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与 hGM-CSF 结合的单克隆抗体及包含它的药物组合物
    发明领域 本发明涉及结合人粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 ( 也称为 “hGM-CSF” ) 并中和 hGM-CSF 活性的单克隆抗体， 包含一种或多种这类单克隆抗体的组合物和这类单克隆抗体 及组合物的使用方法。
     发明背景
     粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 被鉴定为一种促进骨髓粒细胞和巨噬 细胞祖细胞增殖， 并促进粒细胞和巨噬细胞体外集落形成的体液因子。
     现在知道 GM-CSF 是多种细胞类型的刺激因子。 它诱导粒细胞 - 巨噬细胞谱系血细 胞的分化和增殖， 提升抗原呈递细胞的功能， 维持一些种类上皮细胞的功能并诱导肺泡巨 噬细胞的功能 ( 如， 增强表面活性剂分解代谢， 杀菌功能， 和 Fc 受体表达 )。The Cytokine Handbook， 第 4 版， Thomson， A. 等 ( 编 )， Academic Press， 2003.
     已知 GM-CSF 引起多种疾病， 包括 1) 变应性疾病如哮喘、 特应性和花粉症， 2) 移植 物排斥， 和移植物抗宿主病 (GVHD)， 和 3) 自身免疫性疾病， 如类风湿性关节炎。
     例如， 人 GM-CSF(hGM-CSF) 在变应性患者的肺部中和在类风湿性关节炎患者的 关节中过表达 ； hGM-CSF mRNA 在变应性患者的皮肤过表达。还报道的是， GM-CSF 的产生 增强单核细胞的存活， 而单核细胞是特应性皮炎的炎症诱导细胞。Bratton， D.L. 等 .， Granulocyte macrophage colony-stimulating factor contributes to enhanced monocyte survival in chronic atopic dermatitis.J.Clin.Invest.， 95 ： 211-218， 1995。
     另外， 已经表明 GM-CSF 刺激白血病细胞的增殖， 因此， GM-CSF 被认为是一种引起 白血病的因子。
     获得治疗人 GM-CSF 引起的疾病和状况的方法是有用的。治疗这类疾病和状况的 一种方法是结合 hGM-CSF， 并抑制它的生物活性。例如， 这可以通过施用抗 hGM-CSF 单克隆 抗体来实现， 所述单克隆抗体具有针对 hGM-CSF 的高亲和力和充分中和活性， 但不诱导免 疫学反应。
     然而， 目前报道的 hGM-CSF 抑制抗体都没有针对 hGM-CSF 的充分中和活性。并且， 看来非常可能的是， 现有的抗 hGM-CSF 单克隆抗体会在接受者中引起不希望的免疫应答。 多克隆抗体和单克隆抗体通常衍生自实验动物， 比如小鼠、 家兔和公山羊。然而， 获得的抗 体具有用于产生它们的动物的序列特征。如果将它们施用给人， 人的免疫系统可能视这些 抗体为外来物， 可能引起人抗动物抗体应答 ( 即抗体产生了它自身的抗体 )。
     另外， 长期施药对于治疗这类疾病来说是必要的， 结果可能产生问题， 比如， 可能 由施用药物中少量的杂质引起的安全问题。 从有效性、 安全性和医疗费用的角度考虑， 比现 有抗体中和活性更好的抗体作为治疗剂会很有价值。
     发明概述
     本发明至少部分基于发明人对某些特征为针对 hGM-CSF 的极高中和活性的抗人 GM-CSF 单克隆抗体的开发。 这些抗体的中和活性令人惊讶地高出基于它们对 hGM-CSF 的结 合亲和力所作出的预期。 其中的两个抗 hGM-CSF 单克隆抗体在此被称作 EV1018 和 EV1019。
     一方面， 本发明提供了结合和中和 hGM-CSF 的抗 hGM-CSF 抗体及其片段。
     在 一 个 实 施 方 式 中， 提 供 了 一 个 分 离 的 抗 hGM-CSF 单 克 隆 抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段， 其 中 所 述 抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 识 别 hGM-CSF 中 的 ELYK(SEQ ID NO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)， hGM-CSF 氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。在一个实施方式 中， 所述抗体包含 ：
     (a) 重 链， 其 包 含 含 有 VH-CDR1 的 共 有 序 列， 含 有 VH-CDR2 的 共 有 序 列 和 含 有 VH-CDR3 的共有序列， 其中 ：
     (i) 含有 VH-CDR1 的共有序列是 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， X2 是 G 或 A，
     (ii) 含有 VH-CDR2 的共有序列是 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中 每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， X8 是 R 或 K， 且
     (iii) 含有 VH-CDR3 的共有序列是 EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， X10 是 A 或 G， 和，
     (b) 轻 链， 其 包 含 含 有 VL-CDR1 的 共 有 序 列， 含 有 VL-CDR2 的 共 有 序 列 和 含 有 VL-CDR3 的共有序列， 其中 ： (i) 含有 VL-CDR1 的共有序列是 XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X11 是 H 或 Y，
     (ii) 含有 VL-CDR2 的共有序列是 GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其中 X12 是 R 或 K， X13 是 A 或 P， 且
     (iii) 含有 VL-CDR3 的共有序列是 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其中 X14 是 R 或 S， X15 是 V 或 L ； 并且所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合 hGM-CSF。
     在一个实施方式中， 所述抗体包含 ：
     (a) 包含 VH-CDR1， VH-CDR2 和 VH-CDR3 的重链， 其中 ：
     (i)VH-CDR1 具有选自 SYGMH(SEQ ID NO ： 10) 和 SHAMH(SEQ ID NO 333) 的氨基酸 序列，
     ( i i ) V H- C D R 2 具 有 选 自 L T Y H H G N R K F Y A D S V R G ( S E Q I D N O ： 5) 和 VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO ： 334) 的氨基酸序列， 且
     (iii)VH-CDR3 具有选自 ESMGAINDN(SEQ ID NO ： 6) 和 EWVGGTCDS(SEQ ID NO ： 335) 的氨基酸序列 ； 和
     (b) 包含 VL-CDR1， VL-CDR2 和 VL-CDR3 的轻链， 其中 ：
     (i)VL-CDR1 具有选自 IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO ： 7) 和 SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO ： 330) 的氨基酸序列，
     (ii)VL-CDR2 具有选自 GRSPPS(SEQ ID NO ： 8) 和 GKSPAS(SEQ ID NO ： 331) 的氨基 酸序列， 且
     (iii)VL-CDR3 具有选自 STWDSSLSAVV(SEQ ID NO ： 9) 和 STWDSRLSAVL(SEQ ID NO ： 332) 的氨基酸序列， 并且所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合 hGM-CSF。
     例如， 如上所述的抗体或其抗原结合片段结合人 GM-CSF 的 KD 小于 400pM， 更优选 地， KD 小于 160pM。
     在此描述的抗体或其抗原结合片段中和 hGM-CSF 的活性， 使得如在此描述的 TF-1 增殖分析中， ED80 时测定的抗体或其抗原结合片段 IC50 值小于 100pM( 例如， 小于 30pM， 小 于 20pM)。
     在任一实施方式中， 所述的抗体或其抗原结合片段可包含重链， 所述的重链为伽 玛 1(γ1)， 伽玛 2(γ2)， 伽玛 3(γ3) 或伽玛 4(γ4)。 重链可以选自 SEQ ID NO ： 10-33， 38-80， 以及 160-183 和 222-245。
     在任一实施方式中， 所述的抗体或其抗原结合片段可包含轻链， 所述的轻链为 λ 轻链。 在一些实施方式中， λ 轻链与野生型序列相比， 可以含有 R100G 或 A153G 中一个或者 两个氨基酸取代。 在一个实施方式中， 轻链可以选自 SEQ ID NO ： 34-37 和 202-221。 轻链可 以是 λ 轻链或 κ 轻链。在一些实施方式中， 重链是伽玛 1(γ1)， 伽玛 2(γ2)， 伽玛 3(γ3) 或伽玛 4(γ4)， 轻链是 λ 轻链。在任一实施方式中， 重链与野生型序列相比， 可以含有下述 氨基酸取代中的一个或更多个 ： Q3E， T97A， T97V， N95D， N95E， N95K， N95Q， N93Q/N95T， K144R， L164A， 和 L165A。在一些实施方式中， 所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链， 所述重 链含有选自下述组成的组的一个或更多个氨基酸取代 ： Q3E， T97A， T97V， N95D， N95E， N95K， N95Q， N93Q/N95T， K144R， L164A， 和 L165A， 所述轻链含有下述氨基酸取代中的一个或两个 ： R100G 和 A153G。 在此描述的抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列 SYGMH(SEQ ID NO ： 4) 或 SHAMH(SEQ ID NO ： 333) 的 VH-CDR1。 在此描述的抗体或其抗原结合片段可以包含具有 氨基酸序列 LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO ： 5) 或 VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO ： 334) 的 VH-CDR2。在此描述的抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列 ESMGAINDN(SEQ ID NO ： 6) 或 EWVGGTCDS(SEQ ID NO ： 335) 的 VH-CDR3。在此描述的抗体或其抗原结合片段可以 包含具有氨基酸序列 IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO ： 7) 或 SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO ： 330) 的 VL-CDR1。 在此描述的抗体或其抗原结合片段可以包含具有氨基酸序列 GRSPPS(SEQ ID NO ： 8) 或 GKSPAS(SEQ ID NO ： 331) 的 VL-CDR2。在此描述的抗体或其抗原结合片段可以包含具 有氨基酸序列 STWDSSLSAVV(SEQ ID NO ： 9) 或 STWDSRLSAVL(SEQ ID NO ： 332) 的 VL-CDR3。
     在一些实施方式中， 所述特异性结合 hGM-CSF 的抗体或其抗原结合片段包含 6 个 不同的 CDR， 其序列如 SEQ ID NO ： 4-9 所示。
     在一些实施方式中， 所述特异性结合 hGM-CSF 的抗体或其抗原结合片段包含 6 个 不同的 CDR， 其序列如 SEQ ID NO ： 330-335 所示。
     在此提供的任一实施方式中， 抗体可以包括重链， 其是伽玛 1(γ1)， 伽玛 2(γ2)， 伽玛 3(γ3) 或伽玛 4(γ4)， 和轻链， 其是 κ 或 λ。
     在一些实施方式中， 在此描述的抗体或其抗原结合片段可以进一步包含信号序 列， 例如 SEQ ID NO ： 324， 325 和 326 所示的信号序列。
     涉及野生型和野生型的变体的实施方式也包括在本发明中。在一些实施方式中， 抗体或其片段包含重链， 重链为 SEQ ID NO ： 10 或选自 SEQ ID NO ： 11-33， 38-80 的其变体， 还包含轻链， 轻链为 SEQ ID NO ： 34 或选自 SEQ ID NO ： 35-37 的其变体。在一些实施方式 中， 重链是 SEQ ID NO ： 160 或选自 SEQ ID NO ： 161-245 的其变体， 轻链是 SEQ ID NO ： 202 或 选自 SEQ ID NO ： 203-221 的其变体。
     在一些实施方式中， 所述的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区， 其中重链可
     变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 152， 或选自由 SEQ ID NO ： 153-158 和 159 组成的组的其变 体， 和轻链可变区， 其中轻链可变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 184， 或选自由 SEQ ID NO ： 185-200 和 201 组成的组的其变体。
     在一个实施方式中， 重链可变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 152。在一个实施方 式中， 轻链可变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 184。在一个实施方式中， 重链可变区的氨基 酸序列是 SEQ ID NO ： 152， 并且其中轻链可变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 184。 在一个实 施方式中， 抗体属于 IgG1(λ) 类 ( 亚类 )。
     在一些实施方式中， 所述的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区， 其中重链可 变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 348， 或选自由 SEQ ID NO ： 349-362 和 363 组成的组的其 变体， 和轻链可变区， 其中轻链可变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 364 或 SEQ ID NO ： 365。
     在一个实施方式中， 重链可变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 348。在一个实施方 式中， 轻链可变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 364。在一个实施方式中， 轻链可变区的氨基 酸序列是 SEQ ID NO ： 365。在一个实施方式中， 抗体属于 IgG1(λ) 类 ( 亚类 )。
     在一个实施方式中， 在此公开的能够结合 hGM-CSF(hGM-CSF) 并中和 hGM-CSF 生物 活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 特征在于 ： 它具有由选自由 SEQ ID NO ： 4-9 和 SEQ ID NO ： 330-335 组成的组的一个或更多个氨基酸序列所示的互补决定区 (CDR)。 在一些实施方式中， CDR 中的一个或更多个氨基酸可以被取代、 缺失、 插入或增加。在此描 述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分可以特征在于， 当 TF-1 细胞被 hGM-CSF 诱导 增殖时， 在浓度约 14pM 下， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分抑制 TF-1 细胞增殖达 约 50％。在一些实施方式中， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分抑制外周血树突状 细胞的增殖。
     在一个实施方式中， 在此描述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分对 hGM-CSF 具有高的亲和力， KD 值为 4×10-10M 或更低。
     在一些实施方式中， 在此描述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分属于 IgG1(λ) 类 ( 亚类 )。在一些实施方式中， 本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体是人单克隆抗 体。
     本发明进一步包括核酸及包含所述核酸的载体。在一个实施方式中， 本发明是编 码在此公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。在一个实施方式 中， 所述核酸是 DNA。在一个实施方式中， 本发明是载体， 所述载体包含编码在此公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段的 DNA。
     本发明进一步提供了包含表达载体的宿主细胞， 所述载体包含本发明的 DNA 载 体。
     本发明还涵盖试剂盒， 其包含 ： (a) 本发明的抗体或其抗原结合片段 ； 和 (b) 含有 抗体或其抗原结合片段的一个或更多个容器。
     在一个实施方式中， 本发明是依照本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合 片段， 其用于药物中。
     本发明提供了包含结合并中和 hGM-CSF 的抗 hGM-CSF 抗体或其片段的组合物。这 类组合物可以是药物组合物 ( 如药剂 )， 其包含抗 hGM-CSF 抗体和 / 或其片段 ( 或其组合 ) 和药学上可接受的载体。上述任一实施方式中的抗体或其抗原结合片段被包含在其中。在进一步实施方式中， 组合物包含了超过一种的抗 GM-CSF 抗体、 片段或其组合， 每一种是在此提供的。例如， 所述组合物可以进一步包含第二种分离的结合 hGM-CSF 的抗 体或其抗原结合片段， 使得所述组合物包含超过一种 / 型的抗体、 其抗原结合片段或其组 合， 每一种均结合 GM-CSF。在一些实施方式中， 上述多种结合 hGM-CSF 的抗体、 其抗原结合 片段或其组合中的至少一个是选自由 SEQ ID NO ： 10-80， 152-245， 320-323 和 348-365 组成 的组的多肽。
     本发明也涉及适用于治疗 hGM-CSF 引起的疾病的药物组合物， 其包含根据在此 的任一实施方式的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或抗原结合部分， 以及药学上可接受的载体。 由 hGM-CSF 过 量 产 生 引 起 的 疾 病 的 例 子 包 括 ： (a) 变 应 性 疾 病 (allergic diseases)， 如 哮 喘 (asthma)， 特 应 性 (atopy) 和 花 粉 症 (pollinosis)( 变 应 性 鼻 炎 (allergic rhinitis)， 枯草热 (hay fever)) ； (b) 移植物排斥 (graft rejection)， 移植物抗宿主病 (graft-versus-host disease)(GVHD) ； 和 (c) 自身免疫性疾病 (autoimmune diseases) 如 类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis)。
     这样的组合物或兽药组合物可以包含特异于同一特定抗原的多种抗 hGM-CSF 单 克隆抗体或它们的抗原结合部分， 以及药学上可接受的载体。
     在一些实施方式中， 药用组合物或兽药组合物的特征在于， 多种抗 hGM-CSF 单克 隆抗体或它们的抗原结合部分包含两型 (type) 或更多型的抗体或它们的抗原结合部分， 可以选自下述的 (a) 和 (b) ：
     (a) 具有由 SEQ ID NO ： 4-9， SEQ ID NO ： 330-335， SEQ ID NO ： 336-341， 或 SEQ ID NO ： 342-347 的氨基酸序列表示的 CDR， 特异于 hGM-CSF 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原 结合部分 ；
     (b)(a) 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其氨基酸序列中有一个或更 多个氨基酸被取代、 缺失、 插入或添加， 且特异于 hGM-CSF。
     当 hGM-CSF 诱导 TF-1 细胞增殖时， 在各自约 55pM 的浓度下， 这样的药用组合物或 兽药组合物可抑制 TF-1 细胞增殖达 80％或更多。
     本发明的方面还涵盖试剂盒， 其包含在此涵盖的任一组合物和一个或更多个容 器。在一些实施方式中， 试剂盒进一步包含说明书。在一些实施方式中， 试剂盒进一步包含 标签、 说明书或者标签和说明书二者。
     还提供了在此描述的抗体或其抗原结合片段， 或者包含这样的抗体或其片段的组 合物的用途。在此描述的任何抗 hGM-CSF 抗体或其抗原结合片段或组合物可用于生产或制 备药物， 用于治疗受试者中与 hGM-CSF 过表达相关的疾病或病症， 其中所述抗体或其抗原 结合片段结合 hGM-CSF 并能够中和 hGM-CSF 活性。在一些实施方式中， 疾病或病症选自由 慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease)(COPD)、 哮喘 (asthma)、 囊 性 纤 维 化 病 (cystic fibrosis)、 间 质 性 肺 病 (interstitial lung disease)、 鼻炎 (rhinitis)、 关节炎 (arthritis) 及相关关节病 (arthropathies)、 银屑病 (psoriasis)、 髓 系白血病 (myeloid leukemia， )、 多发性硬化 (multiple sclerosis) 组成的组。
     对于所描述的用途， 抗体或抗原结合片段以不超过最大耐受剂量施用给受试者， 其中， 最大耐受剂量为每剂约 500mg。
     本发明的一个方面包括任一实施方式描述的抗体或其抗原结合片段或组合物在治疗受试者中与 hGM-CSF 过表达相关的疾病或病症中的用途， 其中所述抗体或其抗原结 合片段结合 hGM-CSF 并能够中和 hGM-CSF 活性。例如， 疾病或病症可以是慢性阻塞性肺疾 病 (COPD)、 哮喘、 囊性纤维化病、 间质性肺病、 鼻炎、 关节炎及相关关节病、 银屑病、 髓系白血 病或多发性硬化。所述的用途包括给患者施用不超过最大耐受剂量本发明描述的抗体或 其抗原结合片段或包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物， 其中最大耐受剂量为每剂约 500mg。
     本发明还提供了用抗 hGM-CSF 抗体或其片段治疗患有 hGM-CSF 异常表达相关疾病 或病症的受试者的方法。所述方法包括向被诊断患有或存在风险患有 hGM-CSF 异常表达 ( 如， 过表达 ) 相关疾病或病症的受试者以有效获得受试者中至少一种治疗效果的量施用 包含体内中和 hGS-CSF 活性的抗 hGM-CSF 抗体或其抗原结合片段的组合物。
     本发明还包括增强抗 hGM-CSF 抗体介导的 hGM-CSF 中和活性的方法， 其特征在于 多种特异于同一特定抗原的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分同时被施用。在一些 实施方式， 两种或更多种的抗体或其抗原结合部分选自下面的 (a) 和 (b) ：
     (a) 具有 SEQ ID NO ： 4-9， SEQ ID NO ： 330-335， SEQ ID NO ： 336-341， 或 SEQ ID NO ： 342-347 的氨基酸序列所示的 CDR， 特异于 hGM-CSF 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原 结合部分 ； 和 (b)(a) 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其中一个或更多个氨基酸被 取代、 缺失、 插入或添加， 且特异于 hGM-CSF。
     本发明还包括增强活性的方法， 其特征在于， 当 hGM-CSF 诱导 TF-1 细胞增殖时， 在 各自约 55pM 的浓度下， 两种或更多种的抗体或其抗原结合部分抑制 TF-1 细胞增殖达 80％ 或以上。
     本发明还提供了被在此描述的抗体或其抗原结合片段识别的 hGM-CSF 表位。多肽 中 hGM-CSF 的表位在 SEQ ID NO ： 2 和 3 中列出， 其中该本文被根据本发明公开内容的抗体 或其抗原结合片段识别， 且其中所述多肽序列代表 hGM-CSF( 基于 SEQ ID NO ： 1) 的不连续 的区段。所述表位是人 GM-CSF 的不连续的区段， 其中所述表位包含人 GM-CSF(SEQ ID NO ： 1) 的 77-80 位氨基酸残基和人 GM-CSF(SEQ ID NO ： 1) 的 95-104 位氨基酸残基的全部或一 部分， 且所述表位被包含如 SEQ ID NO ： 4-9 或 SEQ ID NO ： 330-335 所示的 6 个不同 CDR 的 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段识别。
     本发明还提供了本发明的表位的用途。 本发明还包括特异性结合在此描述的表位 的分子的筛选和 / 或鉴定方法， 所述表位被在此提供的抗体或其抗原结合片段识别。一些 实施方式涉及结合在此描述的表位的分子的鉴定方法， 包括 ： (i) 使用包含表位的探针筛 选生物样品或肽库 ； (ii) 分离特异性结合探针的分子 ； 及 (iii) 鉴定所述分子。结合所述 表位的分子可以是， 例如， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段。一些实施方式涵盖进 一步包含可检测的标记的探针。在一些实施方式中， 所述方法包括被固定的探针。
     本发明还提供了生产抗 hGM-CSF 抗体或其抗原结合片段的方法或过程。本发明包 括在宿主细胞中生产结合 hGM-CSF 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段的方法， 其 中所述抗体或其抗原结合片段至少包含含有 VH-CDR1 的共有序列， 含有 VH-CDR2 的共有序 列， 含有 VH-CDR3 的共有序列， 含有 VL-CDR1 的共有序列， 含有 VL-CDR2 的共有序列， 和含有 VL-CDR3 的共有序列。所述方法包含步骤 ：
     (i) 获得包含至少一个 DNA 序列的宿主细胞， 所述序列至少编码含有 VH-CDR1 的共 有序列， 含有 VH-CDR2 的共有序列， 含有 VH-CDR3 的共有序列， 含有 VL-CDR1 的共有序列， 含 有 VL-CDR2 的共有序列， 和含有 VL-CDR3 的共有序列， 其中 ：
     (a) 含有 VH-CDR1 的共有序列是 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A，
     (b) 含有 VH-CDR2 的共有序列是 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中 每个 Xn 互相独立地是任何天然存在的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K，
     (c) 含有 VH-CDR3 的共有序列是 EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 互 相独立地是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G，
     (d) 含有 VL-CDR1 的共有序列是 XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 互相独立地是任何天然存在的氨基酸， 且 X11 是 H 或 Y，
     (e) 含有 VL-CDR2 的共有序列是 GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P， 且
     (f) 含有 VL-CDR3 的共有序列是 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其中 X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L ； (ii) 在宿主细胞中表达所述 DNA ； 和
     (iii) 在适合 DNA 表达并和抗体或其抗原结合片段生成的条件下培养宿主细胞。
     在一些实施方式中， 至少一个 DNA 编码重链或其部分和轻链或其部分， 其中所述 的重链或其部分选自由 SEQ ID NO ： 10-33， 38-80， 152-183， 222-245， 348-362 和 363 组成的 组， 且其中所述的轻链或其部分具有选自由 SEQ ID NO ： 34-37， 184-221， 364 和 365 组成的 组的序列。
     上述过程可以进一步包括分离抗体或其抗原结合片段。
     上述过程可以进一步包括制备组合物， 所述组合物包含所述抗体或其抗原结合片 段和药学上可接受的载体。
     还提供了载体， 所述载体包含编码在此描述的抗体或其抗原结合片段的至少部分 的 DNA。还提供了表达这样的载体的宿主细胞。
     在一些实施方式中， 载体包含编码 VH-CDR1， VH-CDR2 和 VH-CDR3 的 DNA， 其中 ：
     VH-CDR1 是 SYGMH(SEQ ID NO ： 4) 或 SHAMH(SEQ ID NO ： 333)，
     VH-CDR2 是 LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO ： 5) 或 VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO ： 334)， 且
     VH-CDR3 是 ESMGAINDN(SEQ ID NO ： 6) 或 EWVGGTCDS(SEQ ID NO ： 335)。
     在一些实施方式中， 载体包含编码 VL-CDR1， VL-CDR2 和 VL-CDR3 的 DNA， 其中 ：
     VL-CDR1 是 IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO ： 7) 或 SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO ： 330)，
     VL-CDR2 是 GRSPPSG(SEQ ID NO ： 8) 或 GKSPASG(SEQ ID NO ： 331)， 且
     VL-CDR3 是 STWDSSLSAVV(SEQ ID NO ： 9) 或 STWDSRLSAVL(SEQ ID NO ： 332)。
     在本发明的一些实施方式中， 分离的 DNA 编码能够结合 hGM-CSF 并中和 hGM-CSF 生物活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其特征在于分离的 DNA 编码包含选 自由 SEQ ID NO ： 4 至 9 组成的组的至少一个的氨基酸序列。 在一些实施方式中， 分离的 DNA
     编码能够结合 hGM-CSF 并中和 hGM-CSF 生物活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部 分， 其特征在于分离的 DNA 编码包含选自由 SEQ ID NO ： 330 至 335 组成的组的至少一个的 氨基酸序列。分离的 DNA 可以在严紧条件下能够与上述的 DNA 杂交。包含任何这样的 DNA 的载体， 和表达重组表达载体的宿主细胞也包括在本发明的方面中。
     附图的简要说明
     图 1 显示了分离抗体产生细胞克隆的流程图。
     图 2 显示了抗 GM-CSF 单克隆抗体的亲和力分析方案。
     图 3 显示了在 GM-CSF 存在条件下， 抗 GM-CSF 单克隆抗体对外周血树突状细胞增 殖抑制效果的评价。
     图 4 显示了在酵母 hGM-CSF(Leukine) 存在条件下， 抗 GM-CSF 单克隆抗体对 TF-1 细胞增殖抑制效果的评价。
     图 5 显示了在大肠杆菌 hGM-CSF(Peprotech) 存在条件下， 抗 GM-CSF 单克隆抗体 对 TF-1 细胞增殖抑制效果的评价。
     图 6 显示了在酵母 hGM-CSF(Leukine) 存在条件下， 组合使用两种抗 GM-CSF 单克 隆抗体对 TF-1 细胞增殖抑制效果的评价。
     图 7 显示了在大肠杆菌 hGM-CSF(Peprotech) 存在条件下， 组合使用两种抗 GM-CSF 单克隆抗体对 TF-1 细胞增殖抑制效果的评价。
     图 8 是表示人 GM-CSF(8A) 和恒河猴 GM-CSF(8B) 的剂量依赖性抑制的两个图。
     图 9A 是从来自暴露于香烟烟雾的小鼠的支气管肺泡灌洗液 (BALF) 团粒测得的髓 过氧化物酶 (MPO) 活性条形图。-CS ： 用媒介处理的小鼠 ( 在第 1 天和第 3 天腹膜内 300μl 媒介 )， 未暴露于香烟烟雾。 +CS， 同种型抗体 ： 在第 1 天和第 3 天腹膜内用 300μl 同种型抗 体处理， 暴露于香烟烟雾的小鼠。+CS， 抗 GM-CSF 抗体 ： 在第 1 天和第 3 天腹膜内用 300μl * *** 抗 GM-CSF 抗体处理， 暴露于香烟烟雾的小鼠。n ＝ 10 只每组， 均值 ±SEM， p ＜ 0.05， p ＜ 0.001。
     图 9B 是两幅表示 BALF 上清液中测定的细胞因子的条形图。 左侧 ： MCP-1 水平的测 定。 右侧 ： MIP-1α 水平的测定。 -CS ： 用媒介处理的小鼠 ( 在第 1 天和第 3 天腹膜内 300μl 媒介 )， 未暴露于香烟烟雾。 +CS， 同种型抗体 ： 在第 1 天和第 3 天腹膜内用 300μl 同种型抗 体处理， 暴露于香烟烟雾的小鼠。+CS， 抗 GM-CSF 抗体 ： 在第 1 天和第 3 天腹膜内用 300μl * *** 抗 GM-CSF 抗体处理， 暴露于香烟烟雾的小鼠。n ＝ 10 只每组， 均值 ±SEM， p ＜ 0.05， p ＜ 0.001。
     发明详述
     如在此描述的， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体是自抗体产生细胞获得的， 所述的抗体产 生细胞衍生自特发性肺泡蛋白沉积症患者的血液。 在一个实施方式中， 本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分是自衍生自特发性肺泡蛋白沉积症患者血液的抗体产生细 胞获得的。因而， 在本发明的一个实施方式中， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段是 完全人的单克隆抗体。因此， 当抗体制品施用给人体时， 将触发免疫原性的风险降至最低。
     本发明要解决的问题如下 ： 本发明旨在提供展现提高的针对 hGM-CSF 的中和能力 或活性的 GM-CSF 结合单克隆抗体及其 GM-CSF 结合片段， 和包括至少一种或型这样的抗体 或其片段的组合物， 以及与 hGM-CSF 过表达 ( 在患有状况、 疾病或病症的个体中， hGM-CSF 水平高于不患有所述状况、 疾病或病症的个体中的 ) 相关的状况或疾病的治疗方法。
     本发明公开内容中描述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段特异地结合 hGM-CSF， 并降低或消除 ( 中和 ) 其生物活性， hGM-CSF 的异常表达能引起各种疾病。抗 hGM-CSF 单克隆抗体展现了 ( 针对 hGM-CSF 的 ) 中和活性， 其高于以前存在的抗 hGM-CSF 单 克隆抗体。特别是， 本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体是人单克隆抗体， 不具有免疫原性， 不 诱导免疫反应。
