cDNA ； 利用 GenBank 中已公布的其它植物的 HPT 基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同 源性分析， 根据保守区设计合成一对简并引物 P1、 P2 ； 以得到的白沙蒿 cDNA 为模板扩增得 到白沙蒿 HPT 核心片段核苷酸序列 ； 根据测序得到的 HPT 基因核心片段序列分别设计白沙 蒿 HPT 基因特异引物 5’ 端外侧引物 P3 和巢式引物 P4， 分别与 GeneRacerTM 试剂盒中自带 的 5’ P 和 5’ NP 配对， 以白沙蒿 cDNA 为模板， 进行 5’ 外侧和巢式 PCR 扩增反应， 得到 5’ 末 端核苷酸序列 ； 同样根据测序得到的白沙蒿 HPT 基因核心片段序列分别设计白沙蒿 HPT 基 因特异引物 3’ 端外侧引物 P5 和巢式引物 P6， 分别与 GeneRacerTM 试剂盒中自带的 3’ P和 3’ NP 配对， 以白沙蒿 cDNA 为模板， 进行 3’ 外侧和巢式 PCR 扩增， 得到 3’ 末端核苷酸序列 ； 根据已克隆到的白沙蒿 HPT 5’ 和 3’ 末端核苷酸序列， 设计与该基因编码区两端特异的引 物 P7、 P8， 扩增得到白沙蒿 HPT 基因的全长翻译区核苷酸序列。
     在引物的 5’ 端分别加入 XbaI 和 XhoI 酶切位点序列， 便于后期的基因编码区与植 物表达载体重组。 本发明具体采用的相关引物均由大连宝生物合成 ( 宝生物工程有限公司， 辽宁省 大连市经济技术开发区东北二街 19 号， 邮编 116600)， 序列如下 ：
     上游引物 P1 ：
     5’ -CACACRRTWATWGGMACWGC-3’ -3’ ，
     下游引物 P2 ：
     5’ -YTCWGCRTARAAKAGCTTCC-3’ ；
     P3 为 ： 5’ -TACTGCAAATCCTAACACCAAAAACC-3’
     P4 为 ： 5’ -TCAGAGCAATGAGACCGGATAACGCC-3’ ，
     5’ P为： 5’ -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’ ，
     5’ NP 为 ： 5’ -GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’ ；
     P5 为 ： 5’ -ATGGTACCGGTACACACAGTCTTGGC-3’ ，
     P6 为 ： 5’ -AGGGTACTACCGATTTGTATGGAAGC-3’ ，
     3’ P为： 5’ -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’ ，
     3’ NP 为 ： 5’ -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’ 。
     P7 ： 5’ -CGTCTAGAATGCTAAACTCAGATGAAAGG-3’
     P8 ： 5’ -CGCTCGAGTCAGATGAAAGGAAAAATG-3’
     其中 ： R ＝ A or G ； Y ＝ C or T ； K ＝ G or T ； W ＝ A or T ； M ＝ A or C。
     本发明所涉及的白沙蒿 HPT 基因可在油料作物的转基因工作中应用， 也可在牧草 等作物的转基因工作中应用， 也可在除油料作物和牧草等作物外的其它植物的转基因工作 中应用， 可在除植物外的其它生物的转基因工作中应用。
     维生素 E 对于人类和动物具有不可忽视的营养价值， 而它同时在植物体中具有 重要生理功能。维生素 E 可提高植物的抗氧化作用， 能通过清除脂质过氧化物所产生的 自由基而稳定生物膜的脂双层， 使细胞免受过氧化物的伤害， 维生素 E 可以独立或协同细 胞中其他抗氧化产物， 参与各种抗氧化作用， 有效地保护细胞， 是一种有效的抗氧化剂，
     参见 ： Brigelius-Floh ER and Traber M G..“Vitamin E ： Function and metabolism” 《The FASEB》 1999， 13 ： 1145-1155.。同时还具有信号传导， 参与光电子循环等作用， 参 见： Munne-Bosch S， “Function and metabolism of tocopherols and tocotrienols in plants” 《The FASEB》 2002， 16 ： 1028-1039。
     由于白沙蒿生长在干旱荒漠地区， 长期经历干旱、 高温、 冻害等逆境胁迫， 使其自 身进化出一定的防御机制， 而提高维生素 E 合成量。其维生素 E 含量提高的作用机制之一 有可能是其 HPT 基因核苷酸编码的氨基酸在催化活性上有特殊性。而我国西北、 华北、 东北 荒漠半荒漠地区的特有植物白沙蒿所具有的抗风沙， 耐旱、 耐寒、 有极强的耐瘠薄性特性， 使白沙蒿 HPT 成为是一种可对植物， 如油料作物， 或者牧草作物， 或其它的植物， 甚至非植 物的其它生物进行基因改造的最佳材料。
     本发明中， 经相关实验表明， 采用白沙蒿的叶片提取其 RNA 较采用白沙蒿的其它 组织提取 RNA 更为方便， 并且本发明提取的 HPT 基因在叶片中表达， 因此在植物抗逆过程中 发挥着更重要的作用。 。 具体实施方式
     以下提供具体实施方式及相关实验数据 ：
     一、 以白沙蒿为材料提取 RNA， 反转录为 cDNA。
     白沙蒿 (Artemisia sphaerocephala) 种子采自内蒙古阿拉善左旗， 播种在营养钵 内， 置于温室， 按常规方法培养， 3 周龄时， 取幼嫩的叶片为材料， 按上海生工 (( 上海生工生 物工程技术服务有限公司， 上海市松江区车墩工业区香闵路 698 号， 邮编 201611)UNIQ-10 柱式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒说明书进行 RNA 提取。按照按宝生物 ( 宝生物工程有限公 司， 辽宁省大连市经济技术开发区东北二街 19 号， 邮编 116600)PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行反转录， 得到 cDNA。
     根据通常的作法， 一般多是采用植物的籽种提取 RNA。但实验表明， 采用白沙蒿的 籽种提取 RNA 非常的困难， 经常无法实现操作， 经反复试验表明， 采用白沙蒿的叶片， 特别 是用 3 周龄的嫩叶提取会有极好的效果。
     二、 核心片段 RT-PCR 扩增
     参照宝生物 Taq 使用说明书进行， 在 200μl 的离心管中加入下列反应液 ：
    