     所谓 “特异结合” 是指抗体高亲合力 (avidity) 和 / 或高亲和力 (affinity) 结合 特定的多肽， 例如， 蛋白如人 GM-CSF 蛋白的表位。抗体对这种特定多肽上的表位的结合优 选地强于所述抗体对任何其他表位的结合， 尤其是那些可能存在于与同一样品相关的或在 同一样品中的分子中， 因为例如， 感兴趣的多肽更强地结合蛋白如 GM-CSF 上的表位片段， 以至于通过调节结合条件， 抗体几乎专门结合目标蛋白上的表位位点或片段， 如通过处理 GM-CSF 而暴露的表位片段， 且所述表位片段在同一亚家族的相关因子上不暴露。本发明的 分离的抗体优选地与特定的物种是免疫反应性的并对特定物种具有免疫特异性。比如， 本 发明的抗体识别人 GM-CSF， 可以识别恒河猴 GM-CSF 和 / 或狨猴 GM-CSF， 但一般不识别鼠对 应物。 应该理解本发明这个方面公开的抗体及其抗原结合片段识别天然构象的或充分接近 天然构象的抗原上的表位， 在结构研究中观察到抗原的不连续片段聚集在一起， 在完整抗 原 ( 如， hGM-CSF) 的背景内极其接近， 从而协作形成被本发明的抗体识别的表位 ( 例如， 抗 原表面上的″口袋″ )。因此， 本发明这个方面所述的抗体或其抗原结合片段不与包含形 成上述表位的两个多肽序列、 不是 GM-CSF 的蛋白交叉反应。应该理解， 在抗体 - 抗原结合 的上下文中， 结合被认为是 “特异的” ， 其由相互作用性质决定的。因此， “结合 GM-CSF 的抗 体” 应解释为特异性结合抗原 ( 即 GM-CSF)。
     此处使用的术语 “抗体” 表示 4 条多肽链， 2 个重链和 2 个轻链通过二硫键互相连 接的免疫球蛋白分子。单克隆抗体可以通过单克隆或重组技术产生。所述技术在本领域是 熟悉的。术语″抗原结合部分″和″抗原结合片段″可互换使用， 描述抗体的任何缩短的 变体， 其优选地展现与抗原 ( 如 hGM-CSF) 的特异的抗原结合活性。特别地， 本发明的片段 是指与相应的单克隆抗体在相同的表位结合 hGM-CSF 的片段。片段可以是， 比如说， 展现上 述特点的 Fab 片段或任何其他片段。此外， 抗体片段还包括单链抗体 (scFV)， 双特异性抗 体， 和多特异性抗体， 单链抗体中掺入了抗体可变区和互补决定区 (CDR)。
     此处使用的 “生物活性” 是生物学活性的同义词。因此， “hGM-CSF 生物活性” 是 如本文所述的体内或基于细胞的分析确定或测定的 hGM-CSF 的生物学功能。更具体地说， hGM-CSF 的生物活性， 可以从细胞增殖分析中测得。使用了已知的对 hGM-CSF 作出反应的 细胞系。典型地， 对于人细胞系统， 将人红白血病细胞系 TF-1 用于进行增殖分析。TF-1 是 从红白血病病人建立的细胞系。所述分析在本领域已较好地确立， 其基于对 GM-CSF 刺激的 TF-1 细胞的细胞增殖的抑制作用。 其他细胞系也可能适用。 本领域的普通技术人员能够选 择合适的分析体系或条件。
     TF-1 细胞增殖分析在不同浓度的野生型重组人 GM-CSF( 称作 rhGM-CSF) 存在下 进行。根据这些数据， 可以得到剂量 - 依赖性曲线。在 TF-1 细胞增殖中， 引起 80％最大生 物学应答所需的 GM-CSF 浓度在本文中被定义为 ED80 或 ED80。因此， ED80 代表最大应答的 “80％时的有效剂量” 。 类似地， 在生物分析中， 引起一半最大应答所需的 GM-CSF 浓度表示为ED50 或 ED50。 典型地， 利用人 GM-CSF 依赖的 TF-1 细胞系， 在细胞增殖分析中测得的 GM-CSF ED50 值为 0.02-1ng/ml。
     所述分析体系或其他任何类似的分析体系可以用来鉴别或测定 hGM-CSF 抑制剂 或拮抗剂的活性。例如， 增殖分析体系可以被用来测定抗 hGM-CSF 抗体的中和能力。其他 测定 GM-CSF 生物功能的分析例子包括 IL-8 分泌分析与诱导表面 CD11b/Macl 分析。
     术语 “中和作用” ， “中和” ， “中和的” 和类似词语， 指对生物活性因子如 hGM-CSF 的 生物活性的抑制作用。因此， 具有中和能力或中和活性的抗 hGM-CSF 抗体是指抗体在生物 系统中能够与 hGM-CSF 结合并拮抗或抵消 hGM-CSF 的生物活性， 比如 hGM-CSF 在生物系统 中如 TF-1 细胞中的增殖作用， 从而实质性抑制或消除 hGM-CSF 的生物学活性。
     术语例如 “抑制作用” ， “抑制” ， “能抑制” 和 “抑制” 意指抑制目标抗原引起的生物 活性的 5％至 100％， 但不受它的来源限制。理想情况下， 用于治疗目的， 对 hGM-CSF 生物活 性的抑制作用应在 50％到 100％之间。
     一般来说， IC50 是化合物抑制生物学或生物化学功能的有效性的一个度量。 这个定 量的度量表明特定的药物或其他制剂 ( 抑制剂 ) 抑制指定的生物过程 ( 或过程中的成分， 如酶、 细胞、 细胞受体或微生物 ) 的一半所需的量。换言之， 它是物质最大抑制浓度 (IC) 的 一半 (50％ )(50％ IC， 或 IC50)。它通常在药理研究中用来作为拮抗药物效力的度量。根据 美国食品和药物管理局采用的准则， IC50 代表了体外 50％抑制所需的药物浓度。
     因此， 针对 hGM-CSF 的中和抗体的 IC50 可以通过构建剂量 - 反应曲线并检测不同 浓度的中和抗体对 hGM-CSF 增殖活性的抵消作用来测定。对于给定的拮抗剂， IC50 值可以 通过测定抑制激动剂最大生物反应的一半所需要的浓度计算出。
     根据不同的实施方式， 每个情况下如在 ED80 的 TF-1 的增殖分析中测定的， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段具有小于 20pM， 小于 25pM， 小于 30pM， 小于 40pM， 小 于 50pM， 小于 60pM， 小于 70pM， 小于 80pM， 小于 90pM 或小于 100pM。 在特定的实施方式中， 如 在 ED80 的 TF-1 的增殖分析中测定的， 该抗体或其抗原结合片段具有小于 20pM， 小于 25pM， 小于 30pM 或小于 40pM 的 IC50 值。
     本发明公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体包括包含 2 条重链和 2 条轻链的免疫球蛋白 分子。 每条重链包含重链可变区 ( 简称″ HCVR″或″ VH″ ) 和重链恒定区 ( 重链恒定区有 3 个结构域， 简称″ CH1″、 ″ CH2″和″ CH3″ )。每条轻链包含轻链可变区 ( 简称″ LCVR″ 或″ VL″ ) 和轻链恒定区 ( 轻链恒定区有 1 个结构域， 简称″ CL″ )。HCVR 和 LCVR 对于抗 体的结合特异性特别重要。
     可变区的氨基酸序列负责抗体与抗原之间大部分的相互作用。因此， 当构建的表 达载体在来自具有不同性质的其他抗体的框架序列中具有来自天然抗体的可变区序列时， 产生的载体能够表达模拟天然抗体性质的重组抗体。因此， 当生产与原抗体具有类似结合 特性的完整重组抗体时， 没有必要获得特定抗体的全部序列。涵盖可变区的重链和轻链部 分序列有时足以实现所述目的。
     抗体与目标抗原的相互作用主要是通过 LCVR 和 HCVR 的氨基酸残基。因此， 可变 区氨基酸序列在不同抗体间的变化远多于可变区外的。HCVR 和 LCVR 进一步细分为相对稳 定的 “框架区 (FR)” 和超变的 “互补决定区 (CDR)” 。每个 HCVR 和 LCVR 各由 3 个 CDR 和 4 个 FR 组成。从氨基端到羧基端， 它们的顺序是 FR1， CDR1， FR2， CDR2， FR3， CDR3 和 FR4。与抗体每个结构域包括超变区， 如 CDR 相对应的氨基酸残基的确定或预测方法是 本领域熟知的。常用的方法包括 Chothia， AbM 和 Kabat。
     一般来说， 抗体与抗原结合的亲和力至少约 1×10-7M， 并且抗体结合某些抗原的亲 和力至少是相比其对非特异抗原 ( 如 BSA 和酪蛋白 ) 的亲和力的两倍。
     对于某一 IgG 抗体， 术语″高亲和力″是指抗体的结合亲和力为至少约 1×10-7M， 优选至少约 1×10-8M， 更优选至少 1×10-9M， 特别优选至少 1×10-10M。
     ″高亲和力″的定义在抗体的同种型间是不同的。例如， IgM 同种型具有至少 -7 1×10 M 的结合亲和力即定义为高亲和力。
     本发明的抗体
     正如本文所述， 本发明涉及抗人 GM-CSF( 抗 hGM-CSF) 单克隆抗体及其片段， 其中 和 hGM-CSF 的能力超过针对 hGM-CSFB 的现有的单克隆抗体 ( 超过目前可利用的单克隆抗 体 )。 可以使用或施用在此描述的所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其片段的一型 (type) 或种 (kind)。
     作为选择， 超过一型 (type) 或种 (kind) 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体可以一起使用 或施用。发明人发现， 当超过一型或种的抗 GM-CSF 单克隆抗体一起使用时， 它们提供更高 的中和活性 ( 例如， 更高的细胞生长抑制活性 )。此外， 一或更多型或种的抗 hGM-CSF 单克 隆抗体或其片段可以与一种或更多种其他的非抗体治疗剂， 如小分子， RNAi 或肽联合使用 或施用。
     一方面， 提供了识别并特异结合 hGM-CSF 的分离的单克隆抗体及其抗原结合片 段。此处所述的是与 hGM-CSF 结合， 且展现对 hGM-CSF 生物活性的中和能力或中和活性的 分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体及其抗原结合片段 ( 与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆 抗体及其与 hGM-CSF 结合的抗原结合片段 )。在一个实施方式中是分离的抗 hGM-CSF 单克 隆抗体及其抗原结合片段， 其与 hGM-CSF 结合并展现针对 hGM-CSF 的中和能力或活性， 其 中所述单克隆抗体及其抗原结合片段识别 ： hGM-CSF(SEQ ID NO ： 1) 中的 ELYK(SEQ IDNO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)。与 hGM-CSF 结合的分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体及其抗 原结合片段， 其中所述单克隆抗体及其抗原结合片段识别 hGM-CSF 中的 ELYK(SEQ ID NO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)， 展现对 hGM-CSF 活性的中和能力或活性且对治疗和预防 hGM-CSF 过表达相关的疾病、 状况或病症是有用的。一个特定的实施方式是与 hGM-CSF 结 合的分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或抗原结合片段识别 hGM-CSF 中的下列不连续的表位， 如所定义的 (SEQ ID NO ： 1)， 相应于氨基酸 ： hGM-CSF 的 77-80 位 ELYK(SEQ ID NO ： 2) 和 hGM-CSF 的 95-104 位 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)。此处 所述的分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体及其抗原结合片段特异地结合 hGM-CSF。他们不与 GM-CSF 以外的蛋白交叉反应。
     更特异地， 在此描述的是特异地结合 hGM-CSF 并具有能力中和 hGM-CSF 的生物活 性的单克隆抗体。 在此描述的四种这样的抗体被命名为 EV1018， EV1019， EV1003 和 EV1007， 总结在实施例的表 1 和 2 中。因此， EV1018， EV1019， EV1003 和 EV1007 结合 hGM-CSF 并能 中和 hGM-CSF 的促生长作用。更详细地显示， EV1018 和 EV1019 抗体识别 hGM-CSF 蛋白中 相同或实质上重叠的表位。
     本发明进一步包括抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 特征在于所述抗hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分具有一氨基酸序列， 其中在互补决定区 (CDR) 中一 个或更多个氨基酸被替代、 缺失、 插入或添加。
     在进一步的方面， 提供了编码能够结合 hGM-CSF 并中和 hGM-CSF 生物活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分的分离的脱氧核糖核酸 (DNA)， 其特征在于所述分 离的 DNA 编码一氨基酸序列， 其包含选自由 SEQ ID NO ： 4-9 组成的组的至少一个。
     本 发 明 的 一 个 实 施 方 式 涉 及 能 够 结 合 hGM-CSF(hGM-CSF) 并 中 和 hGM-CSF(hGM-CSF) 生物活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其特征在于所述 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或抗原结合部分具有互补决定区 (CDR)， 其由选自由 SEQ ID NO ： 4-9 组成的组的至少一个氨基酸序列表示。
     本发明的另一个实施方式涉及能够结合 hGM-CSF 并中和 hGM-CSF 生物活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或抗原结合部分， 特征在于所述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或抗原结合 部分具有互补决定区 (CDR)， 其由选自由 SEQ ID NO ： 330-335 组成的组中的至少一个氨基 酸序列表示。
     本发明中， 具有由选自由 SEQ ID NO ： 4-9 组成的组的一种或更多种氨基酸序列表 示的互补决定区 (CDR) 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体， 以及， 具有由选自由 SEQ ID NO ： 330-335 组成的组的一种或各种氨基酸序列表示的互补决定区 (CDR) 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体， 被 认为是不同种的抗 hGM-CSF 单克隆抗体。
     互补决定区 (CDR) 中一个或更多个氨基酸缺失、 取代、 插入或增加的单克隆抗体 或其抗原结合部分， 只要特异结合 hGM-CSF 并中和其生物活性， 会被包括在本发明中。
     本发明包括能够结合 hGM-CSF 并中和 hGM-CSF 生物活性的单克隆抗体或其抗原结 合部分， 其中所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分具有选自下面的组的 CDR ：
     (a) 轻链 (L 链 )CDR1， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 7，
     (b) 轻链 (L 链 )CDR2， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 8， 和
     (c) 轻链 (L 链 )CDR3， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 9。
     同样地， 本发明包括能够结合 hGM-CSF 并中和 hGM-CSF 生物活性的单克隆抗体或 其抗原结合部分， 其中所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分具有选自下面的组的 CDR ：
     (d) 轻链 (L 链 )CDR1， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 330，
     (e) 轻链 (L 链 )CDR2， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 331， 和
     (f) 轻链 (L 链 )CDR3， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 332。
     下面的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 当特异结合 hGM-CSF 并中和其 生物活性时， 也包括在本发明中 ： 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其中上述的轻 链互补决定区 (CDRs) 被一个或更多个氨基酸的缺失、 替代、 插入或添加修饰。
     本发明包括能够结合 hGM-CSF 并中和 hGM-CSF 生物活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体 或其抗原结合部分， 其中所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分具有选自下面的组 的 CDR ：
     (a) 重链 (H 链 )CDR1， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4，
     (b) 重链 (H 链 )CDR2， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 5， 和
     (c) 重链 (H 链 )CDR3， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 6。同样地， 本发明包括能够结合 hGM-CSF 并中和 hGM-CSF 生物活性的单克隆抗体或 其抗原结合部分， 所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分具有选自下面的组的 CDR ：
     (a) 重链 (H 链 )CDR1， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 333
     (b) 重链 (H 链 )CDR2， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 334， 和
     (c) 重链 (H 链 )CDR3， 其具有氨基酸序列 SEQ ID NO ： 335。
     下面的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分特异结合 hGM-CSF 并中和其生物 活性时， 也包括在本发明中 ：
     抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其中上述的重链互补决定区 (CDR) 被 一个或更多个氨基酸的缺失、 替代、 插入或添加修饰。
     GM-CSF 表位
     也是此处的主题的是 hGM-CSF 的表位， 所述表位是人 GM-CSF 的不连续区段， 其中 所述表位包含人 GM-CSF(SEQ ID NO ： 1) 的 77-80 位氨基酸残基和人 GM-CSF(SEQ ID NO ： 1) 的 95-104 位氨基酸残基， 定义为 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 中所列的多肽序列， 被包含 SEQ ID NO ： 4-9 或 SEQ ID NO ： 330-335 所示的 6 个不同 CDR 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其 抗原结合片段识别。 如实施例中更详细的描述， 单克隆抗体 EV1018 和 EV1019 识别的 hGM-CSF 表位已 通过表位作图研究确定。 发现， EV1018 和 EV1019 二者识别相同 ( 或实质上重叠 ) 的 hGM-CSF 抗原位点， 其对应于 GenBank 登录号 ： NP_000749 所确定的 77-80 和 95-104 位氨基酸残基。 结构研究表明， 虽然这两个区段在一级序列上是不连续， 但是多肽的两个区段折叠时相互 靠近， 共同形成构象表位。EV1018 和 EV1019 的 CDR 序列分析显示出实质的相似性， 这与 EV1018 和 EV1019 识别相同或实质上重叠的表位的观察结果一致。比较这两个抗体的 CDR 的肽序列， 得到下面的共有序列 ( 如， 公式 )， 代表构成每个 CDR 的重叠 ( 如， 共有 ) 残基 ：
     对于 VH-CDR1 ： FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A ；
     对于 VH-CDR2 ： X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中每个 Xn 互相独立 地是任何天然存在的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K ；
     对于 VH-CDR3 ： EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 互相独立地是任何天 然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G ；
     对于 VL-CDR1 ： XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 互相独立地是任 何天然存在的氨基酸， 且 X11 是 H 或 Y ；
     对于 VL-CDR2 ： GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P ； 且
     对于 VL-CDR3 ： STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其中 X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L。
     每个共有公式中， 构成相应 CDR 的氨基酸残基以常用的单字母形式表示。EV1018 和 EV1019 共享的相同残基也被表示出来。
     相应地， 此处的另一个实施方式是与 hGM-CSF 结合并展现对 hGM-CSF 的中和能力 或活性的分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合片 段包含 (a) 重链或， 当为抗体片段时， 重链的一部分， 其包含 (i) 含有 VH-CDR1 的共有序列 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A， (ii) 含有 VH-CDR2 的共有
     序列 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在 的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K， 和 (iii) 含有 VH-CDR3 的共有序列 EXnX9GX10QXnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 相互独 立地是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G ； 和 (b) 轻链或， 当为抗体片段 时， 轻链或其一部分， 其包含 (i) 含有 VL-CDR1 的共有序列 XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， 且 X11 是 H 或 Y， (ii) 含有 VL-CDR2 的共有序列 GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P， 和 (iii) 含有 VL-CDR3 的共有序列 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其中 X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L ； 且 其中所述的抗体或其片段识别 hGM-CSF 中的 ELYK(SEQ IDNO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)。 在一个特定的实施方式中， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段结合 hGM-CSF(SEQ ID NO ： 1) 中的下述不连续的表位 ： ELYK(SEQ ID NO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)。
     在此描述的另一个实施方式是分离的与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或 其与 hGM-CSF 结合的抗原结合片段， 其中所述抗体或其片段包含 (a) 重链， 或为抗体片段 时， 重链的一部分， 其包含 (i) 含有 VH-CDR1 的共有序列 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A， (ii) 含有 VH-CDR2 的共有序列 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K， 和 (iii) 含有 VH-CDR3 的共有序列 EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G ； 和 (b) 轻链， 或为抗体片段时， 轻链或其一部分， 其包含 (i) 含 有 VL-CDR1 的共有序列 XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 相互独立地是 任何天然存在的氨基酸， 且 X11 是 H 或 Y， (ii) 含有 VL-CDR2 的共有序列 GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其 中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P， 和 (iii) 含 有 VL-CDR3 的 共 有 序 列 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其中 X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L ； 且其中实施抗体或其 片段结合 hGM-CSF 的 KD 不超过 400pM， 在另一个实施方式中 KD 小于 160pM， KD 是根据实施例 11 描述的技术测定的。
     另 一 个 实 施 方 式 中， 抗 hGM-CSF 单 克 隆 抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 特 征 在 于， 抗 hGM-CSF 单 克 隆 抗 体 或 它 的 抗 原 结 合 抗 hGM-CSF 单 克 隆 抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 抑 制外周血树突状细胞的增殖。因而， 进一步的实施方式是分离的与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其与 hGM-CSF 结合的抗原结合片段， 所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体 或其片段包含重链或其一部分和轻链或其一部分。重链或， 当为抗体片段时， 重链的一 部分， 可以包含 VH-CDR1， VH-CDR2 和 VH-CDR3。在一些实施方式中， 共有序列表示为式子 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A， 其构成 VH-CDR1。 类似地， 式子 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨 基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K， 表示构 成 VH-CDR2 的共有序列 ； 而式子 EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 相互独立地 是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G， 表示构成 VH-CDR3 的共有序列。轻链 或， 当为抗体片段时， 轻链或其一部分可以包含 VL-CDR1， VL-CDR2 和 VL-CDR3。 在所述实施方 式中， 式子 XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的 氨基酸， 且 X11 是 H 或 Y， 表示构成 VL-CDR1 的共有序列 ； 式子 GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P， 表示构成 VL-CDR2 的共有序列 ； 而式子 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 表示构成 VL-CDR3 的共有序列。
     在任一实施方式中， 抗体或其片段中和 hGM-CSF 活性。在特定的实施方式中， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其片段中和 hGM-CSF 活性， 使得在如实施例 12 中所述的 TF-1 增殖 分析的每个例子中， ED80 时实施测定的所述抗体或片段在增殖抑制分析中的 IC50 值小于 20pM， 小于 30pM， 小于 40pM， 小于 50pM， 小于 60pM， 小于 70pM， 小于 80pM， 小于 90pM 或小于 100pM。在特定的实施方式中， 所述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段在所述的 TF-1 增殖分析中 ED80 时测定的 IC50 值小于 40pM 或小于 30pM。在特定的实施方式中， 所 述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段在所述的 TF-1 增殖分析中 ED80 时测定的 IC50 值小于 25pM 或小于 20pM。在进一步的实施方式中， 本发明提供了抗 hGM-CSF 单克隆 抗体或其抗原结合片段， 其特征在于抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段在浓度为约 14pM 时， 当 TF-1 细胞由 hGM-CSF 的诱导增殖时， 抑制约 50％的 TF-1 细胞增殖。
     如实施例中更详细的说明， EV1018 和 EV1019 都有效地中和 hGM-CSF 生物活性。 由于这些抗体实质上共享相同的上述构象表位， 有可能使用该表位去筛选识别该表位的其 他分子， 如单克隆抗体或片段。因此， 本发明还涵盖筛选方法， 其中如 SEQ ID NO ： 2 和 SEQ ID NO ： 3 所示多肽序列限定的， 被 EV1018， EV1019 或其变体识别的 hGM-CSF 表位。这样的 方法包括 (i) 用包含表位的探针筛选生物样品或肽库 ； (ii) 分离特异结合探针的分子 ； 和 (iii) 鉴定所述分子。 在一个实施方式中， 所述方法进一步包括生产分子的步骤。 一些实施 方式中， 用所述方法鉴定的分子是抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些情况 下， 探针可以进一步包含可检测的标记， 包括但不限于标记物， 染料， 亲和标签等。 根据一些 实施方式， 例如为了筛选结合分子， 探针可固定化。筛选的方法是通常可以获得的， 且是技 术人员公知的。
     在此处所述的任一实施方式中， 抗体或其抗原结合片段可以是免疫球蛋白的任何 亚型， 例如 IgG 类， 如 IgG1， IgG2 和 IgG4。因此， 在此处所述的任一实施方式中， 重链可以是， 例如， 属于伽玛类， 例如伽玛 1(γ1)， 伽玛 2(γ2)， 伽玛 3(γ3)， 或伽玛 4(γ4)。在上述的实 施方式中， 重链可以选自 ( 重链的氨基酸残基选自 ) 由 SEQ ID NO ： 10-33， 38-80 和 152-245 和 348-363 所示的多肽组成的组。在一些实施方式中， 可以用重链的部分， 包括重链可变 区。本发明所述的重链可变区的非限制性例子在 SEQ ID NO ： 152-159 和 348-363 中提供。
     在抗 hGM-CSF 单克隆抗体及其抗原结合片段中， 轻链可以是 λ 轻链或其部分， 或 κ 轻链或其部分。在特定的实施方式中， λ 轻链含有一个或两个下列氨基酸取代 ： R100G 和 A153G( 含有取代 R100G， 取代 A153G， 或取代 R100G 和 A153G)。需要注意的是， 抗体链的 氨基酸序列中的取代在这里是参照合适的参考氨基酸序列来描述的， 从而任何轻链或其片 段中位置 100 和 153 的指定， 应当根据本发明通过比较 SEQ ID NO ： 35 和 SEQ ID NO ： 34 来 决定， 这些氨基酸位置分别相当于与 SEQ ID 34 序列比较时， SEQ ID NO ： 35 上 R 被 G 取代， A 被 G 取代的氨基酸位置。例如， 在上述 λ 轻链可以包含一个或两个所述的氨基酸取代的 情况中， 参考氨基酸序列是 EV1018 轻链 (EV1018-wt-original ； SEQ ID NO ： 34)。R100G 表 示 EV1018 轻链上第 100 位的 R( 精氨酸 ) 被 G( 甘氨酸 ) 取代 ； A153G 表示 EV1018 轻链上 第 153 位的 A( 丙氨酸 ) 被 G( 甘氨酸 ) 取代。
     在特定的实施方式中， 轻链选自由 ( 氨基酸残基表示为 )SEQ ID NO ： 34-37 和184-221 和 364-365 所列的多肽组成的组。此处所述的轻链可变区的例子提供在 SEQ ID NO ： 184-201 和 364-365。
     轻链可以包含一个所述的氨基酸取代或两个及更多个所述氨基酸取代的组合， 以 及不实质性损害抗体或其抗原结合片段与 hGM-CSF 结合并中和其活性的能力的其他氨基 酸取代。在一个实施方式中， 轻链包含第 100 位和 153 位中的一个或全部氨基酸取代， 使得 这两个位点中的一个或全部糖基化是不可能的。
     与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可以包含一个 或更多个氨基酸取代， 如 T97A、 T97V、 N95D、 N95E、 N95K、 N95Q、 N93Q/N95T、 K144R、 L164A 和 L165A。需要注意的是， 抗体链的氨基酸序列中的取代在这里是参照合适的参考氨基酸序 列来描述的。位置决定的原则与上述的 R100G 和 A153G 取代的位置决定原则相同。例如， 在上述重链可以包含一个或更多个所述的氨基酸取代的情况中， 参考氨基酸序列是 EV1018 重链 (EV1018 ； SEQ ID NO ： 10)。例如， T97A 表示 EV1018 重链上第 97 位上的 T( 苏氨酸 ) 被 A( 丙氨酸 ) 取代 ； L164A 表示 EV1018 重链上第 164 位上的 L( 亮氨酸 ) 被 A( 丙氨酸 ) 取 代。
     重链可以包含一个氨基酸取代或两个及更多个氨基酸取代的组合， 以及不实质性 损害抗体或其抗原结合片段结合 hGM-CSF 并中和其活性的能力的其他氨基酸取代。
     关于本发明实施方式的进一步的细节概述如下 ：
     在一个实施方式中， 重链含有选自以下组成的组的氨基酸取代中一个或更多个， 或者一个或组合 ： Q3E、 T97A、 T97V、 N95D、 N95E、 N95K、 N95Q、 N93Q/N95T、 K144R、 L164A 和 L165A。在进一步的实施方式中， 重链含有一个多个氨基酸取代， 选自由 Q3E、 T97A、 T97V、 N95D、 N95E、 N95K、 N95Q、 N93Q/N95T、 K144R、 L164A 和 L165A 组成的组， 并且轻链含有氨基酸 取代 R100G 和 A153G 中的一个或两个。
     进一步的实施方式是与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其与 hGM-CSF 结 合的抗原结合片段， 其中 VH-CDR1 包含氨基酸残基 SYGMH(SEQ ID NO ： 4) 或 SHAMH(SEQ ID NO ： 333)。
     进一步的实施方式是与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其与 hGM-CSF 结 合的抗原结合片段， 其中 VH-CDR2 包含氨基酸残基 LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO ： 5) 或 VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO ： 334)。
     进一步的实施方式是与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其与 hGM-CSF 结 合 的 抗 原 结 合 片 段， 其 中 VH-CDR3 包 含 氨 基 酸 残 基 ESMGAINDN(SEQ ID NO ： 6) 或 EWVGGTCDS(SEQ ID NO ： 335)。
     本发明进一步的实施例如下 ：
     与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其与 hGM-CSF 结合的抗原结合片段， 其中 VL-CDR1 包含氨基酸残基 IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO ： 7) 或 SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO ： 330) ；
     与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其与 hGM-CSF 结合的抗原结合片段， 其中 VL-CDR2 包含氨基酸残基 GRSPPS(SEQ ID NO ： 8) 或 GKSPAS(SEQ ID NO ： 331) ； 和
     与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其与 hGM-CSF 结合的抗原结合片段， 其中 VL-CDR3 包含氨基酸残基 STWDSSLSAVV(SEQ ID NO ： 9) 或 STWDSRLSAVL(SEQ ID NO ：332)。 本发明另外的实施方式涉及与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其与 hGM-CSF 结合的抗原结合片段， 其进一步包含信号序列。
     信号序列可以是本领域技术人员知道的多种信号序列中的任一个。比如有助于 允许或增强编码产物表达和 / 或传递出产生它的细胞的任何信号序列， 包括但不限于选自 SEQ ID NO ： 324， 325 和 326 组成的组的信号序列。
     在所有的实施方式中， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体可以是人抗体， 人源化抗体， 或单链 抗体。
     抗体的结合活性
     在一个方面中以及意外地， 如本公开内容的实施例所示， 测得的抗体与抗原 (hGM-CSF) 的结合亲和力不是与中和能力 ( 如中和 hGM-CSF 生物活性的能力 ) 线性相关的。 这个结果与一般认为的较高的亲和力对应于较高的中和能力是相反的。 例如， 发现的是， 此 处公开的抗体即用所述的 CDR 识别此处所述的表位的抗体， 如 EV1018， 在 TF-1 分析中， 如 表 7 所述， 显示出高于现有抗体 100 倍以上的抑制作用， 但是结合亲和力不足现有抗体的 50％。这与 WO2006/122797 中的教导形成对比， WO2006/122797 显示抗体越高的亲和力在 TF-1 分析中有越高的活性。
     抗体的中和活性
     人外周血单核细胞和肿瘤细胞系 TF-1 可响应 hGM-CSF 的刺激而增殖。通过测定 对它们增殖的抑制效果， 确认抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段的中和活性。众所 周知， 人外周血单核细胞和 TF-1 细胞培养在 hGM-CSF 存在的条件下可增殖。在培养系统中 加入本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 或首先使 hGM-CSF 与本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段反应， 然后将其添加至培养系统可抑制这种增殖。 例 如， 与阴性对照 (31pg/ml 的 hlgG) 比较， 本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片 段， 浓度大约 2ng/ml( 大约 14pM) 时， 作为中和 hGM-CSF 诱导的 TF-1 细胞增殖的活性， 具有 细胞抑制率 40-60％ ( 大约 50％ )。
     本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段具有对 hGM-CSF 的中和能力， 所述能力高于现有的抗 hGM-CSF 单克隆抗体。因此， 它有望作为治疗药物， 适用于较小量或 剂量治疗由 hGM-CSF 引起的各种疾病， 比如变应性皮炎， 自身免疫性疾病， 慢性阻塞性肺疾 病 (COPD)， 哮喘， 囊性纤维化病， 间质性肺病， 鼻炎， 关节炎和相关关节疾病如类风湿性关节 炎， 银屑病， 髓系白血病， 和多发性硬化。
     治疗组合物， 试剂盒和治疗用途
     此处公开的抗 hGM-CSF 抗体和抗原结合片段中和 hGM-CSF 的生物活性是有效的， 因此， 对于治疗受试者中与 hGM-CSF 异常表达相关 ( 如， 由其引起的 ) 医学状况 ( 例如， 疾 病或病症 ) 是有用的。因此， 这些治疗用途也包括在本发明中。
     本发明在某些实施方式中提供了治疗在此所述的疾病或状况的方法， 包括给患者 施用在此描述的抗体或其抗原结合片段， 或在此描述的组合物。
     此处所用的术语 “与 hGM-CSF 过表达相关的疾病或病症” 一般是指 “由 hGM-CSF 引 起的疾病” 。所述术语应该包含受试者具有 GM-CSF 时引起和加重病理学的任何疾病。所述 术语还包括引起和加重病理生理学的其他疾病。预期抑制 GM-CSF 的生物学活性可以缓解
     与升高的 GM-CSF 相关的疾病症状， 和 / 或可以减缓疾病发展。
     此处所用的术语″疾病″、 ″病症″和″状况″是可以互换的。这些包括但不限 于： 呼吸道疾病， 各种起因的阻塞性肺疾病， 各种起因的肺气肿， 限制性肺疾病， 间质性肺疾 病， 间质性肺部疾病， 囊性纤维化， 各种起因的支气管炎， 支气管扩张症， 成人呼吸窘迫综合 征 (ARDS) 和所有形式的肺水肿 ； 选自下述的阻塞性肺疾病， 慢性阻塞性肺疾病 (COPD)， 哮 喘， 支气管哮喘， 小儿哮喘， 严重哮喘， 急性哮喘发作和慢性支气管炎 ； 源于下述的肺气肿， 慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 或 α1- 蛋白酶抑制剂缺陷 ； 限制性肺疾病选自变应性肺泡炎、 工 作有关的有毒物质所引发的限制性肺疾病如石棉沉着病或硅沉着病、 肺部肿瘤所造成的限 制， 如癌性淋巴管疾病 (lymphangiosis carcinomatosa)， 细支气管肺泡癌和淋巴瘤 ； 感染 引起的肺炎， 例如病毒、 细菌、 真菌、 原生动物， 蠕虫或其他病原体感染， 各种因素如吸入和 左心功能不全引起的肺炎， 辐射诱发的肺炎或纤维化， 胶原性疾病， 如红斑狼疮， 系统性硬 皮病或结节病， 肉芽肿病， 如 Boec 氏病， 特发性间质性肺炎或特发性肺纤维化 (IPF) ； 粘液 粘稠病， 细菌或病毒感染引起的支气管炎， 变应性支气管炎和毒性支气管炎 ； 支气管扩张 ； 肺水肿， 如， 吸入有毒物质和外来物后的毒性肺水肿 ； 鼻炎， 关节炎及相关关节病， 银屑病， 髓系白血病， 多发性硬化， 阿尔茨海默氏症， 肾小球肾炎， 和慢性特应性皮炎。 这里使用的术语 “治疗” 通常是指向受试者施用治疗剂， 试图获得全部或任何以下 结果 ： 施用一种或多种疗法 ( 如 GM-CSF 抗体 ) 降低或改善人 GM-CSF 异常表达和 / 或活性 相关的疾病、 病症或状况的发展、 严重性和 / 或持续时间， 或者改善其一个或更多个症状。
     这里使用的术语 “治疗有效量” 是指疗法 ( 例如， 免疫特异地与人 GM-CSF 结合的 抗体 ) 的量， 所述量足以降低与人 GM-CSF 异常表达和 / 或活性相关联的病症的严重性， 缩 短人 GM-CSF 异常表达和 / 或活性相关联的病症的持续时间， 改善人 GM-CSF 异常表达和 / 或活性相关联的病症的一个或更多个症状， 阻止人 GM-CSF 异常表达和 / 或活性相关联的病 症的发展， 促使人 GM-CSF 异常表达和 / 或活性相关联的病症的消退， 或增强或促进其他疗 法对人 GM-CSF 异常表达和 / 或活性相关联的病症的治疗效果。
     施用抗 hGM-CSF 单克隆抗体如施用在此所述的组合物的量， 将根据所治疗的状 况、 疾病或病症， 所治疗的受试者 ( 个体 ) 的年龄、 性别、 健康状况， 所治疗的状况、 疾病或病 症的严重性或发展程度而变化。可以利用已知的方法， 并根据受试者的需要凭经验来确定 合适的剂量。通常情况下， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或抗原结合片段以不超过 500 毫克 / 剂 的剂量施用给受试者。也可以施用较小的剂量。
     在其他实施方式， 上面列出的任何抗 GM-CSF 抗体和片段可以组合。在一些实施方 式， 2， 3， 4， 5， 或者更多种的所述抗 GM-CSF 抗体， 片段或其组合可以被组合。
     在一些实施方式中， 上述任何的实施方式可以进一步组合一或更多种过去已知的 抗 GM-CSF 的抗体， 片段， 或其组合。
     另一个实施方式是包含 ( 一种， 至少一种 ) 在此所述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体 或其抗原结合片段的治疗组合物。在一个实施方式中， 治疗组合物包含一种或更多种抗 hGM-CSF 单克隆抗体或抗原结合片段， 和药学上可接受的载体， 所述的单克隆抗体或抗原结 合片段识别 hGM-CSF 上的 ELYK(SEQ ID NO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)。治疗组合物 可以个别地 ( 一种治疗用组合物中包含一种或一型抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片 段 ) 或组合地包含任何在此描述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 如两种 / 型
     或多种 / 型抗 hGM-CSF 单克隆抗体的组合 ； 两种 / 型或多种 / 型其抗原结合片段的组合 ； 一 种 / 型或多种 / 型抗 hGM-CSF 单克隆抗体和一种 / 型或多种 / 型其抗原结合片段的组合 ； 一种 / 型或多种 / 型抗 hGM-CSF 单克隆抗体和两种 / 型或多种 / 型其抗原结合片段的组合 ； 或两种 / 型或多种 / 型抗 hGM-CSF 单克隆抗体和一种 / 型或多种 / 型其抗原结合片段的组 合。
     特定的实施方式是包含 ( 一种或超过一种 ) 与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克 隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的治疗组合物， 抗体或其抗原结合片段 包含 (a) 重链或， 当为抗体片段时， 重链的一部分， 其包含 (i) 含有 VH-CDR1 的共有序列 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A， (ii) 含有 VH-CDR2 的共有序 列 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的 氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K， 和 (iii) 含有 VH-CDR3 的共有序列 EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 相互独立地 是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G ； 和 (b) 轻链或， 当为抗体片段时， 轻 链或其一部分， 其包含 (i) 含有 VL-CDR1 的共有序列 XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO ： 317) 其 中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， 且 X11 是 H 或 Y， (ii) 含有 VL-CDR2 的共有 序列 GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P， 和 (iii) 含有 VL-CDR3 的共有序列 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其中 X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L， 其中所述 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其片识别 hGM-CSF 中的 ELYK(SEQ ID NO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)。
     此处所述的组合物包含两种或更多种与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体， 两种或更多种其与 hGM-CSF 结合的抗原结合片段， 或者它们的组合， 以及药学上可接受的 载体， 其中一种或多种抗 hGM-CSF 单克隆抗体或一种或多种其抗原结合片段识别 hGM-CSF 中的不连续表位 ELYK(SEQ ID NO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)。
     此处所述的进一步的实施方式是包含两种或更多种与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体， 两种或更多种其抗原结合片段或者其它们的组合， 和药学上可接受载体的组 合物， 其中一种或多种抗体或一种或多种其抗原结合片段包含 ： (a) 重链或， 当为抗体片段 时， 重链的一部分， 其包含 (i) 含有 VH-CDR1 的共有序列 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A， (ii) 含有 VH-CDR2 的共有序列 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K， 和 (iii) 含有 VH-CDR3 的共有序列 EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G ； 和 (b) 轻链或， 当为抗体片段时， 轻链或其一部分， 其包含 (i) 含有 VL-CDR1 的共有序列 XnGNXnXnNIGSXnAVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 相互独立地是 任何天然存在的氨基酸， 且 Xn 是 H 或 Y， (ii) 含有 VL-CDR2 的共有序列 GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其 中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P， 且 (iii) 含 有 VL-CDR3 的 共 有 序 列 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其中 X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L， 其中所述抗 hGM-CSF 单 克隆抗体或其片段识别 hGM-CSF 中的 ELYK(SEQ ID NO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)。
     在此描述的进一步的主题是组合物， 其中两种或更多种与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗体中的至少一种包含选自 SEQ ID NO ： 10-33， 38-80， 152-183， 34-37，184-221， 222-245， 320-323 和 348-365 组成的组中的多肽。组合物除了包括一种或多种在 此描述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体外， 可包括其他的抗 hGM-CSF 单克隆抗体， 例如以前被描述 过的抗 hGM-CSF 单克隆抗体。参见 ： 例如， PCT 申请， 国际公开号 WO2006/122797 ； PCT 申请， 国际公开号 WO2007/092939 ； 和 PCT 申请， 国际公开号 WO 2006/11353。
     试剂盒
     此处公开的抗 hGM-CSF 抗体或其抗原结合片段及包含这样的抗体的组合物， 可以 作为试剂盒提供， 也包括在本发明中。试剂盒， 可以以各种形式提供， 除了药物 ( 治疗组合 物 )， 还可以包括药物或设备的包装和 / 或标签， 所述标签信息通常来自于医生的处方。试 剂盒通常包括印制的使用说明书。在一些实施方式中， 配制的组合物 ( 如， 药剂 ) 在一个或 更多个容器里提供。在一些实施方式中， 容器可以是用来分发药剂以进行施用的装置。例 如， 在本发明的药物可预先测量 ( 例如， 等分 ) 入单次使用分配器中并以试剂盒的形式提 供。在某些情况下， 容器是注射器。注射器可选地是预装的。在某些情况下， 单次使用的容 器是预装的， 预封的和一次性的。 根据特定药物的施药途径和施药方式， 试剂盒可包括合适 的组件。
     药剂
     此处使用的 “药剂可接受的载体” 包括任何或所有的生理相容溶液， 分散介质， 涂 层剂， 抗菌剂或抗真菌剂， 渗透压调节剂， 和吸收延缓剂。药剂可接受的载体的例子包括一 种或多种制剂诸如水， 盐溶液， 磷酸盐缓冲盐水， 葡萄糖， 甘油和乙醇及其组合。 在许多情况 下， 渗透压调节剂， 如糖， 多元醇或氯化钠优选地包含在组合物中。所述多元醇可以包括甘 露醇或山梨醇。此外药剂可接受的载体可以包括少量的辅助物质， 如保湿剂， 乳化剂， 防腐 剂， 和缓冲剂。所述辅助物质可增强组合物中抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段的 保存或有效性。
     适合胃肠外施用的药物组合物可以在其中掺入本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体 或抗原结合片段。优选地， 当施用一种抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段时， 所 述抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段被调整成含有浓度为 0.1-250mg/mL 的抗体 的可注射溶液。另一方面， 当多种抗体被混合并应用时， 抗体优选地调整为含有浓度为 0.001-10mg/mL 的抗体的注射液。此外， 多种抗体， 可按任何比例任意混合。
     液体剂型或冻干剂型形成的可注射溶液可以在火石或琥珀管形瓶， 安瓿， 或预装 式注射器中制备。可以使用 pH 15.0-7.0(pH 值 6.0 最合适 ) 的 L- 组氨酸缓冲试剂。L- 组 氨酸的浓度为 5-10mM 可能是最适合的。适用于缓冲试剂的其他试剂， 可以是琥珀酸钠， 柠 檬酸钠， 磷酸钠， 或磷酸钾， 但不限于它们。在 0-300mM 的浓度下， 氯化钠可用于缓冲剂， 以 去除溶液的毒性 ( 对于液体中形成的剂型， 150mM 是最合适的浓度 )。冻干剂型可包括冷冻 保护剂， 主要是比例为 0-10％的蔗糖 ( 比例为 0.5-1.0％可能是最合适的 )。 其他合适的冷 冻保护剂， 可以是海藻糖和乳糖。冻干剂型可包括膨胀剂， 主要包括比例为 1-10％ (2-4％ 的比例可能是最适合 ) 的甘露醇。主要是 L- 甲硫氨酸， 在 1-50mM(5-10mM 可能最适合 )， 可 应用于液体或冻干两种剂型作为稳定剂。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸和精氨酸。可以包 含比例为 0-0.05％ (0.005-0.01％的比例可能是最合适的 ) 的聚山梨醇酯 80， 作为表面活 性剂。其他表面活性剂包括聚山梨醇酯 20 和 BRJJ 表面活性剂， 但不限于它们。
     各种剂型可用于本发明的组合物。 例如， 组合物的剂型可以有液态， 半固态， 固态。溶液 ( 例如， 可注射或可输液溶液 )， 分散液， 悬浮液， 片剂， 丸剂， 粉剂， 脂质体和栓剂均包 括在内。优选地， 剂型取决于施用方法和治疗实例。优选地， 组合物具有能够注射和输液的 液体剂型。所述组合物优选地可以用于胃肠外施用 ( 例如， 静脉内施用， 皮下施用， 腹部施 用和肌肉内施用 )。 在优选的实施方式中， 抗体通过静脉输液或静脉注射施用。 在另一优选 的实施方式中， 抗体通过肌肉注射或皮下注射施用。
     所述治疗用组合物通常应该在经灭菌的稳定条件下生产和储存。组合物可以以 溶液， 微乳液， 分散液， 脂质体或适合于高药物浓度的其他结构来开处方。可注射的经灭菌 溶液通过以下程序制备。所需量的活性化合物 ( 特别地， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原 结合片段 ) 混合于合适的溶剂中。如果需要， 上述化合物中的一种或其组合与活性化合物 一起混合在合适的溶剂中， 然后通过过滤灭菌， 从而制备出溶液。通常， 基本分散介质和活 性化合物混合在经灭菌的媒介中， 所述媒介包括来自上述介质的其他所需化合物。当用经 灭菌的冻干粉来制备经灭菌的注射溶液时， 优选使用真空干燥法和喷雾干燥法作为制备方 法。通过所述制备方法， 由活性成分粉末和用于过滤的经灭菌的溶液得到需要的其他任何 组合物。溶液的流动性通过以下方式适当地维持。所述方法为， 例如， 采用涂层材料如卵磷 脂保持分散液所需的颗粒大小， 以及使用表面活性剂。 组合物中还包括药用吸收延缓剂， 如 单硬脂酸和明胶， 藉此可注射组合物在人体内可以维持较长的吸收时间。
     本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段可以通过本领域已知的多种 方法施用。如皮下注射、 静脉注射或输液等施药途径 / 方法优选地应用于各种疗法中。施 药途径 / 方法取决于期望的结果。本领域技术人员理解植入物、 皮肤敷贴和药物投递系统 包含在所述的施用途径 / 方法中。在一个实施方式中， 抗体如控制释放试剂， 其可以控制化 合物的释放， 也与制品中的活性化合物一起应用。生物相容聚合物具有生物可降解性。所 述制品可包括生物相容聚合物如乙烯醋酸乙烯， 聚酸酐， 聚羟基乙酸， 胶原蛋白， 聚原酸酯 (polyortito esters)， 和聚乳酸。制备这些药剂的多种方法已被授予专利权， 且被本领域 技术人员公知。
     在一个实施方式中抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段是与， 例如， 没有活 性的稀释剂或可食用且可吸收的载体一起口服施用的。化合物 ( 如果需要， 其他成分 ) 也 可以被封装在硬或软胶囊中， 压缩在片剂中， 或直接混合在给患者的食品中。 治疗中口服施 用时， 所述化合物可混合在赋形剂中， 然后以片剂， 含片， 糖锭， 胶囊剂， 酏剂， 悬浮液， 糖浆 和扁丸 (oblate) 等可摄食的形式使用。为了通过胃肠外途径以外的途径施用本发明的化 合物， 有必要用阻止其失活的材料包被所述化合物， 并同时施用化合物和所述材料。
     联合疗法
     也可以在组合物中补充掺入另外的活性成分， 所述另外的活性成分不包括针对非 GM-CSF 的抗原的抗体。在一个实施方式中， 本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合 片段与一种或多种其他的用于治疗升高水平 GM-CSF 相关疾病的治疗剂一起处方， 或者与 其他治疗剂同时施用， 其中所述其他治疗剂不是针对 GM-CSF 以外的蛋白质的抗体。例如， 本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段与一种或多种其他抗 GM-CSF 抗体共同 处方。所述联合疗法的优点在于少量治疗剂即有效。这种治疗剂能避免单药治疗中可能伴 随的毒性或并发症。
     此处所用的″同时施用″应该被广义地理解。比如， 当两种或更多种抗 GM-CSF 单克隆抗体或抗原结合片段施用给患者时， 每一种或一些所述抗体或其片段可以或可以不以 单一药剂 ( 如， 组合物 ) 的形式提供。 在一些实施方式中， 单一药剂 ( 如， 组合物 ) 包含施用 给受试者的所有的不同种类的抗 GM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 从而使得所述抗 体或其抗原结合片段以混合物同时提供给患者。 然而， 在一些实施方式中， 包含一种或多种 抗体或抗原结合片段的两种或更多种药剂 ( 如， 组合物 ) 分别施用给受试者。当 “分别” 施 用时， 药剂可按顺序如一种接一种的施用。只要第一次施药和接下来施药 ( 第二、 第三次 ) 在受试者中药效的时间重叠， 靶向组织 / 细胞重叠， 从而实现了增强的 ( 如协同的 ) 结果， 就可以被认为是 “同时” 施用。
     特别地， 当施用超过一种本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体时， 它可能提供细胞生 长抑制活性 ( 中和活性 )， 其远高于药用组合物中一种单克隆抗体提供的活性。因此， 可能 以更小的量提供所需的治疗剂。
     相应地， 提供了增强活性的方法， 其特征在于两种或更多种抗 GM-CSF 单克隆抗体 同时施用， 或药用组合物或兽药组合物， 其特征在于包含了两种或更多种抗 hGM-CSF 单克 隆抗体或其抗原结合片段， 所述两种或更多种抗体选自以下 (a) 和 (b) ：
     (a) 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 其特异于 hGM-CSF， 具有 SEQ ID NO ： 4 至 9， SEQ ID NO ： 330 至 335， SEQ ID NO ： 336 至 341， 或 SEQ ID NO ： 342 至 347 的氨基 酸序列所示互补决定区 (CDR)
     (b)(a) 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 其具有其中一个或多个氨基 酸被取代、 缺失、 插入或添加的氨基酸序列， 且所述抗体或其抗原结合片段特异于 hGM-CSF。
     同样地， 本发明也包括增强活性的方法， 其特征在于多种不同 ( 此后描述为多种 ) 的本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体被同时施用， 或者包含多种本发明的抗 hGM-CSF 抗体的 药用组合物或兽药组合物。
     在任何实施方式中， 所述组合物可以包含一种或型能够中和 hGM-CSF 活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段。作为选择， 在任何实施方式中， 所述组合物可以包 含两种或型或者更多种或型能够中和 hGM-CSF 活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结 合片段。这样的组合物中的单克隆抗体和 / 或其片段除了包括此处公开的一种或多种抗体 或其片段外， 还可以包括先前公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体和 / 或其片段。抗 hGM-CSF 单 克隆抗体及其抗原结合片段， 和包含这样的抗体和 / 或其抗原结合片段的治疗组合物， 药 用组合物和药物组合物可以用来治疗或预防由 hGM-CSF 引起和 / 或与其过表达 ( 相对于对 照——例如， 没有状况、 疾病或病症的个体——的 hGM-CSF 的表达水平 ) 相关的疾病、 病症 或状况。
     在抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段中包含药学上可接受的载体的药用 组合物被认为对于 hGM-CSF 引起的疾病是有效的。可列举 hGM-CSF 过量产生引起的疾病， 如：
     (a) 变应性疾病， 如哮喘， 特应性， 和花粉症，
     (b) 移植物排斥， 移植物抗宿主病 (GVHD) 和
     (c) 自身免疫性疾病， 如类风湿性关节炎。
     无意将其限制到任何特定的机制， 相信 GM-CSF 的过表达至少部分地引起一系列 疾病或病症， 例如在此列出的那些。 不过， 这样的临床状况也可能是其他相关的生物途径受损引起的， 如相应受体的上调， 或一种或多种效应物途径中的突变。因此， “hGM-CSF 过表达 相关疾病或病症” 应包括导致与 hGM-CSF 的过表达结果相同的状况。
     制造 / 制备
     在一个实施方式中本发明是在此公开用于药物的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗 原结合片段。
     抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 如在此描述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体 或其抗原结合片段， 在制造或制备用于治疗 hGM-CSF 过表达 (GM-CSF 引起的水平 ) 相关疾 病或病症的药物中的用途， 也是本发明的实施方式， 其中所述抗体或其抗原结合片段结合 hGM-CSF 并能够中和 hGM-CSF 活性。这样的抗 hGM-CSF 单克隆抗体和其抗原结合片段可以 是在此描述的任何抗 hGM-CSF 单克隆抗体和其抗原结合片段。
     进一步的实施方式是识别 hGM-CSF 中的 ELYK(SEQ ID NO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3) 的抗体或其抗原结合片段在制造或制备药物中的用途。
     进一步的实施方式是抗 hGM-CSF 单克隆抗体和 / 或其抗原结合片段生产或制备 药物的用途， 其中， 所述抗体或其片段包含 (a) 重链或， 当为抗体片段时， 重链的一部分， 其 包含 (i) 含有 VH-CDR1 的共有序列 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A， (ii) 含有 VH-CDR2 的共有序列 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中每 个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K， 和 (iii) 含有 VH-CDR3 的共有序列 EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G； 和 (b) 轻链或， 当为抗体片段时， 轻链或其一部分， 其包含 (i) 含有 VL-CDR1 的共有序列 XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， 且 X11 是 H 或 Y， (ii) 含有 VL-CDR2 的共有序列 GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P， 和 (iii) 含有 VL-CDR3 的共有序列 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其 中 X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L。
     进一步的方面， 本发明提供了分离的可用于制备药物的抗 hGM-CSF 抗体或该抗体 的抗原结合片段。这些药物可用于治疗与 hGM-CSF 异常表达 ( 如过表达 ) 相关的疾病、 状 况或病症。在此描述的任何抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于制备所述治 疗目的的药物。
     所 述 抗 体 或 抗 原 结 合 片 段 识 别 hGM-CSF 中 的 ELYK(SEQ ID NO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)。
     在某些实施方式中， 所述抗体或其抗原结合片段包含 (a) 重链或， 当为抗体片段 时， 重链的一部分， 其包含 (i) 含有 VH-CDR1 的共有序列 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A， (ii) 含有 VH-CDR2 的共有序列 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K， 和 (iii) 含有 VH-CDR3 的共有序列 EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G ； 和 (b) 轻链或， 当为抗体片段时， 轻链或其一部分， 其包含 (i) 含 有 VL-CDR1 的共有序列 XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 相互独立地是 任何天然存在的氨基酸， 且 X11 是 H 或 Y， (ii) 含有 VL-CDR2 的共有序列 GX12SPX13SG(SEQID NO ： 318)， 其 中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P， 和 (iii) 含 有 VL-CDR3 的 共 有 序 列 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其中 X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L。 在一个实施方式中， 抗体 或其抗原结合片段结合 hGM-CSF， 其 KD 不超过 400pM， 在另一个实施方式中小于约 160pM( 如 EV1018 或 EV1019)， 其中 KD 根据实施例中描述的技术测定。
     在其他实施方式中， 上文所列的任何抗 GM-CSF 抗体和片段可以组合。在一些实施 方式中， 2， 3， 4， 5 种或更多这样的抗 GM-CSF 抗体、 其片段或其组合可以组合。
     抗体和片段、 DNA 和载体的产生
     下面描述的是识别本发明提供的不连续表位的初始抗体 (originator antibody) 的产生 ； 但不应该理解为限制到所述特定的方法。 所述的特征在本技术领域可以被取代， 而 不超出本发明的范围。
     本发明的抗 hGM-CSF 单克隆抗体和其抗原结合部分是经过以下步骤， 从来自特发 性肺泡蛋白沉积症患者的血液中得到 ： 分离细胞克隆以产生抗体， 从得到的抗体产生细胞 库中选择抗体阳性细胞， 并通过亲和纯化来纯化从抗体阳性细胞上清液中获得的抗体。
     1) 分离抗 hGM-CSF 的完全人抗体产生细胞克隆
     B 淋巴细胞是从患有特发性肺泡蛋白沉积症 (IPAP) 且血清中存在高水平的抗 hGM-CSF 单克隆抗体的病人血液中分离出来的。然后， 诱导 B 淋巴细胞增殖。诱导其增殖的 方法是公知的。例如， 在转化方法中 (D.Kozbor 等 ) 用癌症的诱导因子， “EB 病毒” ( 以下 简称为 EBV) 来诱导细胞增殖。更具体地， EBV 感染 B 淋巴细胞并诱导其增殖。保存增殖的 细胞作为抗体产生细胞库。
     2) 从抗体产生细胞库分离单克隆抗体。 用生产单克隆抗体中已知的常用方法， 将单克隆细胞从诱导增殖的细胞中筛选出来。 从抗体产生细胞库中选出淋巴细胞， 以生产结合 hGM-CSF 的抗体。更具体地说， 通 过有限稀释法选择细胞群 ( 克隆 )， 所述细胞群 ( 克隆 ) 产生结合 hGM-CSF 的抗体。优选 的是采用 ELISA 法使用 hGM-CSF 和标记的小鼠抗 hlgG 抗体检测结合 hGM-CSF 的片段。通 过培养选定的抗体阳性细胞并且对它们进行反复筛选， 获得只产生所需抗体的细胞群 ( 克 隆 )。 “分离抗体产生细胞克隆” 之前的步骤显示在图 1 的流程图中。
     3) 使用蛋白 A 或蛋白 G 亲和纯化
     当纯化抗 hGM-CSF 单克隆抗体时， 可以将选出的永生化细胞培养于滚瓶 (roller bottle)， 2 升旋转瓶 (spinner flask)， 或其他培养系统。 过滤并浓缩上清液。 然后， 用蛋白 Pharmacia Corp.)， 亲和 A- 琼脂糖凝胶或蛋白 G- 琼脂糖凝胶等 (New Jersey， Piscataway， 层析纯化蛋白质。将缓冲溶液交换为 PBS 后， 通过 280nm 下测定 OD 确定蛋白质的浓度， 或 者优选用比浊计分析。抗体的同种型通过其对不同同种型抗原的抗原特异性方法来检验。
     得到的抗 hGM-CSF 单克隆抗体是由人体内敏化的 B 淋巴细胞产生的纯粹的人抗 体， 因而所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体很少表现出对抗体的免疫反应。当抗体生产细胞被克 隆时， B 淋巴细胞用 EB 病毒感染， 通过 EB 病毒活性诱导其增殖。因此， 其特征在于， 抗体产 生细胞通过利用这样的 EB 病毒活性来克隆。EB 病毒方法的优势在于在人体内生产天然抗 体， 优势还在于获得高亲和力的抗体。例如， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体的亲和力是人工免疫的 小鼠产生的抗体亲和力的 10-100 倍。文库包括通过 EB 病毒感染增殖的一组 B 淋巴细胞。
     有可能从文库中分离出特定的抗体生成细胞克隆， 并获得人抗体。
     如上所述， 描述的特征在本领域可以被取代或改变， 而不超出本发明的范围。核 酸， 载体以及宿主细胞可以表达本发明中的重组抗体或其抗原结合部分。这些也包括在本 发明中。
     下面的表中显示的是 EV1018 的重链变体和轻链变体以及 EV1019 的重链变体和轻 链变体。表中分别提供了 EV1018 的重链变体和轻链变体以及 EV1019 的重链变体和轻链变 体， 使得鉴定 EV1018 和 EV1019 每一个的重链和轻链的所有可能的组合成为可能。本领域 普通技术人员使用本领域已知的方法和此处提供的信息， 能够产生任一组合。