    振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增反应结束后用 1％的琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测。将目的片段与克隆载 体的连接， 转化至 E.coli DH5α 感受态细胞， 经菌落 PCR 鉴定后选取阳性克隆由上海生工 进行测序， 得到 837bp 核心片段。
     三、 白沙蒿 HPT 基因 5’ 和 3’ 末端的克隆 (5’ -RACE 和 3’ -RACE)
     3.1 白沙蒿总 RNA 反转录前处理 ( 按照 Invitrogen RACE 试剂盒操作指南进行 )
     3.1.1 白沙蒿总 RNA 脱磷酸基团
     脱磷酸基团反应 ：
     (1) 取 1.5ml 离心管置于冰上， 依次加入下列试剂 ：
    
    
    (2) 轻轻混匀， 短暂离心收集液体。 (3)50℃温育 1h， 短暂离心后置于冰上。RNA 沉淀反应 ：
     (1) 加入 90μl DEPC 水、 100μl 酚∶氯仿 (25 ∶ 24)， 漩涡震荡 30s。
     (2)20℃下 12000rpm 离心 5min， 吸取上清 ( 约 100μl) 转移至新的离心管中。 -1
     (3) 依次加入 2μl 10mg· ml Mussel Glycogen、 10μl 3mol· L-1NaAc(pH5.2) 和 220μl 95％乙醇， 颠倒混匀， 冰浴 10min。
     (4)4 ℃、 12000rpm 离心 20min， 弃上清， 小心不要弃掉沉淀， 加入 500μl 70 ％乙 醇， 颠倒混匀。
     (5)4℃、 12000rpm 离心 20min， 小心吸去乙醇， 再次离心弃去残留乙醇。
     (6)20℃下干燥沉淀 1-2min， 加入 7μl DEPC 水溶解， 为下步去帽反应备用。
     3.1.2 白沙蒿 mRNA 去除帽子结构
     去帽反应 ：
     (1) 取 1.5ml 离心管置于冰上， 依次加入下列试剂 ：
    (2) 轻轻混匀， 短暂离心收集液体。
     (3)37℃温育 1h， 短暂离心后置于冰上。
     RNA 沉淀反应 ： 方法同 3.1.1。
     3.1.3 去帽后的白沙蒿 mRNA 和 RNA oligo 连接
     连接反应 ：
     (1) 在含有 0.25μg GeneRacerTM RNA Oligo 的离心管中加入 7μl 上述反应液， 轻轻混匀， 短暂离心收集液体。
     (2)65℃温育 5min， 消除 RNA 二级结构。
     (3) 冰浴 2min， 短暂离心。
     (4) 依次加入以下试剂 ：
    