     在进一步的方面， 此处公开了产生抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段的过 程 ( 方法 )。通常， 产生抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段的方法包括得到或产生 DNA， 所述 DNA 基本上由编码免疫球蛋白的 DNA 组成， 所述免疫球蛋白由重链和轻链或 Fab 区组成 ； 产生的 DNA 以可操作地连接到合适启动子的方式， 插入可复制的表达载体， 从而产 生出载体， 所述载体包含可操作地连接到合适启动子的 DNA ； 将所述载体导入宿主细胞， 从 而生产出包含所述载体的宿主细胞 ； 在适合 DNA 表达及其编码的肽和抗 hGM-CSF 单克隆抗 体或抗原结合片段产生的条件下培养宿主细胞。得到的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或抗原结合 片段可以用本领域已知的方法从宿主细胞或宿主细胞培养物回收出来。
     更具体地， 所述过程包括在宿主细胞中至少产生 VH-CDR1， VH-CDR2 和 VH-CDR3， 以 及 VL-CDR1， VL-CDR2 和 VL-CDR3。所述方法包括将编码 VH-CDR1， VH-CDR2， VH-CDR3， VL-CDR1， VL-CDR2 和 VL-CDR3 的 DNA 导入合适的宿主细胞， 将得到的宿主细胞 ( 含有编码 VH-CDR1， VH-CDR2， VH-CDR3， VL-CDR1， VL-CDR2， VL-CDR3 的 DNA 的宿主细胞 ) 维持在适合 DNA 表达 ( 编 码的肽产生 ) 以及抗 hGM-CSF 单克隆抗体或抗原结合片段形成和装配的条件下， 从而产生 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或抗原结合片段。 在特定的实施方式中， 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其 抗原结合片段包括 (a) 重链或， 当为抗体片段时， 重链的一部分， 其包含 (i) 含有 VH-CDR1 的 共有序列 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A， (ii) 含有 VH-CDR2 的共有序列 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天 然存在的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K， 和 (iii) 含有 VH-CDR3 的共有序列 EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 相互 独立地是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G ； 和 (b) 轻链或， 当为抗体片段 时， 轻链或其一部分， 其包含 (i) 含有 VL-CDR1 的共有序列 XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， 且 X11 是 H 或 Y， (ii) 含有 VL-CDR2 的共有序列 GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P， 和 (iii) 含有 VL-CDR3 的共有序列 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其中 X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L ； 且产生的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或抗原结合片段结合 hGM-CSF。编码 VH-CDR1， VH-CDR2， VH-CDR3， VL-CDR1， VL-CDR2 和 VL-CDR3 的 DNA 可以是一个或多个单元 ( 如， 一个 DNA 编码所 有的 VH/VL 元件， 不同的 DNA 编码一些或所有的元件 )。
     例如， 第一 DNA 可编码完整的重链重链， 第二 DNA 可编码完整的轻链。完整的重链 可以选自 SEQ ID NO ： 10-33， 38-80 和 160-183 ； 222-245， 320 和 322 组成的组， 而完整的轻 链可以选自 SEQ ID NO ： 34-37， 202-221， 321 和 323 组成的组。在一个实施方式中， 完整的 重链选自 SEQ ID NO ： 10-33， 38-80 和 160-183 ； 222-245， 320 和 322 组成的组， 完整的轻链选自 SEQ ID NO ： 34-37， 202-221， 321 和 323 组成的组。
     所述过程进一步包括分离抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段。
     下述载体也是此处的主题， 所述载体包含编码 VH-CDR1， 和 / 或 VH-CDR2， 和/或 VH-CDR3 的 DNA。VH-CDR1 是 SYGMH(SEQ ID NO ： 4) 或 SHAMH(SEQ ID NO ： 333)， VH-CDR2 是 LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO ： 5) 或 VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO ： 334)， 而 VH-CDR3 是 ESMGATNDN(SEQ ID NO ： 6) 或 EWVGGTCDS(SEQ ID NO ： 335)。
     下述载体也是此处的主题， 所述载体包含编码 VL-CDR1、 VL-CDR2 和 VL-CDR3 的 DNA， 其中 VL-CDR1 是 IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO ： 7) 或 SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO ： 330)， VL-CDR2 是 GRSPPS(SEQ ID NO ： 8) 或 GKSPAS(SEQ ID NO ： 331)， 而 VL-CDR3 是 STWDSSLSAVV(SEQ ID NO ： 9) 或 STWDSRLSAVL(SEQ ID NO ： 332)。
     例如， 在蛋白成熟过程中重链和轻链的前导序列被切掉。切掉的前导序列对最终 的抗体性质没有影响。为了补足缺失的序列， 克隆的 cDNA 通过连接或 PCR 扩增的方法与合 成的寡核苷酸整合。术语″前导序列″和″信号序列″此处可以互换。
     在另外一个过程中， 整个可变区是用一对短的重叠寡核苷酸合成的， 然后通过 PCR 扩增方法扩增由此得到的核苷酸， 从而完整获得可变区的人工克隆。
     本发明的另一方面涉及分离的脱氧核糖核酸 (DNA)， 其编码能够结合 hGM-CSF 并 中和 hGM-CSF 活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 其中所述分离的 DNA 包含 编码氨基酸的核苷酸序列， 所述氨基酸序列包含选自 SEQ ID NO ： 4 至 9 中的至少一个。本 发明还包括分离的 DNA， 其中核苷酸序列编码氨基酸序列， 其至少包含选自 SEQ ID NO ： 330 至 335 组成的组中的一个。
     当分离的脱氧核糖核酸 (DNA) 编码能够结合 hGM-CSF 并中和 hGM-CSF 生物活性的 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段时， 下面的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合 片段也包含在本发明中 ：
     能够在严格条件下与上述 DNA 杂交的分离的 DNA。
     下面的载体和宿主细胞也包括在本发明中 ：
     1) 掺有分离的 DNA 的载体。
     2) 有重组表达载体整合的宿主细胞。
     此外， 还可能通过表达多种 scFv( 可变区单链片段 ) 抗体获得特定抗体， 所述 scFv 抗体通过人工改组 (shuffling)VH 和 VL 基因以噬菌体融合蛋白形式制备， 利用最近开发的 噬菌体展示技术， 所述技术利用遗传工程技术在噬菌体表面表达重组抗体。
     可以通过本领域技术人员知道的任何方法得到本发明的抗体片段， 例如， 片段的 重组表达， 所述片段由编码抗体的 DNA 的截短的形式编码， 或通过蛋白水解抗体氨基酸链， 本领域技术人员藉由应用标准的生物学分析， 如本发明所述的分析， 来确定哪些片段维持 了抗原结合功能或中和活性。
     本发明的特定抗体
     本发明提供了 EV1018 抗体本身和 EV1018 抗体的多种变化 ( 如， 变体 )， 总结在表 A 中。 在某些实施方式中， 重链含有相对于野生型重链序列一处或多处氨基酸取代。 在一些 实施方式中， 轻链含有相对于野生型 EV1018 轻链序列一处或多处氨基酸取代。在一些实施 方式中， 重链和轻链各自含有一处或多处氨基酸取代。在一些实施方式中， 抗体或其抗原结合片段包含轻链， EV1018-wt-original(SEQ ID NO ： 34)， 和下述的重链变体之一 ： EV1018(SEQ ID NO ： 10)， EV1018-wt-IgG1KO(SEQ ID NO ： 11)， EV1018-T97A-IgG1KO(SEQ ID NO ： 12)， EV1018-T97V-IgG1KO(SEQ ID NO ： 13)， EV1018-N95D-IgG1KO(SEQ ID NO ： 14)， EV1018-N95E IgG1KO(SEQ ID NO ： 15)， EV1018-N95K IgG1KO(SEQ ID NO ： 16) ， EV1018-N95Q IgG1KO(SEQ ID NO ： 17) ， EV1018-N93Q-N95T IgG1KO(SEQ ID NO ： 18)， EV1018-wt IgG1-BI(SEQ ID NO ： 19)， EV1018-T97A IgG1-BI(SEQ ID NO ： 20)， EV1018-T97V IgG1-BI(SEQ ID NO ： 21)， EV1018-N95D IgG1-BI(SEQ ID NO ： 22)， EV1018-N95E IgG1-BI(SEQ ID NO ： 23)， EV1018-N95K IgG1-BI(SEQ ID NO ： 24) ， EV1018-N95Q IgG1-BI(SEQ ID NO ： 25) ， EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI(SEQ ID NO ： 26) ，EV1018-T97A IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 27) ，EV1018-T97V IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 28)， EV1018-N95D IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 29) ， EV1018-N95E IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 30) ， EV1018-N95K IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 31)， EV1018-N95Q IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 3 2 ) ，E V 1 0 1 8 - N 9 3 Q - N 9 5 T I g G 1 - o r i g i n a l - c o n s t a n t ( S E Q I D N O ： 33)， EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 38)， EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 39)， EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 40)， EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 41)EV1018-N95EIgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 42)， EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 43) ，EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 44) ，EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 45)， EV1018-wt IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 46)， EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 47) ，EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 48) ， EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 49)， EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 50)， EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 51)， EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 52) ， EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 53) ， EV1018-IgG2(SEQ ID NO ： 54) ，EV1018-wt-IgG2(SEQ ID NO ： 55) ，EV1018-T97A-IgG2(SEQ ID NO ： 56) ，EV1018-T97V-IgG2(SEQ ID NO ： 57) ，EV1018-N95D-IgG2(SEQ ID NO ： 58) ， EV1018-N95E-IgG2(SEQ ID NO ： 5 9 ) ，E V 1 0 1 8 - N 9 5 K - I g G 2 ( S E Q I D N O ： 60)， EV1018-N95Q-IgG2(SEQ ID NO ： 61) ，EV1018-N93Q-N95T-IgG2(SEQ ID NO ： 62) ， EV1018-IgG4(SEQ ID NO ： 63)， EV1018-wt-IgG4(SEQ ID NO ： 64)， EV1018-T97A-IgG4(SEQ ID NO ： 65) ， EV1018-T97V-IgG4(SEQ ID NO ： 66) ， EV1018-N95D-IgG4(SEQ ID NO ： 67) ，EV1018-N95E-IgG4(SEQ ID NO ： 68) ，EV1018-N95K-IgG4(SEQ ID NO ： 69) ， E V10 1 8 - N9 5Q -Ig G4 (SE Q ID NO ： 70 ) ，EV1 01 8-N 9 3Q- N 95T - Ig G 4 (S E Q I D N O ： 71) ，EV1018-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 72) ，EV1018-wt-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 73) ， EV1018-T97A-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 74) ，EV1018-T97V-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 75) ， EV1018-N95D-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 76) ，EV1018-N95E-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 77) ， EV1018-N95K-I gG4-SP(SEQ ID NO ： 78) ， EV1018-N95Q-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 79) 和 EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 80)。
     在一些实施方式中， 抗体或其抗原结合片段包含轻链， EV1018-wt-BI(SEQ ID NO ： 35)， 和下面的重链变体之一 ： EV1018(SEQ ID NO ： 10)， EV1018-wt-IgG1KO(SEQ ID NO ： 11)， EV1018-T97A-IgG1KO(SEQ ID NO ： 12)， EV1018-T97V-IgG1KO(SEQ ID NO ： 13)，EV1018-N95D-IgG1KO(SEQID NO ： 14)， EV1018-N95E IgG1KO(SEQ ID NO ： 15)， EV1018-N95K IgG1KO(SEQ ID NO ： 16)， EV1018-N95Q IgG1KO(SEQ ID NO ： 17)， EV1018-N93Q-N95T IgG1KO(SEQ ID NO ： 18)， EV1018-wtIgG1-BI(SEQ ID NO ： 19)， EV1018-T97A IgG1-BI(SEQ ID NO ： 20)， EV1018-T97V IgG1-BI(SEQ ID NO ： 21)， EV1018-N95D IgG1-BI(SEQ ID NO ： 22)， EV1018-N95E IgG1-BI(SEQ ID NO ： 23)， EV1018-N95K IgG1-BI(SEQ ID NO ： 24) ， EV1018 -N95Q IgG1-BI(SEQ ID NO ： 25) ， EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI(SEQ ID NO ： 26) ，EV1018-T97A IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 27) ，EV1018-T97V IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 28)， EV1018-N95D IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 29) ， EV1018-N95E IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 30) ， EV1018-N95K IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 31)， EV1018-N95Q IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 32) ，EV1018-N93Q-N95T IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 33) ， EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 38)， EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 39)， EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 40)， EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 41)， EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 42)， EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 43) ，EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 44) ，EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 45) ，EV1018-wt IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 46) ， EV1018-T97AIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 47)， EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 48)， EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 49)， EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 50)， EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 51)， EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 52) ，EV1018-N93Q-N95TIgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 53) ，EV1018-IgG2(SEQ ID NO ： 54) ，EV1018-wt-IgG2(SEQ ID NO ： 55) ，EV1018-T97A-IgG2(SEQ ID NO ： 56) ，EV1018-T97V-IgG2(SEQ ID NO ： 57) ，EV1018-N95D-IgG2(SEQ ID NO ： 58) ， E V 1 0 1 8 - N 95 E - I g G 2 ( S E Q I D N O ： 5 9 ) ，E V 1 0 1 8 - N 9 5 K - I g G 2 ( S E Q I D N O ： 60)， EV1018-N95Q-IgG2(SEQ ID NO ： 61) ，EV1018-N93Q-N95T-IgG2(SEQ ID NO ： 62) ， EV1018-IgG4(SEQ ID NO ： 63)， EV1018-wt-IgG4(SEQ ID NO ： 64)， EV1018-T97A-IgG4(SEQ ID NO ： 65) ， EV1018-T97V-IgG4(SEQ ID NO ： 66) ， EV1018-N95D-IgG4(SEQ ID NO ： 67) ，EV1018-N95E-IgG4(SEQ ID NO ： 68) ，EV1018-N95K-IgG4(SEQ ID NO ： 69) ， EV 1 0 1 8- N 9 5Q- Ig G4 (SE Q ID NO ： 7 0) ，E V10 18- N 93Q - N9 5 T -I g G 4( S E Q I D N O ： 71) ，EV1018-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 72) ，EV1018-wt-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 73) ， EV1018-T97A-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 74) ，EV1018-T97V-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 75) ， EV1018-N95D-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 76) ，EV1018-N95E-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 77) ， EV1018-N95K-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 78) ， EV1018-N95Q-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 79) 和 EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 80)。
     在一些实施方式中， 抗体或其抗原结合片段包含轻链， EV1018-wt-BI2(G1)(SEQ ID NO ： 36)， 和下述重链变体之一 ： EV1018(SEQ ID NO ： 10)， EV1018-wt-IgG1KO(SEQ ID NO ： 11)， EV1018-T97A-IgG1KO(SEQ ID NO ： 12)， EV1018-T97V-IgG1KO(SEQ ID NO ： 13)， EV1018-N95D-IgG1KO(SEQ ID NO ： 14)， EV1018-N95E IgG1KO(SEQ ID NO ： 15)， EV1018-N95K IgG1KO(SEQ ID NO ： 16) ， EV1018-N95Q IgG1KO(SEQ ID NO ： 17) ， EV1018-N93Q-N95T IgG1KO(SEQ ID NO ： 18)， EV1018-wt IgG1-BI(SEQ ID NO ： 19)， EV1018-T97A IgG1-BI(SEQID NO ： 20)， EV1018-T97V IgG1-BI(SEQ ID NO ： 21)， EV1018-N95D IgG1-BI(SEQ ID NO ： 22)， EV1018-N95E IgG1-BI(SEQ ID NO ： 23)， EV1018-N95K IgG1-BI(SEQ ID NO ： 24) ， EV1018-N95Q IgG1-BI(SEQ ID NO ： 25) ， EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI(SEQ ID NO ： 26) ，EV1018-T97A IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 27) ，EV1018-T97V IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 28)， EV1018-N95D IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 29) ， EV1018-N95E IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 30) ， EV1018-N95K IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 31)， EV1018-N95Q IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 32) ，EV1018-N93Q-N95T IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 33) ， EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 38)， EV1018-T97 A-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 39)， EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 40)， EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 41)， EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 42)， EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 43) ， EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 44) ， EV1018-N93Q-N95TIgG1KO-QVQL(SEQ ID NO ： 45) ， EV1018-wt IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 46) ， EV1018-T97 A IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 47) ， EV1018-T97 V IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 48) ， EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 49)， EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 50)， EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 51)， EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 52) ， EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 53) ， EV1018-IgG2(SEQ ID NO ： 54) ，EV1018-wt-IgG2(SEQ ID NO ： 55) ，EV1018-T97A-IgG2(SEQ ID NO ： 56) ，EV1018-T97V-IgG2(SEQ ID NO ： 57) ，EV1018-N95D-IgG2(SEQ ID NO ： 58) ， EV1018-N95E-IgG2(SEQ ID NO ： 5 9 ) ，E V 1 0 1 8 - N 9 5 K - I g G 2 ( S E Q I D N O ： 60)， EV1018-N95Q-IgG2(SEQ ID NO ： 61) ，EV1018-N93Q-N95T-IgG2(SEQ ID NO ： 62) ， EV1018-IgG4(SEQ ID NO ： 63)， EV1018-wt-IgG4(SEQ ID NO ： 64)， EV1018-T97A-IgG4(SEQ ID NO ： 65) ， EV1018-T97V-IgG4(SEQ ID NO ： 66) ， EV1018-N95D-IgG4(SEQ ID NO ： 67) ，EV1018-N95E-IgG4(SEQ ID NO ： 68) ，EV1018-N95K-IgG4(SEQ ID NO ： 69) ， EV 1018 - N95 Q-IgG 4(S EQ I D N O ： 70 ) ，EV10 18 -N93Q-N 95 T-IgG 4( SE Q I D N O ： 71) ，EV1018-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 72) ，EV1018-wt-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 73) ， EV1018-T97A-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 74) ，EV1018-T97V-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 75) ， EV1018-N95D-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 76) ，EV1018-N95E-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 77) ， EV1018-N95K-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 78) ， EV1018-N95Q-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 79) 和 EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 80)。
     在 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 轻 链， EV1018-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 37)， 和下述重链变体之一： EV1018(SEQ ID NO ： 10) ， EV1018-wt-IgG1KO(SEQ ID NO ： 11) ， EV1018-T97A-IgG1KO(SEQ ID NO ： 12) ， EV1018-T97V-IgG1KO(SEQ ID NO ： 13) ， EV1018-N95D-IgG1KO(SEQ ID NO ： 14) ， EV1018-N95E IgG1KO(SEQ ID NO ： 15) ，EV1018-N95K IgG1KO(SEQ ID NO ： 16) ， EV1018-N95Q IgG1KO(SEQ ID NO ： 17)， EV1018-N93Q-N95T IgG1KO(SEQ ID NO ： 18)， EV1018-wt IgG1-BI(SEQ ID NO ： 19)， EV1018-T97AIgG1-BI(SEQ ID NO ： 20)， EV1018-T97V IgG1-BI(SEQ ID NO ： 21) ，EV1018-N95D IgG1-BI(SEQ ID NO ： 22) ，EV1018-N95E IgG1-BI(SEQ ID NO ： 23) ，EV1018-N95K IgG1-BI(SEQ ID NO ： 24) ，EV1018-N95QIgG1-BI(SEQ ID NO ： 25)， EV1018-N93Q-N95TIgG1-BI(SEQ ID NO ： 26)， EV1018-T97A IgG1-original-constant (SEQ ID NO ： 27)， EV1018-T97V IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 28) ， EV1018-N95D IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 29) ， EV1018-N95E IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 30)， EV1018-N95K IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 31)， EV1018-N95Q IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 32)， EV1018-N93Q-N95T IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 33)， EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 38)， EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 39)， EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 40)， EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 41)， EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 42)， EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 43)， EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 44) ，EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL(SEQ ID NO ： 45) ，EV1018-wt IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 46)， EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 47)， EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 48)， EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 49)， EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 50)， EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 51)， EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 52)， EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI(SEQ ID NO ： 53)， EV1018-IgG2(SEQ ID NO ： 54)， EV1018-wt-IgG2(SEQ ID NO ： 55)， EV1018-T97A-IgG2(SEQ ID NO ： 56) ， EV1018-T97V-IgG2(SEQ ID NO ： 57) ， EV1018-N95D-IgG2(SEQ ID NO ： 58) ，EV1018-N95E-IgG2(SEQ ID NO ： 59) ，EV1018-N95K-IgG2(SEQ ID NO ： 60) ， EV1018-N95Q-IgG2(SEQ ID NO ： 61) ，EV1018-N93Q-N95T-IgG2(SEQ ID NO ： 62) ， EV1018-IgG4(SEQ ID NO ： 63)， EV1018-wt-IgG4(SEQ ID NO ： 64)， EV1018-T97A-IgG4(SEQ ID NO ： 65) ， EV1018-T97V-IgG4(SEQ ID NO ： 66) ， EV1018-N95D-IgG4(SEQ ID NO ： 67) ，EV1018-N95E-IgG4(SEQ ID NO ： 68) ，EV1018-N95K-IgG4(SEQ ID NO ： 69) ， E V10 1 8-N 9 5Q- I gG4 ( SEQ ID N O ： 7 0 ) ，EV1 01 8-N93 Q- N95T-Ig G4(S EQ ID N O ： 71) ，EV1018-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 72) ，EV1018-wt-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 73) ， EV1018-T97A-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 74) ，EV1018-T97V-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 75) ， EV1018-N95D-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 76) ，EV1018-N95E-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 77) ， EV1018-N95K-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 78) ， EV1018-N95Q-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 79) 和 EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP(SEQ ID NO ： 80)。