    
    
    (5) 轻轻混匀， 短暂离心。 (6)37℃温育 1h， 短暂离心后置于冰上。 RNA 沉淀反应 ： 方法同 3.1.1。沉淀用 10μl DEPC 水溶解。3.2 第一链 cDNA 的合成 (1) 在上述获得的 10μl ligated RNA 中加入下列试剂 ：
    
    
    (2) 轻轻混匀， 短暂离心收集液体。 (3)65℃温育 5min 以除去 RNA 二级结构， 冰浴 1min， 短暂离心收集液体。 (4) 于冰上依次加入下列试剂 ：
    
    
    
    
    
    
    
    (5) 轻轻混匀， 短暂离心收集液体。 (6)25℃温育 5min， 50℃温育 1h， 70℃温育 5min， 冰浴 2min， 短暂离心收集液体。 -1 (7) 加入 1μl RNase H(2U·μl )， 37℃温育 20min， 短暂离心收集液体。 (8)-20℃保存备用或即可进行 5’ 和 3’ 外侧 PCR 扩增反应。 3.3 白沙蒿 HPT 基因 5’ 末端克隆 外侧 PCR 反应 在 200μl 离心管中加入下列反应液 ：振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增
    
    
    
    巢式 PCR 反应 取 1μl 上述 PCR 产物为模板， 加入下列反应液进行巢式 PCR
    
    振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增反应结束后用 1.0 ％琼脂糖凝胶电泳， 检测目的条带。回收 PCR 产物并连接至 pGM-T 载体， 转化大肠杆菌 DH5α， 进行蓝白斑筛选以及菌体 PCR， 将阳性克隆送去上海生工 测序。
     3.4 3’ 末端 PCR 扩增
     外侧 PCR 反应
     在 200μl 离心管中加入下列反应液 ：
    
    振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增
    
    
    巢式 PCR 反应 取 1μl 上述 PCR 产物为模板， 加入下列反应液进行巢式 PCR
    
    振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增反应结束后用 1.0 ％琼脂糖凝胶电泳， 检测目的条带。回收 PCR 产物并连接至 pGM-T 载体， 转化大肠杆菌 DH5α， 进行蓝白斑筛选以及菌体 PCR， 将阳性克隆送去测序。
     经过测序， 5’ 和 3’ RACE 巢式 PCR 扩增产物分别为 446bp 和 300bp， 与前述所得到 的白沙蒿 HPT 基因核心片段都有部分核苷酸重叠， 并且在与 GeneBank 中比对发现扩增出来 的片段与其他植物 HPT 基因 5’ 和 3’ 端具有同源性。因此， 扩增得到的 5’ 和 3’ RACE-PCR 产物分别为同一 cDNA 的 5’ 和 3’ 端。
     四、 PCR 扩增翻译区全长序列
     根据已克隆到的白沙蒿 HPT 基因的 5’ 和 3’ 末端核苷酸序列， 设计与该基因编码 区两端特异的引物 P7、 P8， 扩增得到白沙蒿 HPT 基因的全长翻译区核苷酸序列。在引物的 5’ 端分别加入 XbaI 和 XhoI 酶切位点序列， 便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。
    
    
    在 200μl 的离心管中加入下列反应液 ：
    
    振荡离心混匀后， 按以下条件进行 PCR 扩增反应结束后用 1％的琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测。
     胶纯化和回收获得的目的基因产物， 连接到 pGM-T Vector， 转化至 E.coliDH5α 感受态细胞， 经菌落 PCR 鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序， 得到 1146bp HPT 全长 基因翻译区序列。
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