     本发明提供了多种抗体 ： EV1019 本身和 EV1019 抗体的变化， 总结在表 B 中。在某 些实施方式中， 重链含有相对于野生型重链序列的一处或多处氨基酸取代。在一些实施方 式中， 轻链含有相对于野生型 EV1019 轻链序列的一处或多处氨基酸取代。在一些实施方式 中， 重链和轻链各自含有一处或多处氨基酸取代。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019(SEQ ID NO ： 160)，和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ，EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ，EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ，EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-wt-IgG1-BI(SEQ ID NO ： 161)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-wt-IgG1KO(SEQ ID NO ： 162)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ，EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105G(SEQ ID NO ： 163)， 和选自下面的组的轻链： EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105G-IgG1-BI(SEQ ID NO ： 164)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 ： EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 2 0 2 ) ，E V 1 0 1 9 - w t - B I ( S E Q I D N O ： 203)， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204)， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205)， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206)， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208) ， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211)， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQID NO ： 213) ， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216)， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105G-IgG1KO(SEQ ID NO ： 165)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 ： EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 2 0 2 ) ，E V 1 0 1 9 - w t - B I ( S E Q I D N O ： 203)， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204)， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205)， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206)， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208) ， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211)， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213) ， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216)， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105S(SEQ ID NO ： 166)， 和选自下面的组的轻链： EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ IDNO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105S-IgG1-BI(SEQ ID NO ： 167)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 ： EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 2 0 2 ) ，E V 1 0 1 9 - w t - B I ( S E Q I D N O ： 203)， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204)， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205)， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206)， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208) ， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211)， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213) ， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216)， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105S-IgG1KO(SEQ ID NO ： 168)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 ： EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 2 0 2 ) ，E V 1 0 1 9 - w t - B I ( S E Q I D N O ： 203)，EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204)， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205)， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206)， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208) ， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211)， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213) ， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216)， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105A(SEQ ID NO ： 169)， 和选自下面的组的轻链： EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105A-IgG1-BI(SEQ ID NO ： 170)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 ： EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 2 0 2 ) ，E V 1 0 1 9 - w t - B I ( S E Q I D N O ： 203)， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204)， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205)， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206)， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208) ， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211)， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213) ， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216)， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105A-IgG1KO(SEQ ID NO ： 171)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 ： EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 2 0 2 ) ，E V 1 0 1 9 - w t - B I ( S E Q I D N O ： 203)， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204)， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205)， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206)， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208) ， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211)， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213) ， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216)， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105Q(SEQ ID NO ： 172)， 和选自下面的组的轻链： EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105Q-IgG1-BI(SEQ ID NO ： 173)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 ： EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 2 0 2 ) ，E V 1 0 1 9 - w t - B I ( S E Q I D N O ： 203)， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204)， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205)， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206)， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208) ， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211)， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213) ， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216)， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105Q-IgG1KO(SEQ ID NO ： 174)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105T(SEQ ID NO ： 175)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105T-IgG1-BI(SEQ ID NO ： 176)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 2 0 2 ) ，E V 1 0 1 9 - w t - B I ( S E Q I D N O ： 203)， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204)， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205)， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206)， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208) ， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211)， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213) ， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216)， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105T-IgG1KO(SEQ ID NO ： 177)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105M(SEQ ID NO ： 178)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105M-IgG1-BI(SEQ ID NO ： 179)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 2 0 2 ) ，E V 1 0 1 9 - w t - B I ( S E Q ID N O ： 203)， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204)， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205)， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206)， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQID NO ： 208) ， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211)， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213) ， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216)， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105M-IgG1KO(SEQ ID NO ： 180)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105L(SEQ ID NO ： 181)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105L-IgG1-BI(SEQ ID NO ： 182)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 2 0 2 ) ，E V 1 0 1 9 - w t - B I ( S E Q I D N O ： 203)， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204)， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205)， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206)， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208) ， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211)， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213) ， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216)， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中， 抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1 O19-C105L-IgG1KO(SEQ ID NO ： 183)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-IgG2(SEQ ID NO ： 222)，和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-wt-IgG4(SEQ ID NO ： 223)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-wt-IgG4SP(SEQ ID NO ： 224)， 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链，EV1019-C105G-IgG2(SEQ ID NO ： 225)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212) ， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105G-IgG4(SEQ ID NO ： 226)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105G-IgG4SP(SEQ ID NO ： 227)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105S-IgG2(SEQ ID NO ： 228)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 2 11) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105S-IgG4(SEQ ID NO ： 229)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105S-IgG4SP(SEQ ID NO ： 230)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105A-IgG2(SEQ ID NO ： 231)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105A-IgG4(SEQ ID NO ： 232)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105A-IgG4SP(SEQ ID NO ： 233)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105Q-IgG2(SEQ ID NO ： 234)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105Q-IgG4(SEQ ID NO ： 235)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105Q-IgG4SP(SEQ ID NO ： 236)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ，EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105T-IgG2(SEQ ID NO ： 237)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ IDNO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105T-IgG4(SEQ ID NO ： 238)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ，EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105T-IgG4SP(SEQ ID NO ： 239)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ IDNO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105M-IgG2(SEQ ID NO ： 240)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105M-IgG4(SEQ ID NO ： 241)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105M-IgG4SP(SEQ ID NO ： 242)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105L-IgG2(SEQ ID NO ： 243)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105L-IgG4(SEQ ID NO ： 244)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ，EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     在 本 发 明 的 一 些 实 施 方 式 中，抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链， EV1019-C105L-IgG4SP(SEQ ID NO ： 245)， 和选自下面的组的轻链 EV1019-wt-original(SEQ ID NO ： 202) ， EV1019-wt-BI(SEQ ID NO ： 203) ， EV1019-wt-BI2(SEQ ID NO ： 204) ， EV1019-wt-original-constant(SEQ ID NO ： 205) ， EV1019-N25S(SEQ ID NO ： 206) ， EV1019-N25S-BI2(SEQ ID NO ： 207)， EV1019-N25G(SEQ ID NO ： 208)， EV1019-N25G-BI2(SEQ ID NO ： 209) ， EV1019-N25T(SEQ ID NO ： 210) ， EV1019-N25T-BI2(SEQ ID NO ： 211) ， EV1019-N25R(SEQ ID NO ： 212)， EV1019-N25R-BI2(SEQ ID NO ： 213)， EV1019-N25Q(SEQ ID NO ： 214) ， EV1019-N25Q-BI2(SEQ ID NO ： 215) ， EV1019-S27N(SEQ ID NO ： 216) ， EV1019-S27N-BI2(SEQ ID NO ： 217)， EV1019-S27G(SEQ ID NO ： 218)， EV1019-S27G-BI2(SEQ ID NO ： 219)， EV1019-S27A(SEQ ID NO ： 220) 和 EV1019-S27A-BI2(SEQ ID NO ： 221)。
     此外， 重链可变区和轻链可变区可以组合得到结合抗原的 Fab 片段。这样的组合 保留了相同或等效的抗原结合亲和力， 可用于产生多种版本的抗原结合片段， 如单链可变 片段 (scFv)。scFv 是免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区的融合物， 二者通过短的 ( 通 常是丝氨酸， 甘氨酸 ) 接头连接在一起， 这在本领域是公知的。
     相应地， EV1018 重链可变区可以与 EV1018 轻链可变区组合。在一些实施方式中， 重链和 / 或轻链可变区可以是变体， 所述变体与链的野生型序列相比包含一处或多处氨基 酸改变。类似地， EV1019 重链可变区可以与 EV1019 轻链可变区组合。在一些实施方式中， 重链和 / 或轻链可变区可以是变体， 所述变体与链的野生型序列相比包含一处或多处氨基 酸改变。
     在 一 些 实 施 方 式 中， 下 列 EV1018 重 链 可 变 区 中 的 任 一 个 ( 如， 野生型及 其 变 体 ) 可 以 与 轻 链 可 变 区 EV1018-VL-wt-original(SEQ ID NO ： 364) 组 合 形 成 与 hGM-CSF 结 合 的 抗 原 结 合 片 段 ： EV1018-VH(SEQ ID NO ： 348)， EV1018-VH-wt(SEQ ID NO ： 349) ，EV1018-VH-T97A(SEQ ID NO ： 350) ，EV1018-VH-T97V(SEQ ID NO ： 351) ，EV1018-VH-N95D(SEQ ID NO ： 352) ，EV1018-VH-N95E(SEQ ID NO ： 3 53) ， EV1018-VH-N95K(SEQ ID NO ： 3 5 4 ) ，E V 1 0 1 8 - V H - N 9 5 Q ( S E Q I D N O ： 355)， EV1018-VH-N93Q-N95T(SEQ ID NO ： 356)， EV1018-VH-T97A IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 3 5 7 ) ，E V 1 0 1 8 - V H - T 9 7 V I g G 1 - o r i g i n a l - c o n s t a n t ( S E Q I D N O ： 3 5 8 ) ，E V 1 0 1 8 - V H - N 9 5 D I g G 1 - o r i g i n a l - c o n s t a n t ( S E Q I D N O ： 3 5 9 ) ，E V 1 0 1 8 - V H - N 9 5 E I g G 1 - o r i g i n a l - c o n s t a n t ( S E Q I D N O ： 360)， EV1018-VH-N95K IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 361) ，EV1018-VH-N95Q IgG1-original-constan t(SEQ ID NO ： 362)， 和 EV1018-VH-N93Q-N95T IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 363)。
     在 一 些 实 施 方 式 中， 下 列 EV1018 重 链 可 变 区 中 的 任 一 个 ( 如， 野生型 及 其 变 体 ) 可 以 与 轻 链 可 变 区 EV1018-VL-wt-BI(SEQ ID NO ： 365) 组 合， 形成与 hGM-CSF 结 合 的 抗 原 结 合 片 段 ： EV1018-VH(SEQ ID NO ： 348)， EV1018-VH-wt(SEQID NO ： 349) ，EV1018-VH-T97A(SEQ ID NO ： 350) ，EV1018-VH-T97V(SEQ ID NO ： 351) ，EV1018-VH-N95D(SEQ ID NO ： 352) ，EV1018-VH-N95E(SEQ ID NO ： 353) ， EV1018-VH-N95K(SEQ ID NO ： 3 5 4 ) ，E V 1 0 1 8 - V H - N 9 5 Q ( S E Q I D N O ： 355)， EV1018-VH-N93Q-N95T(SEQ ID NO ： 356)， EV1018-VH-T97A IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 3 5 7 ) ，E V 1 0 1 8 - V H - T 9 7 V I g G 1 - o r i g i n a l - c o n s t a n t ( S E Q I D N O ： 3 5 8 ) ，E V 1 0 1 8 - V H - N 9 5 D I g G 1 - o r i g i n a l - c o n s t a n t ( S E Q I D N O ： 359)， EV1018-VH-N95E IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 360)， EV1018-VH-N95K IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 361) ，EV1018-VH-N95Q IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 362)， 和 EV1018-VH-N93Q-N95T IgG1-original-constant(SEQ ID NO ： 363)。
     同 样 地， 在 一 些 实 施 方 式 中， EV1019 的 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链 可 变 区， EV1019-VH-wt(SEQ ID NO ： 152) 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 可 变 区 ： EV1019-VL-wt(SEQ ID NO ： 184) ，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO ： 185) ，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO ： 186) ，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO ： 187) ，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO ： 188) ，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO ： 189) ，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO ： 190) ，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO ： 191) ，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO ： 192) ，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO ： 193) ，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO ： 194) ，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO ： 195) ，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO ： 196) ，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO ： 197) ，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO ： 198) ， EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO ： 199) ，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO ： 200) ， EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO ： 201)。
     在 一 些 实 施 方 式 中， EV1019 的 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链 可 变 区， EV1019-VH-C105G(SEQ ID NO ： 153) 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 可 变 区 ： EV1019-VL-wt(SEQ ID NO ： 184) ，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO ： 185) ，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO ： 186) ，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO ： 187) ，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO ： 188) ，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO ： 189) ，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO ： 190) ，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO ： 191) ，EV1019 -VL-N25R(SEQ ID NO ： 192) ，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO ： 193) ，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO ： 194) ，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO ： 195) ，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO ： 196) ，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO ： 197) ， EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO ： 198) ， EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO ： 199) ，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO ： 200) ， EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO ： 201)。
     在 一 些 实 施 方 式 中， EV1019 的 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链 可 变 区， EV1019-VH-C105S(SEQ ID NO ： 154) 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 可 变 区 ： EV1019-VL-wt(SEQ ID NO ： 184) ，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO ： 185) ，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO ： 186) ，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO ： 187) ，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO ： 188) ，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO ： 189) ，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO ： 190) ，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO ： 191) ，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO ： 192) ，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO ： 193) ，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO ：194) ，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO ： 195) ，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO ： 196) ， EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO ： 197) ，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO ： 198) ， EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO ： 199) ，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO ： 200) ， EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO ： 201)。
     在 一 些 实 施 方 式 中， EV1019 的 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链 可 变 区， EV1019-VH-C105A(SEQ ID NO ： 155) 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 可 变 区 ： EV1019-VL-wt(SEQ ID NO ： 184) ，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO ： 185) ，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO ： 186) ，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO ： 187) ，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO ： 188) ，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO ： 189) ，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO ： 190) ，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO ： 191) ，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO ： 192) ，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO ： 193) ，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO ： 194) ，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO ： 195) ，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO ： 196) ， EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO ： 197) ，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO ： 198) ， EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO ： 199) ，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO ： 200) ， EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO ： 201)。
     在 一 些 实 施 方 式 中， EV1019 的 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链 可 变 区， EV1019-VH-C105T(SEQ ID NO ： 156) 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 可 变 区 ： EV1019-VL-wt(SEQ ID NO ： 184) ，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO ： 185) ，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO ： 186) ，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO ： 187) ，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO ： 188) ，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO ： 189) ，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO ： 190) ，EV1019-VL-BI-N25 T(SEQ ID NO ： 191) ，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO ： 192) ，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO ： 193) ，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO ： 194) ，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO ： 195) ，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO ： 196) ，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO ： 197) ，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO ： 198) ， EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO ： 199) ，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO ： 200) ， EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO ： 201)。
     在 一 些 实 施 方 式 中， EV1019 的 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链 可 变 区， EV1019-VH-C105M(SEQ ID NO ： 157) 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 可 变 区 ： EV1019-VL-wt(SEQ ID NO ： 184) ，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO ： 185) ，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO ： 186) ，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO ： 187) ，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO ： 188) ，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO ： 189) ，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO ： 190) ，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO ： 191) ，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO ： 192) ，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO ： 193) ，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO ： 194) ，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO ： 195) ，EV1019-VL-S27N(S EQ ID NO ： 196) ，EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO ： 197) ，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO ： 198) ， EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO ： 199) ，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO ： 200) ， EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO ： 201)。
     在 一 些 实 施 方 式 中， EV1019 的 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链 可 变 区， EV1019-VH-C105Q(SEQ ID NO ： 158) 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 可 变 区 ： EV1019-VL-wt(SEQID NO ： 184) ，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO ： 185) ，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO ： 186) ，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO ： 187) ，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO ： 188) ，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO ： 189) ，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO ： 190) ，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO ： 191) ，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO ： 192) ，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO ： 193) ，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO ： 194) ，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO ： 195) ，EV1019-VL-S27N(SEQ ID N O ： 196) ， EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO ： 197) ，EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO ： 198) ， EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO ： 199) ，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO ： 200) ， EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO ： 201)。
     在 一 些 实 施 方 式 中， EV1019 的 抗 原 结 合 片 段 包 含 重 链 可 变 区， EV1019-VH-C105L(SEQ ID NO ： 159) 和 选 自 下 面 的 组 的 轻 链 可 变 区 ： EV1019-VL-wt(SEQ ID NO ： 184) ，EV1019-VL-BI(SEQ ID NO ： 185) ，EV1019-VL-N25S(SEQ ID NO ： 186) ，EV1019-VL-BI-N25S(SEQ ID NO ： 187) ，EV1019-VL-N25G(SEQ ID NO ： 188) ，EV1019-VL-BI-N25G(SEQ ID NO ： 189) ，EV1019-VL-N25T(SEQ ID NO ： 190) ，EV1019-VL-BI-N25T(SEQ ID NO ： 191) ，EV1019-VL-N25R(SEQ ID NO ： 192) ，EV1019-VL-BI-N25R(SEQ ID NO ： 193) ，EV1019-VL-N25Q(SEQ ID NO ： 194) ，EV1019-VL-BI-N25Q(SEQ ID NO ： 195) ，EV1019-VL-S27N(SEQ ID NO ： 196) ， EV1019-VL-BI-S27N(SEQ ID NO ： 197) ， EV1019-VL-S27G(SEQ ID NO ： 198) ， EV1019-VL-BI-S27G(SEQ ID NO ： 199) ，EV1019-VL-S27A(SEQ ID NO ： 200) ， EV1019-VL-BI-S27A(SEQ ID NO ： 201)。
     本发明的变体
     当两种或更多种全长抗 hGM-CSF 抗体或其抗原结合部分， 或抗 hGM-CSF 抗体的一 部分同时施用时， 它们也包括本发明中。因此， 识别 hGM-CSF 的双特异性抗体， 和多特异性 抗体也包括在本发明中。
     上面的描述中解释了抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分的变化， 但是描述 的特征在本领域可以被取代或改变， 而不背离本发明的范围。
     也就是说， 下列抗体或其抗原结合部分包括在本发明的范围内 ：
     (I) 全长抗体及其抗原结合部分
     (II) 抗体的一部分， 和
     (III) 能够特异结合 hGM-CSF 并中和其生物活性的重组人单克隆抗体， 单克隆抗 体 ( 包括嵌合抗体和人源化抗体 )， 或其抗原结合部分， 其中所述重组人单克隆抗体是通过 任何公知的技术得到的， 基于 SEQ ID NO ： 4-9 和 330-335， SEQ ID NO ： 364 和 365， 以及 SEQ ID NO ： 348-363， SEQ ID NO ： 184-201 和 SEQ ID NO ： 152-159 的氨基酸序列， 其代表可变区 和 CDR。
     当按上述方法产生的特定的抗体或其抗原结合部分基于选自在此描述的 SEQ ID NO ： 4-9， 或 330-335 组成的每个组中的至少一种氨基酸序列来应用时， 所述抗体或其抗原 结合部分也包括在本发明中。
     抗体变体列表
     下面的表分别提供了 EV1018 和 EV1019 抗体有用的抗体链和片段的列表。表A： EV1018 抗体的重链和轻链变体以及可变区列表
     表B： EV1019 抗体的重链和轻链变体以及可变区列表
     本发明的各种实施方式
     下面详细介绍本发明的实施方式。 所述实施方式的描述是以专利权利要求撰写的 方式整理的， 因为看起来它在例示说明书中的教导方面是有用的， 根据所述教导， 可以得出 本专利申请赋予的保护范围。
     项 1. 一 个 实 施 方 式 是 分 离 的 抗 hGM-CSF 单 克 隆 抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段， 其 中 抗 体 或 其 抗 原 结 合 片 段 识 别 hGM-CSF(SEQ ID NO ： 1) 中 的 ELYK(SEQ ID NO ： 2) 和 TMMASHYKQH(SEQ ID NO ： 3)。
     项 2. 另一实施方式是分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 其特征在 于所述抗体包含 ：
     (a) 重链， 其包含含有 VH-CDR1 的共有序列， 含有 VH-CDR2 的共有序列， 和有 VH-CDR3 含的共有序列， 其中 ：
     (i) 含有 VH-CDR1 的共有序列是 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A，
     (ii) 含有 VH-CDR2 的共有序列是 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其 中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K， 且
     (iii) 含有 VH-CDR3 的共有序列是 EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G ； 和
     (b) 轻链， 其包含含有 VL-CDR1 的共有序列， 含有 VL-CDR2 的共有序列， 和含有 VL-CDR3 的共有序列， 其中 ：
     (i) 含有 VL-CDR1 的共有序列是 XnGNXnXnNIGSX11AVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， 且 X11 是 H 或 Y，
     (ii) 含有 VL-CDR2 的共有序列是 GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P， 和
     (iii) 含有 VL-CDR3 的共有序列是 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其中 X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L。在进一步的实施方式中， 项 1 或 2 的抗体或抗原结合片段特异结合 hGM-CSF， 优选地 KD 小于 450pM。
     项 3. 另一实施方式是项 1 或 2 公开的抗体或其抗原结合片段， 除了项 1 和 2 提供
     的特征之外， 其结合人 GM-CSF 的 KD 小于 400pM。
     项 4. 另一实施方式是项 3 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中 KD 小于 160pM。
     项 5. 另一实施方式是项 1-4 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中所述抗 体或其抗原结合片段中和 hGM-CSF 活性， 从而使得在 TF-1 增殖分析中 ED80 时确定的抗体 或其抗原结合片段 IC50 值小于 100pM。
     项 6. 另一实施方式是项 5 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中所述 IC50 值小于 40pM 或小于 30pM 或小于 25pM。进一步优选的本发明的抗体或其抗原结合片段， 在 TF-1 增 殖分析中 ED80 时确定的 IC50 值确实小于 20pM， 小于 25pM， 小于 30pM， 或小于 40pM。
     项 7. 另一实施方式是项 5 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中所述 IC50 值小于 20pM。
     项 8. 另一实施方式是项 1 至 7 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中重链 选自伽玛 1(γ1)， 伽玛 2(γ2)， 伽玛 3(γ3)， 和伽玛 4(γ4) 组成的组。
     项 9. 另一实施方式是项 1 至 8 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中重链 具有选自 SEQ ID NO ： 10-33， 38-80， 160-183， 222-244 和 245 组成的组的氨基酸序列。
     项 10. 另一实施方式是项 1 至 9 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中轻 链是 λ 轻链。
     项 11. 另一实施方式是项 10 中公开的抗体或其抗原结合片段， 其中 λ 轻链包含 下列氨基酸取代 ： R100G 或 A153G 中的至少一个或两个。
     项 12. 另一实施方式是项 1 至 11 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中轻 链具有选自 SEQ ID NO ： 34-37， 202-220 和 221 组成的组的氨基酸序列。
     项 13. 另一实施方式是项 1 至 9 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中轻 链是 κ 轻链。
     项 14. 另一实施方式是项 1 至 13 中任一项公开的抗体， 其中重链选自伽玛伽玛 1(γ1)， 伽玛 2(γ2)， 伽玛 3(γ3)， 和伽玛 4(γ4) 组成的组， 且其中轻链是 λ 轻链。
     项 15. 另一实施方式是项 1 至 13 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中重 链包含选自 Q3E， T97A， T97V， N95D， N95E， N95K， N95Q， N93Q/N95T， K144R， L164A， 和 L165A 组 成的组的一处或多处氨基酸取代。
     项 16. 另一实施方式是项 1 至 15 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中 VH-CDR1 包含氨基酸序列 SYGMH(SEQ ID NO ： 4) 或 SHAMH(SEQ ID NO ： 333)。
     项 17. 另一实施方式是项 1 至 16 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中 VH-CDR2 包含氨基酸序列 LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO ： 5) 或 VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO ： 334)。
     项 18. 另一实施方式是项 1 至 17 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中 VH-CDR3 包含氨基酸序列 ESMGAINDN(SEQ ID NO ： 6) 或 EWVGGTCDS(SEQ ID NO ： 335)。
     项 19. 另一实施方式是项 1 至 18 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中 VL-CDR1 包含氨基酸序列 IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO ： 7) 或 SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO ： 330)。
     项 20. 另一实施方式是项 1 至 19 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中 VL-CDR2 包含氨基酸序列 GRSPPS(SEQ ID NO ： 8) 或 GKSPAS(SEQ ID NO ： 331)。项 21. 另一实施方式是项 1 至 20 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中 VL-CDR3 包含氨基酸序列 STWDSSLSAVV(SEQ ID NO ： 9) 或 STWDSRLSAVL(SEQ ID NO ： 332)。
     项 22. 另一实施方式是分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 其中所 述抗体或其抗原结合片段包含 6 个不同的 CDR， 其中 6 个 CDR 的序列是 SEQ ID NO ： 4-9。在 进一步的实施方式中， 项 22 所述的抗体或抗原结合片段确实特异结合 hGM-CSF， 优选地 KD 小于 450pM， 优选为 400pM 或 160pM。
     项 22A. 另一实施方式是如项 1 公开的分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结 合片段， 与项 2-22 中任一项公开的分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段组合。
     项 23. 另一实施方式是项 22 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中所述的抗体包含 (i) 选自伽玛 1(γ1)， 伽玛 2(γ2)， 伽玛 3(γ3)， 和伽玛 4(γ4) 组成的组的重链或其片段， 和 (ii) 轻链， 其是 κ 轻链。
     项 24. 另一实施方式是项 22 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中所述的抗体包含 (i) 选自伽玛 1(γ1)， 伽玛 2(γ2)， 伽玛 3(γ3)， 和伽玛 4(γ4) 组成的组的重链或其片段， 和 (ii) 轻链， 其是 λ 轻链。
     项 25. 另一实施方式是分离的特异结合于 hGM-CSF 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其 抗原结合片段， 其中所述抗体或其抗原结合片段包含 6 个不同的 CDR， 其中 6 个 CDR 的序列 是 SEQ ID NO ： 330-335。
     项 26. 另一实施方式是项 25 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中所述的抗体包含 (i) 选自伽玛 1(γ1)， 伽玛 2(γ2)， 伽玛 3(γ3)， 和伽玛 4(γ4) 组成的组的重链或其片段， 和 (ii) 轻链， 其是 κ 轻链。
     项 27. 另一实施方式是项 25 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中所述的抗体包含 (i) 选自伽玛 1(γ1)， 伽玛 2(γ2)， 伽玛 3(γ3)， 和伽玛 4(γ4) 组成的组的重链， 和 (ii) 轻链， 其是 λ 轻链。
     项 28. 另一实施方式是项 1 至 27 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 进一步 包含信号序列。
     项 29. 另一实施方式是项 28 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中信号序列选自 SEQ ID NO ： 324， 325 和 326 组成的组。
     项 30. 另一实施方式是分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 所述的 抗体包含具有重链序列的重链和具有轻链序列的轻链， 其中所述重链序列是 SEQ ID NO ： 10 或其选自 SEQ ID NO ： 11-33， 38-79 和 80 组成的组的变体， 且其中所述轻链序列是 SEQ ID NO ： 34。
     项 31. 另一实施方式是分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 所述的 抗体包含具有重链序列的重链和具有轻链序列的轻链， 其中所述重链序列是 SEQ ID NO ： 10 或其选自 SEQ ID NO ： 11-33， 38-79 和 80 组成的组的变体， 且其中所述轻链序列是 SEQ ID NO ： 35。
     项 32. 另一实施方式是分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 所述的 抗体包含具有重链序列的重链和具有轻链序列的轻链， 其中所述重链序列是 SEQ ID NO ： 10 或其选自 SEQ ID NO ： 11-33， 38-79 和 80 组成的组的变体， 且其中所述轻链序列是 SEQ ID NO ： 36。项 33. 另一实施方式是分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 所述的 抗体包含具有重链序列的重链和具有轻链序列的轻链， 其中所述重链序列是 SEQ ID NO ： 10 或其选自 SEQ ID NO ： 11-33， 38-79 和 80 组成的组的变体， 且其中所述轻链序列是 SEQ ID NO ： 37。
     项 34. 另一实施方式是分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 所述的 抗体包含具有重链序列的重链和具有轻链序列的轻链， 其中所述重链序列是 SEQ ID NO ： 160 或其选自 SEQ ID NO ： 161-244 和 SEQ ID NO ： 245 组成的组的变体， 且其中所述轻链序 列是 SEQ ID NO ： 202 或其选自 SEQ ID NO ： 203-220 和 SEQ ID NO ： 221 组成的组的变体。
     项 35. 另一实施方式是分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 所述的 抗体包含重链可变区， 其中所述重链可变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 152 或其选自 SEQ ID NO ： 153-158 和 SEQ ID NO ： 159 组成的组的变体， 和轻链可变区， 其中所述轻链可变区的 的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 184 或其选自 SEQ ID NO ： 185-200 和 SEQ ID NO ： 201 组成的 组的变体。
     项 36. 另一实施方式是如项 35 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中重链可变区的 氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 152。
     项 37. 另一实施方式是如项 35 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中轻链可变区的 氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 184。
     项 38. 另一实施方式是如项 35 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中重链可变区的 氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 152， 且其中轻链可变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 184。
     项 39. 另一实施方式是项 35-38 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中所 述的抗体属于 IgG1(λ) 类 ( 亚类 )。
     项 40. 另一实施方式是分离的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段， 所述的 抗体包含重链可变区， 其中所述重链可变区的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 348 或其选自 SEQ ID NO ： 349-362 和 SEQ ID NO ： 363 组成的组的变体， 和轻链可变区， 其中所述轻链可变区的 的氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 364 或 SEQ ID NO ： 365。
     项 41. 另一实施方式是如项 40 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中重链可变区的 氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 348。
     项 42. 另一实施方式是如项 40 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中轻链可变区的 氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 364。
     项 43. 另一实施方式是如项 40 公开的抗体或其抗原结合片段， 其中轻链可变区的 氨基酸序列是 SEQ ID NO ： 365。
     项 44. 另一实施方式是项 40-43 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段， 其中所 述的抗体属于 IgG1(λ) 类 ( 亚类 )。
     项 45. 另一实施方式是分离的核酸， 其编码项 1-44 中任一项公开的抗 hGM-CSF 单 克隆抗体或其抗原结合片段。
     项 46. 另一实施方式是项 45 中公开的核酸， 其中所述核酸是 DNA。
     项 47. 另一实施方式是包含项 46 中公开的 DNA 的载体。
     项 48. 另一实施方式是包含项 47 中公开的载体的宿主细胞， 其中所述载体是表达 载体。项 49. 另一实施方式是试剂盒， 包含 ： (a) 项 1-44 中任一项公开的抗体或其抗原 结合片段 ； 和 (b) 含有所述抗体或其抗原结合片段的一个或多个容器。
     项 50. 另一实施方式是项 1-44 中任一项公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原 结合片段， 用于药物。
     项 51. 另一实施方式是组合物， 包含项 1-44 中任一项公开的抗体或其抗原结合片 段， 和药学上可接受的载体 .
     项 52. 另一实施方式是项 51 中公开的组合物， 进一步包含第二种结合 hGM-CSF 的 分离的抗体或其抗原结合片段， 从而使得所述组合物包含多种所述的抗体， 多种所述的抗 原结合片段， 或至少一种所述的抗体和至少一种所述的抗原结合片段， 他们中的每一个均 结合 hGM-CSF。
     项 53. 另一实施方式是项 52 中公开的组合物， 其中至少一种抗体或其抗原结合片 段是具有选自 SEQ ID NO ： 10-80， 152-245， 320-323， 348-364 和 365 组成的组的序列的多 肽。
     项 54. 另一实施方式是试剂盒， 包含项 51-53 中任一项公开的组合物， 和一个或多 个包含所述组合物的容器。
     项 55. 另一实施方式是项 49 或项 54 公开的试剂盒， 进一步包含说明书。
     项 56. 另一实施方式是项 1-44 和 51-53 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段 或组合物， 用于制造或制备治疗与受试者 hGM-CSF 过表达相关的疾病或病症的药物， 其中 所述抗体或其抗原结合片段结合 hGM-CSF 并能够中和 hGM-CSF 活性。
     项 57. 另一实施方式是项 56 公开的用途， 其中疾病或病症选自慢性阻塞性肺疾病 (COPD)， 哮喘， 囊性纤维化病， 间质性肺病， 鼻炎， 关节炎及相关关节病， 银屑病， 髓系白血病 和多发性硬化组成的组。
     项 58. 另一实施方式是项 56 或 57 公开的用途， 其中抗体或抗原结合片段以不超 过 500mg 的剂量施用给受试者。
     项 59. 另一实施方式是项 1-44 和 51-53 中任一项公开的抗体或其抗原结合片段 或其组合物在治疗与受试者 hGM-CSF 过表达相关的疾病或病症中的用途， 其中所述抗体或 其抗原结合片段结合 hGM-CSF 并能够中和 hGM-CSF 活性。
     项 60. 另一实施方式是项 59 公开的用途， 其中疾病或病症选自慢性阻塞性肺疾病 (COPD)， 哮喘， 囊性纤维化病， 间质性肺病， 鼻炎， 关节炎及相关关节病， 银屑病， 髓系白血病 和多发性硬化组成的组。
     项 61. 另一实施方式是项 59 或 60 公开的用途， 其中抗体或抗原结合片段以不超 过 500mg 的剂量施用给受试者。
     项 62. 另一实施方式是如 SEQ ID NO ： 2 和 3 所示的多肽中 hGM-CSF 的表位， 其 中所述表位被项 22 或 25 公开的抗体或其抗原结合片段识别， 且其中所述多肽序列表示 hGM-CSF(SEQ ID NO ： 1) 的不连续的片段。
     项 63. 另一实施方式是表位， 所述表位是人 GM-CSF 的不连续的片段， 其中所述表 位包含人 GM-CSF(SEQ ID NO ： 1)77-80 氨基酸残基和人 GM-CSF(SEQ ID NO ： 1)95-104 氨基 酸残基， 被抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合片段识别， 所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其 抗原结合片段包含 SEQ ID NO ： 4-9 或 SEQ ID NO ： 330-335 所示的 6 个不同的 CDR。项 64. 另一实施方式是在宿主细胞中产生与 hGM-CSF 结合的抗 hGM-CSF 单克隆抗 体或其抗原结合片段的方法， 其中所述抗体或其抗原结合片段至少含有含有 VH-CDR1 的共 有序列， 含有 VH-CDR2 的共有序列， 含有 VH-CDR3 的共有序列， 含有 VL-CDR1 的共有序列， 含 有 VL-CDR2 的共有序列， 和含有 VL-CDR3 的共有序列， ， 所述方法包括 ：
     (i) 获得包含至少一种 DNA 序列的宿主细胞， 所述 DNA 序列至少编码含有 VH-CDR1 的共有序列， 含有 VH-CDR2 的共有序列， 含有 VH-CDR3 的共有序列， 含有 VL-CDR1 的共有序列， 含有 VL-CDR2 的共有序列， 和含有 VL-CDR3 的共有序列， 其中 ：
     (a) 含有 VH-CDR1 的共有序列是 FTFSX1X2MH(SEQ ID NO ： 314)， 其中 X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A，
     (b) 含有 VH-CDR2 的共有序列是 X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G(SEQ ID NO ： 315)， 其中 每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K，
     (c) 含有 VH-CDR3 的共有序列是 EXnX9GX10XnXnDXn(SEQ ID NO ： 316)， 其中每个 Xn 相 互独立地是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G，
     (d) 含有 VL-CDR1 的共有序列是 XnGNXnXnNIGSXnAVG(SEQ ID NO ： 317)， 其中每个 Xn 相互独立地是任何天然存在的氨基酸， 且 Xn 是 H 或 Y，
     (e) 含有 VL-CDR2 的共有序列是 GX12SPX13SG(SEQ ID NO ： 318)， 其中 X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P， 且
     (f) 含有 VL-CDR3 的共有序列是 STWDSX14LSAVX15(SEQ ID NO ： 319)， 其中 X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L ； 和
     (ii) 在适合所述 DNA 表达和产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述宿主 细胞。
     项 65. 另一实施方式是项 64 公开的方法， 其中至少一种 DNA 编码重链或其部分 和轻链或其部分， 其中重链或其部分具有选自 SEQ ID NO ： 10-33， 38-80， 152-183， 222-245， 348-362 和 363 组 成 的 组 的 序 列， 且 其 中 轻 链 或 其 部 分 具 有 选 自 SEQ ID NO ： 34-37， 184-221， 364 和 365 组成的组的序列。
     项 66. 另一实施方式是项 64 或 65 公开的方法， 进一步包括分离抗体或其抗原结 合片段。
     项 67. 另一实施方式是项 64-66 中任一项公开的方法， 进一步包括制备包含所述 抗体或其抗原结合片段和药学上可接受载体的组合物。
     项 68. 另一实施方式是载体， 其包含编码 VH-CDR1， VH-CDR2 和 VH-CDR3 的 DNA 序列， 其中 ：
     V H-CDR1 是 SYGMH(SEQ ID NO ： 4) 或 SHAMH(SEQ ID NO ： 333) ， V H-CDR2 是 LTYHHGNRKFYADSVRG(SEQ ID NO ： 5) 或 VIWHDGSKKYYADSVKG(SEQ ID NO ： 334)， 且
     VH-CDR3 是 ESMGAINDN(SEQ ID NO ： 6) 或 EWVGGTCDS(SEQ ID NO ： 335)。
     项 69. 另一实施方式是载体， 其包含编码 VH-CDR1， VH-CDR2 和 VH-CDR3 的 DNA 序列， 其中 ：
     VL-CDR1 是 IGNNNNIGSHAVG(SEQ ID NO ： 7) 或 SGNSSNIGSYAVG(SEQ ID NO ： 330) ；
     VL-CDR2 是 GRSPPSG(SEQ ID NO ： 8) 或 GKSPASG(SEQ ID NO ： 331) ； 且VL-CDR3 是 STWDSSLSAVV(SEQ ID NO ： 9) 或 STWDSRLSAVL(SEQ ID NO ： 332)。
     项 70. 另一实施方式是鉴定与项 62 或 63 公开的表位结合的分子的方法， 包括
     (i) 用包含所述表位的探针接触生物样品或肽库 ；
     (ii) 分离特异结合所述探针的分子 ； 以及
     (iii) 鉴定所述分子。
     项 71. 另一实施方式是项 70 公开的方法， 进一步包括
     (iv) 产生 (iii) 的分子。
     项 72. 另一实施方式是项 70 或 71 公开的方法， 其中所述分子是抗 hGM-CSF 单克 隆抗体或其抗原结合片段 .
     项 73. 另一实施方式是项 70-72 中任一项公开的方法， 其中所述探针进一步包含 可检测的标记。
     项 74. 另一实施方式是项 70-73 中任一项公开的方法， 其中所述探针经固定化。
     项 75. 另一实施方式是能够结合 hGM-CSF(hGM-CSF) 并中和 hGM-CSF(hGM-CSF) 生 物活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其特征在于所述抗 hGM-CSF 单克隆抗 体或其抗原结合部分具有互补决定区 (CDR)， 其由选自 SEQ ID NO ： 4 至 9 组成的组的一种 或多种氨基酸序列表示。
     项 76. 另一实施方式是能够结合 hGM-CSF(hGM-CSF) 并中和 hGM-CSF(hGM-CSF) 生 物活性的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其特征在于所述抗 hGM-CSF 单克隆抗 体或其抗原结合部分具有互补决定区 (CDR)， 其由选自 SEQ ID NO ： 330 至 335 组成的组的 一种或多种氨基酸序列表示。
     项 77. 另一实施方式是项 75 或 76 公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部 分， 其特征在于所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分具有氨基酸序列， 其中互补 决定区 (CDR) 中的一个或多个氨基酸被取代， 缺失， 插入或添加。
     项 78. 另一实施方式是项 75-77 中任一项公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原 结合部分， 其特征在于当 TF-1 细胞通过 hGM-CSF 的诱导增殖时， 所述抗 hGM-CSF 单克隆抗 体或其抗原结合部分在浓度约为 14pM 时， 抑制约 50％的 TF-1 细胞增殖。
     项 79. 另一实施方式是项 78 中公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其特征在于所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分抑制外周血树突细胞的增殖。
     项 80. 另一实施方式是项 78 中公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其特征在于所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分具有对 hGM-CSF 的高亲和力， KD -10 值为 4×10 M 或更低。
     项 81. 另一实施方式是项 75-80 中任一项公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原 结合部分， 其特征在于所述抗体属于 IgG1(λ) 类 ( 亚类 )。
     项 82. 另一实施方式是项 75-81 中任一项公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原 结合部分， 其特征在于所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体是人单克隆抗体。
     项 83. 另一实施方式是用于 hGM-CSF 引起的疾病的药物组合物， 包含 ： 项 75-82 中 任一项公开的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或抗原结合部分， 和药学上可接受的载体。
     项 84. 另一实施方式是项 83 公开的药物组合物， 其特征在于由 hGM-CS 过量产生 导致的疾病选自下面的组 ：(a) 变应性疾病， 如哮喘， 特应性和花粉症，
     (b) 移植物排斥， 移植物抗宿主病 (GVHD)， 和
     (c) 自身免疫性疾病如类风湿性关节炎。
     项 85. 另一实施方式是编码抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分的分离的脱 氧核糖核酸 (DNA)， 所述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分能够结合 hGM-CSF 并中 和 hGM-CSF 生物活性， 其特征在于所述分离的 DNA 编码氨基酸序列， 其包含选自 SEQ ID NO ： 4 至 9 组成的组的至少一个。
     项 86. 另一实施方式是编码抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分的分离的 DNA， 所述抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分能够与 hGM-CSF 结合并中和 hGM-CSF 生 物活性， 其特征在于所述分离的 DNA 编码氨基酸序列， 其包含选自 SEQ ID NO ： 330 至 335 组 成的组的至少一个。
     项 87. 另一实施方式是一种分离的 DNA， 所述 DNA 能够在严格条件下与项 85 或 86 公开的 DNA 杂交。
     项 88. 另一实施方式是载体， 特征在于其中掺入项 85-87 中任一项公开的分离的 DNA。
     项 89. 另一实施方式是宿主细胞， 特征在于其中导入了项 88 公开的重组表达载 体。
     项 90. 另一实施方式是增强活性的方法， 其特征在于特异于同一特定抗原的多种 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分同时施用。
     项 91. 另一实施方式是项 90 所述的增强活性的方法， 其特征在于所述多种抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分包含选自下列 (a) 和 (b) 的两型或以上的抗体或其 抗原结合部分 ：
     (a) 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其具有由 SEQ ID NO ： 4 至 9， SEQ ID NO ： 330 至 335， SEQ ID NO ： 336 至 341， 或 SEQ ID NO ： 342 至 347 的氨基酸序列表示的 互补决定区 (CDR)， 且其特异于 hGM-CSF，
     (b)(a) 中的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其具有氨基酸序列序列， 其中一个或多个氨基酸被取代， 缺失， 插入， 或添加， 且其特异于 hGM-CSF。
     项 92. 另一实施方式是项 91 公开的增强活性的方法， 其特征在于当 TF-1 细胞通 过 hGM-CSF 诱导增殖时， 所述两型或以上的抗体或其抗原结合部分在各自浓度约 55pM 时抑 制 80％或以上的 TF-1 细胞增殖。
     项 93. 另一实施方式是药用组合物或兽药组合物， 包含 ： 多种特异于同一特定抗 原的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 和药学上可接受的载体。
     项 94. 另一实施方式是如项 93 公开的药用组合物或兽药组合物， 其特征在于， 所 述多种抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分包含选自下列 (a) 和 (b) 的两型或以上的 抗体或其抗原结合部分 ：
     (a) 抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其具有由 SEQ ID NO ： 4 至 9， SEQ ID NO ： 330 至 335， SEQ ID NO ： 336 至 341， 或 SEQ ID NO ： 342 至 347 的氨基酸序列表示的 互补决定区 (CDR)， 且其特异于 hGM-CSF，
     (b)(a) 的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分， 其具有氨基酸序列序列， 其中一个或多个氨基酸被取代， 缺失， 插入， 或添加， 且其特异于 hGM-CSF。
     项 95. 另一实施方式是如项 94 公开的药用组合物或兽药组合物， 其特征在于当 TF-1 细胞通过 hGM-CSF 的诱导增殖时， 所述两型或以上的抗体或其抗原结合部分在各自浓 度约 55pM 时抑制 80％或以上的 TF-1 细胞增殖。
     以下， 本发明的实施例将描述得更具体， 但是实施例并不限制本申请的请求范围。 实施例 实施例 1 产生抗 hGM-CSF(hGM-CSF) 的完全人的抗体的细胞克隆的分离。
     图 1 显示了分离抗体产生细胞克隆的流程图。B 细胞分离自血清中有高抗 GM-CSF 单克隆抗体滴度的捐赠者血液， 然后用 EBV 感染。这些被 EBV 感染而增殖的细胞用作抗体 产生细胞库。
     将 抗 体 产 生 细 胞 库 的 细 胞 分 散 于 96 孔 板， 培 养 3 到 4 周。 筛 选 每 个 孔 的 培 养 上 清 液 是 否 存 在 抗 hGM-CSF 单 克 隆 抗 体。 筛 选 通 过 ELISA 进 行， 使用包被重组 hGM-CSF(rhGM-CSF) 的 96 孔板。将抗体产生阳性孔中的细胞接种于新的 96 孔板， 培养 3 到 4 周， 然后对每个孔的培养上清液进行第二次抗 hGM-CSF 单克隆抗体的筛选。 对抗体产生阳 性孔中的细胞在 96 孔板中有限稀释培养 3 到 5 周， 此后， 对每个孔的培养上清液进行抗体 检测， 最终从每孔植入一个细胞的孔中得到抗体产生细胞克隆。
     实施例 2 抗体同种型和亚类的鉴定。
     我们鉴定了三个抗体产生细胞克隆， EV1007、 EV1018 和 EV1019( 表 1) 产生的抗体 的同种型和亚类。鉴定通过 ELISA 进行， 所述方法基本上与培养上清液中抗体产生的筛选 方法相同， 以培养上清液作为一抗， 同种型和亚型特异的抗体作为二抗。
     表 1 表示新获得的三种抗 hGM-CSF 单克隆抗体和单克隆抗体 J1584C( 下文称为 EV1003) 的抗体名称和它们的亚类。它们已经在国际 PCT 公布文本 WO07/049472 中报道。
     表1
     抗体 EV1007 EV1018 EV1019 EV1003
     亚类 IgG1λ IgG1λ IgG1λ IgG1λ实施例 3 从抗体产生细胞中克隆抗体基因
     抗体基因是从抗体产生细胞中克隆的。从抗体产生细胞提取总 RNA， 用寡 dT 引物 和逆转录酶合成其 cDNA。
     使用 cDNA 为模板， 通过 PCR 扩增出编码人抗体的基因。引物是基于抗体基因 DNA 序列数据库设计的， 从而使得 5′端含有转录起始位点， 3′端包含翻译终止位点。实施例 4 基于核酸序列确定抗体的氨基酸序列
     抗体基因 [EV1007、 EV1018 和 EV1019， 均由重 (H) 链和轻 (L) 链基因组成 ] 的 cDNA 被克隆到质粒载体， 通过测序仪 (ABI) 分析它们的核酸序列。基于获得的核苷酸序列确定 其氨基酸序列。采用 Kabat 的方法分析抗体 (EV1007、 EV1018、 EV1019 和 EV1003) 的互补决 定区 (CDR)。四种抗体的 CDR 序列由 SEQ ID NO ： 4 到 9 和 330 到 347 表示。特别地， EV1018 的 L 链 CDR1， L 链 CDR2， L 链 CDR3， H 链 CDR1， H 链 CDR2， 和 H 链 CDR3 分别展示于 SEQ ID NO ： 4 至 9。EV1019 的 L 链 CDR1， L 链 CDR2， L 链 CDR3， H 链 CDR1， H 链 CDR2， 和 H 链 CDR3 分 别展示于 SEQ ID NO ： 330 至 335。EV1003 的 L 链 CDR1， L 链 CDR2， L 链 CDR3， H 链 CDR1， H 链 CDR2， 和 H 链 CDR3 分别展示于 SEQ ID NO ： 336 至 341。EV1007 的 L 链 CDR1， L 链 CDR2， L 链 CDR3， H 链 CDR1， H 链 CDR2， 和 H 链 CDR3 分别展示于 SEQ ID NO ： 342 至 347。
     实施例 5 获得的编码抗 hGM-CSF 单克隆抗体的抗体基因的确认
     将编码三种抗体 ( 每个均由 L 链和 H 链组成 ) 的基因插入到表达载体中。编码每 种抗体的 L 和 H 链基因的质粒， 采用 Lipofectamine and Plus 试剂 (Invitrogen) 瞬时转 染到 293T 细胞， 并检测瞬时抗体表达。
     转染两天后， 收集包含分泌的抗体的培养细胞培养物上清液。通过 ELISA 检测培 养上清液中的人类 IgG 和抗 GM-CSF 的单克隆抗体以证实人类 IgG 和抗 GM-CSF 的单克隆抗 体的瞬时表达。
     实施例 6 表达抗 hGM-CSF 单克隆抗体的稳定的 CHO 转染细胞的构建。
     如上所述将编码抗 GM-CSF 单克隆抗体的表达载体转染到 CHO-K1 细胞中。转染两 天后， 将细胞接种到 96 孔板上， 然后在含有合适的选择标记的选择培养基中培养两周。每 个孔的培养上清液用 ELISA 筛选抗 hGM-CSF 的单克隆抗体。将抗体表达阳性孔中的单个细 胞接种到 96 孔板的孔中。对生长在选择性培养基中的单细胞克隆筛选抗 GM-CSF 单克隆抗 体的表达， 获得稳定表达抗 GM-CSF 单克隆抗体的细胞克隆。
     实施例 7 抗体的纯化
     在无血清培养基中培养稳定表达抗 GM-CSF 单克隆抗体的 CHO 细胞克隆。在各 自的表达期之后， 收集培养上清液， 按照生产商的说明， 用 HiTrap rProtein A FF 预装柱 (Amersham) 进行亲和层析， 分离抗体。通过 ELISA 证实纯化的抗体具有结合 hGM-CSF 的活 性， 通过 SDS-PAGE 确定抗体由约 50kDa 的抗体 H 链和约 25kDa 的抗体 L 链组成。
     实施例 8 抗 GM-CSF 单克隆抗体的亲和力分析
     采用 Biacore SystemTM 的表面等离子体共振 (SRP) 计算重组 hGM-CSF 结合抗 hGM-CSF 单克隆抗体的亲和常数 ( 图 2)。
     在所述分析抗体和抗原相互作用的方法中， 纯化的抗体通过与固定在传感器芯片 表面的 G 蛋白相互作用， 被传感器芯片捕获， 然后将重组抗原注入到传感器芯片。使用纯化 的抗体， 重组 hGM-CSF 被用作抗原。
     来 自 酵 母 (Leukine Berlex) 和 大 肠 杆 菌 (Peprotech) 的 重 组 hGM-CSF 与 抗 hGM-CSF 单克隆抗体的平衡解离常数 (KD) 列在表 2 中。
     表2
     所 述 分 析 中， 对 于 EV1007 与 酵 母 GM-CSF(Leukine) 的 KD 值 是 1.2x10-9M， 对于 -10 -10 EV1018 是 2.3x10 M， 对于 EV1019 是 3.6x10 M。对于之前产生的单克隆抗体 EV1003， KD 值 -10 是 2.3x10 M。
     对 于 EV1007 与 大 肠 杆 菌 (Peprotech) 的 KD 值 是 9.3x10-10M， 对 于 EV1018 是 -10 -10 -10 1.5x10 M， 对于 EV1019 是 1.5x10 M， 而对于 EV1003 是 9.5x10 M。产生的所有这四种 hGM-CSF 单克隆抗体均以高亲和力结合到重组 hGM-CSF。
     实施例 9 抗 GM-CSF 单克隆抗体对外周血树突细胞增殖的抑制作用。
     利用人血树突细胞分离试剂盒 II(Miltenyi Biotech) 从 7×107 个人单个核细胞 中获得含有浆细胞样树突细胞 (DC) 和髓系树突细胞 (DC) 的 5×105 个树突细胞 (DC)。
     将获得的树突状细胞悬浮于 RPMI 1640 培养基 (Gibco)， 所述培养基中补充了 10 ％ 的 FCS， rhGM-CSF(1ng/mL， Peprotech)， TNF-α(10ng/mL) 和 抗 GM-CSF 单 克 隆 抗 体 4 (1μg/mL)， 按每孔 2×10 个细胞的浓度接种到 96 孔平底板上， 温育 10 天。
     以由我们生成的抗 GM-CSF 多克隆抗体 ( 抗 GM-CSF pAbs， R&D)(1μg/mL) 和人抗 人巨细胞病毒单克隆抗体 (hIgG)(1μg/mL) 作为对照。结果展示在图 3 中。
     如图 3 所示， EV1003、 EV1018 和 EV1019 抑制 GM-CSF 依赖性 DC 增殖。相比之下， EV1007 没有显示出抑制作用。另一方面， 抗 GM-CSF pAb 抑制 GM-CSF 依赖性 DC 增殖， 但是 hIgG 不具有该作用。
     EV1003、 EV1018 和 EV1019 能独立阻断 GM-CSF 依赖性 DC 增殖。
     实施例 10 使用 TF-1 细胞评估抗 GM-CSF 单克隆抗体的中和能力
     我们测试了纯化的抗 hGM-CSF 单克隆抗体 (EV1007、 EV1018 和 EV1019) 和 EV1003 的中和能力， 如图 4 和图 5 所示， EV1003 先前利用 TF-1 细胞产生， TF-1 细胞增值依赖于 hGM-CSF 的存在。
     将纯化的抗体与重组 hGM-CSF 预温育， 并将混合物加入 TF-1 细胞培养物中。培养 2 天后， 通过比色法测定 TF-1 细胞增殖情况。 具有 GM-CSF 中和活性的抗体可以阻断添加的 重组 GM-CSF 的活性， 导致 GM-CSF 依赖性 TF-1 细胞生长的抑制。
     图 4 和 图 5 分 别 表 示 抗 体 对 酵 母 (Leukine)hGM-CSF 和 大 肠 杆 菌 (Peprotech) hGM-CSF 刺激的 TF-1 细胞增殖的抑制作用 ( 中和活性 )。
     如实施例 9 中所述用抗 GM-CSF pAb 和 hlgG 作为对照， 独立评价每种抗体的抑制 作用。
     测试经 4 倍系列稀释， 浓度范围从 2μg/mL 到 31pg/mL 的抗体。 所有测试都使用终
     浓度为 0.5ng/mL 的 rhGM-CSF。 温育 40 小时后， 使用细胞计数试剂盒 (WST-1assay， DOJIN)， 通过 A450/ 参照 A495 颜色强度来估计 TF-1 细胞的存活率。
     在图 4 和图 5 的 y 轴上， 将经 31pg/mL 对照 hIgG 处理的 TF-1 细胞存活率设为 100％， ， 未经 rhGM-CSF 处理的 TF-1 细胞存活率设为 0％。测试的抗体标示在图下面， 其浓 度标示在图的右侧。
     0.5ng/mL 的酵母 rhGM-CSF(Leukine) 用来刺激 TF-1 细胞的增殖， 每种抗 hGM-CSF 单克隆抗体中和活性的结果显示在图 4 中。虽然以 hlgG 作为阴性对照， 其在 2μg/mL 的 高浓度下显示出对细胞生长的非特异抑制， 其浓度低于 2μg/mL 时不表现抑制作用。抗 hGM-CSF 多克隆抗体 ( 抗 GM-CSF pAbs) 的抗体浓度在 125ng/mL 或高于 125ng/mL 时显示细 胞生长抑制作用。
     在纯化的单克隆抗体中， EV1003 在 31ng/mL 浓度时抑制 TF-1 细胞生长， 使其存活 率为阳性对照的 60％， 在 31ng/mL 或大于 31ng/mL 时观察到浓度依赖性生长抑制。EV1018 和 EV1019 在浓度分别为 0.5ng/mL 或大于 0.5ng/mL 时以及 2ng/mL 或大于 2ng/mL 时显示 出约 50％的抑制。证实 EV1018 和 EV1019 对 hGM-CSF 具有极高的中和活性。EV1007 在浓 度为 0.5μg/mL 或大于 0.5μg/mL 时显示明显的细胞生长抑制作用， 表明它的中和能力很 低。
     0.5ng/mL 大肠杆菌 rhGM-CSF(Peprotech) 被用来刺激 TF-1 细胞的增殖， 每种抗 hGM-CSF 单克隆抗体的中和能力结果显示在图 5 中。在这个分析中， 作为阴性对照的 hIgG 在 2μg/mL 的高浓度下显示对细胞生长的非特异抑制作用， 但是在浓度低于 2μg/mL 时不 表现抑制作用。抗 hGM-CSF 多克隆抗体 ( 抗 GM-CSF pAb) 在抗体浓度为 31ng/mL 或大于 31ng/mL 时显示出细胞生长抑制作用。
     在纯化的单克隆抗体中， EV1003 在 31ng/mL 或大于 31ng/mL 浓度时表现出明显 的对 TF-1 细胞增殖的浓度依赖性抑制。EV1018 和 EV1019 在浓度分别为 0.5ng/mL 或大于 0.5ng/mL 时以及 2ng/mL 或大于 2ng/mL 时显示出高于 50 ％的抑制作用。证实 EV1018 和 EV1019 的中和活性极高。
     EV1007 浓度为 0.5μg/mL 或大于 0.5μg/mL 时明显地表现出细胞生长抑制作用， 表明与 EV1018 和 EV1019 相比， 它的中和能力很低。
     评估了两种抗体的组合的中和活性 ( 图 6 和 7)。表 3 中列出混合抗体的五种组 合。
     表3
     混合物 -1 混合物 -2 混合物 -3 混合物 -4EV1003+hIgG EV1003+EV1007 EV1003+EV1018 EV1003+EV101972CN 101970489 A说混合物 -5明书64/129 页EV1018+EV1019
     每种抗体的测试溶液以四倍系列稀释配制， 浓度范围从 4μg/mL 到 62pg/mL， 将相 同浓度的两种抗体混合起来 ( 终浓度如图 6 和 7 所示 )。 使用细胞计数试剂盒 (WST-1assay， DOJIN)， 通过 A450/ 参照 A495 颜色强度来估计 TF-1 细胞的存活率。
     在图 6 和图 7 的 y 轴上， 经对照 31pg/mL hIgG 处理的 TF-1 细胞存活率设为 100％， 未经 rhGM-CSF 处理的 TF-1 细胞存活率设为 0％， 如图 4 和 5 所示。经对照 31pg/mL hIgG 处理的 TF-1 细胞存活率的结果显示在图 4 和 5 中， 而不是图 6 和 7。混合抗体的组合标示 在图下面， 且其浓度在图右侧指示。
     在这些组合中， 混合物 -2 ： EV1003+1007， 混合物 -3 ： EV1003+1018 和混合物 -4 ： EV1003+1019 的抑制作用与单独使用每种抗体相比极度增加。 例如， 如图 6 所示， 混合物 -4 ： EV1003+1019 在每种抗体浓度 8ng/mL( 约 55pM) 时抑制 TF-1 细胞生长， 使其存活率为阳性 对照的 10％。
     如图 4 所示， EV1003 在浓度为 8ng/mL 时， 单独不表现出对 TF-1 细胞增殖的抑制， EV1019 在浓度为 8ng/mL 时， 单独表现出仅 50％的抑制。这些结果表明两种抗体的组合显 示极高的中和活性。
     虽然 EV1007 单独使用的抑制作用很低， 但是混合物 -2 ： EV1003+1007 在每种抗体 8ng/mL( 约 55pM) 的浓度时抑制 TF-1 细胞生长至阳性对照组的 10％， 如图 6 和 7 所示。
     如图 7 所示， 当使用大肠杆菌 rhGM-CSF(Peprotech) 刺激 TF-1 细胞增殖时， 细胞 生长几乎完全被每种抗体浓度均为 31ng/mL 或大于 31ng/mL 的混合物 -2 ： EV1003+1007， 混 合物 -3 ： EV1003+1018 和混合物 -4 ： EV1003+1019 抑制。 证实抗体的组合添加显示极强的中 和活性。
     另一方面， 与图 4 和 5 所示的抗体单独使用相比， 混合物 -5 ： EV1018+1019 抑制活 性以浓度依赖性的方式增加。但是， 比混合物 -2 至 4 增加的幅度小。
     对于混合物 -5 ： EV1018+1019， 其混合物效果不显著， 每种抗体单独使用的剂量依 赖性曲线 ( 中和作用模式 ) 相似。
     如图 4 和 5 所示， 在四种抗体 (EV1003、 EV1007、 EV1018 和 EV1019) 中， EV1003 在 2μg/ml 浓度下单独使用时显示最强的抑制作用， 但是即使在这样高浓度时， 大约 20％细 胞仍然存活。与此相反， 混合物 -2、 混合物 -3 和混合物 -4 在 31 至 125ng/mL 的浓度范围几 乎完全抑制细胞生长。表明这三种组合 ( 混合物 -2， 混合物 -3 和混合物 -4) 显示极高的中 和活性。
     抗 GM-CSF 单克隆抗体 (EV1003) 和抗 CMV 抗体 (hIgG) 的组合使用， 混合物 -1， 与 它们单独使用相比不增强抗体的抑制作用。
     在本发明获得的三种抗体中， 两种抗体 (EV1018 和 EV1019) 在单独和组合使用时 显示极高的中和活性。在表 3 列出的抗体组合中， 某些组合比两种抗体累加效应显示更高 的抑制活性。
     以上产生的抗 GM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分能够与引起多种疾病的 hGM-CSF 特异结合， 并灭活 ( 中和 )hGM-CSF 的生物活性。 因此， 所述抗体或其抗原结合部分
     比目前为止制备的 ( 当前可得到的 ) 抗 hGM-CSF 单克隆抗体有更高的 hGM-CSF 中和活性。 由于所述抗体或其抗原结合部分是人类单克隆抗体， 所以没有免疫原性， 不会引起免疫反 应。
     另外， 与单独使用相比， 同时组合使用抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分 对细胞生长显示极高的抑制作用 ( 如， 中和活性 )。
     考虑到这些特性， 本发明所述的抗 hGM-CSF 单克隆抗体或其抗原结合部分在低剂 量时可作为与 GM-CSF 升高相关疾病的有效预防或治疗药物， 与 GM-CSF 升高相关的疾病包 括但不限于变应性疾病如哮喘， COPD， 囊性纤维化病， 间质性肺病， 鼻炎， 特应性， 花粉症， 移 植物排斥， 移植物抗宿主病 (GVHD)， 关节炎及相关的关节疾病， 银屑病， 髓系白血病， 多发性 硬化， Alzheimer 氏症和类风湿性关节炎。
     实施例 11 用 Biacore hGM-CSF 测定抗 GM-CSF 单克隆抗体的亲和力
     小鼠抗人 Biacore 芯片 (GE Healthcare) 用于固定每种抗体， 并且任可溶的可市 购的纯化 GM-CSF(Biomol) 与其结合。这些实验中使用的 hGM-CSF 与下述生物检定中使用 的相同。结合亲和力用 Biacore 软件确定， 结果概括于表 4。
     表4
     抗体 EV1003 EV1019 EV1018
     Ka 1.05×106±0.01 8.13×106±0.19 1.11×106±0.03Kd 2.15×10-4±0.01 1.21×10-4±0.01 1.44×10-4±0.37KD 203±2pM 152±1pM 112±6pMEV1018 比 EV1019 的结合亲和力高， 比 EV1003 的结合亲和力更高。所有 EV1018 的 变体与野生型具有相等的亲和力。
     与其他种 ( 恒河猴， 小鼠， 狨猴 )GM-CSF 的交叉反应性
     公共数据库中有恒河猴 GM-CSF 序列 ( 例如， GenBank 登录号 NP_001028121)， 所述 序列被用来设计一个作为 Fc 融合蛋白的表达克隆。引入蛋白酶切割位点来使释放不带标 签的恒河猴 GM-CSF 蛋白成为可能。所得的蛋白具有极佳的生物学活性 ( 参见下一部分 )， 并且在 Western blots 中可被所有抗 GM-CSF 单克隆抗体 (EV1018， EV1019， EV1003) 识别 ( 数据未显示 )。进行 Biacore 测定 ( 使用的设置与上面 1.1 描述的相同 )， 结果如表 5 所 示。
     表 5 恒河猴 GM-CSF 单克隆抗 GM-CSF 单克隆抗体结合研究
     抗体 EV1003Ka 5.39×105±0.0674Kd 3.56×10-4±0.04KD 661±14pMCN 101970489 A说2.91×105±0.23 3.04×105±0.13明书2.14×10-4±0.01 1.65×10-4±0.17 739±57pM 543±34pM66/129 页EV1019 批次 1 EV1019 批次 2EV1018
     5.56×105±0.522.11×10-4±0.06381±16pM在所有情况下， 与恒河猴 GM-CSF 的交叉反应性都良好 ( 所有的抗 GM-CSF 单克隆 抗体识别恒河猴 GM-CSF 蛋白的识别情况均比 hGM-CSF 差约 2-3 倍 )。由此， 恒河猴为此处 公开的抗 GM-CSF 单克隆抗体的发展提供了一个很好的非人灵长类模型。
     用小鼠的 GM-CSF 进行测定 (PeproTech 和 Biomol， GeneBank 登录号 ： NP_034009)， 结果总结在表 6 中。
     表 6 小鼠 GM-CSF 单克隆抗 GM-CSF 单克隆抗体结合研究
     抗体 EV1003Ka n.d.Kd n.d.KD n.d.EV10191.1×105±0.16×10-3±262±27nMEV1018
     1.9×105±0.23.4×10-2±1.7193±60nM在所有情况下， 与小鼠 GM-CSF 的交叉反应性都很弱。这个数据为抗 GM-CSF 单克 隆抗体结合的 hGM-CSF 表位的鉴定实验提供了基础， 其中小鼠和人类之间的 GM-CSF 蛋白的 杂交已经被证实。
     生成了一个与上述恒河猴 GM-CSF 表达克隆相似的狨猴 GM-CSF( 例如， GenBank 登 录号 ： B0KWQ4， 第 53 位是甲硫氨酸， 第 109 位是脯氨酸 ) 表达克隆。 纯化的蛋白用于 Biacore 测定， 其结果总结在表 7 中。
     表 7 狨猴 GM-CSF 抗 GM-CSF 单克隆抗体结合研究
     抗体 EV1003Ka n.d.Kd n.d.KD n.d.EV10192.1×105±0.12.14×10-4±0.011.4±0.1nM75CN 101970489 A说3.64×105±0.01明书7.6×10-4±0.367/129 页EV1018
     2.1±0.1nM与狨猴 GM-CSF 的交叉反应性是显著的。所有的抗 GM-CSF 单克隆抗体都可识别狨 猴 GM-CSF 蛋白， 识别情况比 hGM-CSF 差约 18-19 倍。像恒河猴一样， 狨猴为开发所述公开 的抗 GM-CSF 单克隆抗体提供了一个良好的动物模型。
     实施例 12 生物学活性 ： 对 GM-CSF 生物活性的中和作用
     TF-1 增殖分析 ( 人类， 恒河猴， 狨猴的 GM-CSF)
     TF-1 人细胞系的增值依赖于生长因子。 这个细胞系是本领域公知的研究生长因子 生物作用的良好基础。
     此 处， 我 们 使 用 不 同 物 种 的 重 组 GM-CSF(rGM-CSF)， 例 如 (i) 在 大 肠 杆 菌 中 (Fa.Biomol #2514) 表 达 的 hGM-CSF 的 重 组 hGM-CSF(rhGM-CSF) 通 过 使 用 本 领 域 公 知 的标准技术， 或 (ii) 恒河猴 GM-CSF( 如 GenBank 登录号 ： NP_001028121) 的重组恒河猴 GM-CSF(rrGM-CSF) 或 (ii) 狨猴 GM-CSF( 如 GenBank 登录号 ： B0KWQ4， 第 53 位是甲硫氨酸， 第 109 位是脯氨酸 ) 的重组狨猴 GM-CSF(rmGM-CSF)， 后两种均采用本领域公知的标准技术 在 HEK293 中表达。
     将 TF-1 在 细 胞 培 养 基 (RPMI1640(Cat.31870， Fa.Gibco)， 1×Glutamax 100×(Cat.35050-038 ， Fa.Gibco) ， 1mM Sodium Pyrovat 100mM ， (Cat.11360-039 ， Fa.Gibco)， 10mM Hepes 1M(Cat.15690-056， Fa.Gibco)， 10 ％ FCS(Cat.10500-064， Fa.Gibco)， 2ng/ml rGM-CSF， (Cat.200-005L Fa.Reliatech GmbH) 中生长。细胞用 PBS 洗 三次， 然后以 1E5 个 /ml 的浓度接种到 96 孔板 (Cat.167008-056， Fa.Nunc) 中， 培养基是 实验培养基 (Assay Medium)( 不含 rGM-CSF 的细胞培养基 )。在稀释培养基 ( 不含 FCS 和 rGM-CSF 的细胞培养基 ) 中稀释抗体溶液和 GM-CSF 溶液， 然后分别以 10μl 的体积添加。 在 湿室 (humidified chamber) 内以 37℃， 5％ CO2 将细胞温育 3 天。根据试剂盒 (CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay， Fa.Promega， Cat.No.G3581) 的说 明， 通过加入 20μl 的 MTS， 测定 492nm 时的光密度， 测得细胞存活率。阴性对照是在不含 rGM-CSF 的培养基中生长的 TF-1 细胞， 阳性对照是在含浓度为 ED80 的 rGM-CSF 的细胞培养 基中生长的 TF-1 细胞。
     在 检 测 抗 体 中 和 活 性 之 前， 需 确 定 人， 恒 河 猴， 狨 猴 GM-CSF 刺 激 增 殖 作 用 的 ED80( 表 8)。 人和恒河猴的 GM-CSF 能够非常有效地刺激 TF-1 细胞的增殖 (ED80[ 人 ] ： 1-5ng/ ml ； ED80[ 恒河猴 ] ： 7ng/ml)， 但是狨猴的 GM-CSF 刺激 TF-1 增殖的效果非常低下。因此， 人 TF-1 细胞系适合测试人和恒河猴 GM-CSF 的中和活性， 但是不适合测试来自狨猴的 GM-CSF。
     表 8TF-1 细胞增殖分析中人类， 恒河猴和狨猴 GM-CSF 的 ED80
     物种 人类 恒河猴GM-CSF rhGM-CSF( 来自大肠杆菌 ) rrGM-CSF( 来自 HEK 细胞 )ED80 1.5ng/ml 7ng/ml76CN 101970489 A说狨猴明书1μg/ml68/129 页rmGM-CSF( 来自 HEK 细胞 )
     抗体 IC50 的测定在 ED80 浓度下进行。
     在图 8A 和 8B 的 y 轴上， 阳性对照的 TF-1 细胞存活率设为 100％， 阴性对照的 TF-1 细胞存活率设为 0％。
     具有已知的中和活性的抗体， 可市购的大鼠抗 hGM-CSF IgG2a 抗体也被使用 (BVD2-23B6， Fa.BD Pharmingen#554501)( 表 9)。同种型对照抗体大鼠 IgG2a 没有表现出 细胞增殖抑制作用 ( 数据未显示 )。
     EV1018 和 EV1019 具 有 良 好 的 对 重 组 人 GM-CSF 的 中 和 活 性。EV1018 超 过 了 BVD2-23B6 的中和活性。
     EV1018 的重链天然地在框架 3 中含有 N- 糖基化位点。 这在例如 SEQ ID NO ： 10 中 表示出来， 对应第 95-97 残基。因此生产了 EV1018 重链变体并检测了其中和活性。如表 9 中所示， 结果表明在去除了重链框架 3 中 N 连接的糖基化位点后， EV1018 的生物学活性仍然 保留。表 9 显示了与重链包含 N- 糖基化位点的 WT EV1018 相比较， 两种糖基化位点序列变 体 (EV1018 变体 1 和 2) 的 IC50 值， 这两种变体分别命名为 N95K 和 T97A。每种纯化的 IgG 的 IC50 值， 基本上如描述的那样， 在 TF-1 实验中测定。对更多的 EV1018 变体的实验得到 了与 EV1018 相似的结果。
     表 9TF-1 细胞增殖分析中 IC50 的比较
     结果用 ng/ml 和 pM 给出 ( 假设抗体的分子量为 150kDa)
     在使用重组恒河猴 GM-CSF 单克隆抗体的实验中， EV1018、 EV1019 和 EV1003， 与从 大鼠获得的 BVD2-23B6 相比， 具有更高的中和活性。但是， 在这两个实验中， EV1018 均比所 有测试的抗体显著更好。所有的 EV1018 变体与野生型 EV1018 具有相同的中和活性。
     在设定的给出表 9 中结果的实验中， 不可能使用可市购的大鼠抗人 GM-CSF IgG2a BVD2-21C11(Fa.BD， #554503)， 因为低于给出的 ED80 浓度， 例如 1.5ng/ml rGM-CSF 的剂量， 不能获得可靠的结果。为了测定抗体 21C11， 需要更低剂量的 rGM-CSF， 如下表 10 所示。
     通过简单地比较 IC50 值从而比较不同实验室的抗体的有效性， 是不可能的， 因为 IC50 值强烈依赖于实验条件， 比如说使用的刺激物的量。一个更可靠的比较可为比较标准 抗体与感兴趣的抗体的比值， 例如获自使用所示不同 rGM-CSF 量的上述 TF-1 分析中获得的 IC50 值的比值。例如， WO2006/122797( 表 8， 第 56 页和 57 页 ) 公开了其最好的抗体比可市 购的抗体， 大鼠抗人 GM-CSF， 克隆 BVD2-21C11 好 35 倍。可市购的抗人 GM-CSF 单克隆抗体 克隆， 克隆 BVD2-21C11 与 EV1018 的 IC50 值的比值是 413。因此， 基于与商品标准的比较， 如表 10 所示， EV1018 的中和活性是其十倍高。这是令人惊讶的， 因为 WO2006/122797 教导 本领域技术人员抗 GM-CSF 单克隆抗体的中和活性与其与 GM-CSF 的结合亲和力强烈地相关 (WO2006/122797， 50 页的表 3 中显示的改善的结合亲和力与相应改善了的中和能力相关， 中和能力显示在第 52-54 页表 6 和 7)。
     比 较 MOR04357(WO2006/122797， 第 50 页， 表4： MOR04357-Fab 的 结 合 亲 和 力 是 7pM) 与 EV1018 的结合亲和力我们意识到， 与 MOR04357 相比， EV1018 与 GM-CSF 的结合低 16 倍。但是， 与 MOR04357 相比， EV1018 的中和活性高十倍， 表明中和活性不必然与 GM-CSF 的 结合亲和力相关联。
     表 10.TF-1 分析中 EV1018 和现有技术抗体的相对中和活性
     第1和2行： 来自 WO2006/122797 第 56 和 57 页， 表 8 的数据， 第3和4行： 我们的 数据
     在 U937 细胞中的 IL-8 分泌分析 ( 人类和恒河猴 GM-CSF)
     IL-8 是促炎症细胞因子， 它是嗜中性粒细胞性炎症的关键因子， 参与大部分的炎 症反应。GM-CSF 活性的靶细胞是髓样细胞谱系的细胞。前单核细胞系 U937 起源于骨髓， 在 GM-CSF 刺激下分泌促炎症细胞因子 IL-8。
     U937(ATCC ： CRL-1593.2) 在细胞培养培养基 (RPMI 1640(Cat.31870Fa.Gibco)， 1×Glutamax 100x(Cat.35050-038Fa.Gibco)， 10 ％ FCS(Cat.10500-064Fa.Gibco)， 1 ％ PenStrep) 中生长。接种 100μl 浓度为 1E5 个 /ml 的细胞悬液， 添加 10μl 的抗体溶液和 10μl 的 GM-CSF 溶液。在湿室内， 以 37℃， 5％ CO2 温育 24 小时。使用 OptEIA Human IL-8 Elisa Set(Fa.BD Bioscience， Cat.No.555244) 确定 IL-8 细胞因子水平。
     阴性对照是在未添加抗体和 GM-CSF 的细胞培养培养基中生长的 U937 细胞， 阳性 对照是在含 ED80 的 rGM-CSF 但未添加抗体溶液的细胞培养培养基中生长的 U937 细胞。人 和恒河猴 GM-CSF 的 ED80 浓度已确定 ( 表 9)， 所述浓度用于确定不同抗 GM-CSF 单克隆抗体 的 IC50( 表 11)。
     表 11 U937 中 IL-8 分泌的 ED80 测定
     GM-CSF 人 ( 来自大肠杆菌 Fa.Biomol #2514) 恒河猴 ( 来自 HEK 细胞， 本实验室 )
     79ED80 1.2ng/ml 5.0ng/ml表 12 U937IL-8 分泌分析中 IC50 的比较。结果用 ng/ml 和 pM 给出 ( 假设抗体的 分子量为 150kDa)CN 101970489 A说明书71/129 页
     在细胞分析中， 三种抗体均非常有效地中和人以及恒河猴的 GM-CSF。EV1018 的中 和活性比 EV1019 的高， 远较 EV1003 的为高。所有 EV1018 的变体与野生型 EV1018 显示等 同的中和活性。实施例 13 表面 CD11b/Mac1 的诱导
     粒细胞是髓样谱系的细胞亚群， 是 GM-CSF 生物活性的靶细胞。除了其他的效应物 功能外， GM-CSF 诱导粒细胞表面的粘附分子 CD11b/Mac1。髓样细胞谱系细胞表面 CD11b/ Mac1 的诱导是细胞从外周血向炎症组织迁移的必要步骤。患有慢性炎性气道疾病如 COPD 和哮喘的病人痰和支气管肺泡灌洗液中的粒细胞数增多。因此， 抗 GM-CSF 抗体的有效性通 过 GM-CSF 介导的原代人粒细胞上的粘附标记物 CD11b/Mac1 的诱导来测定。
     80μl 健康捐献者的经抗凝血处理的外周血与抗 GM-CSF 单克隆抗体或同种型抗 体 ( 人类 IgG， #I-2511 ； Fa.Sigma-Aldrich)( 阳性对照 ) 在 37℃下共同温育 15 分钟， 所述 同种型抗体先与 rhGM-CSF( 终浓度 30pM)(Fa Biomol， #2514) 预温育 20 分钟。阴性对照为 经抗凝血处理的外周血在 37℃与同种型抗体温育 15 分钟， 所述同种型抗体先用 PBS， 0.1％ BSA 预温育 20 分钟。
     为了定量测定 CD11b/Mac1 的表达， 根据供应商的指导， 使用藻红蛋白标记的抗 CD11b 抗体 (Fa ： Pharmingen ； Cat ： 333142)。简要地说， 将 20μl 的抗 CD11b 抗体溶液加到 细胞中， 避光室温温育 30 分钟。加入 2ml 裂解溶液 (Fa ： BD ； Cat 349202) 裂解红细胞 ( 红 细胞 )， 避光室温再温育 10 分钟。用 PBS， 0.1％ BSA 洗涤两次后， 将白细胞悬浮于 500μl Cellfix(Fa ： BD ； Cat 340181) 中。LSRII 流式细胞仪和分析 FACS 的 DIVA6.1.1 软件 ( 二者
     均来自 Fa ： BD) 被用于分析数据。在前散射和侧散射二维 Dotplot 图中， 划出 (gate) 粒细 胞， 并将其设定为 100％。30pM 的 rhGM-CSF 被用于刺激粒细胞表面的 CD11b/Mac1。67pM 的 EV1018 足以完全阻止 GM-CSF 诱导的 CD11b/Mac1。
     这些数据表明 EV1018 有效地中和 GM-CSF 生物学活性， 这在涉及粒细胞数目增多 的炎症过程如 COPD 和哮喘中具有重要意义。
     实施例 14C57BL/6J 小鼠暴露于香烟烟雾后的肺部炎症
     香烟烟雾是引发 COPD 的最重要的因素。诸如小鼠大鼠等动物长期暴露于香烟烟雾后会导致许多类似于人类疾病， 在病理生理学上相关的解剖损害 (anatomic lesion) (Fujita 和 Nakanishi 2007)。 COPD 一个重要的参数是慢性支气管炎， 慢性支气管炎包括肺 中嗜中性粒细胞和巨噬细胞的增多。为了证明 GM-CSF 在烟雾诱导的细胞向肺部聚集中发 挥着重要的作用， 抗 GM-CSF 单克隆抗体被用在小鼠长期香烟烟雾模型中。
     将小鼠 (C57BL/6J 系， 18-23g) 暴露于香烟烟雾 4 天。第 1， 2 天暴露于 6 支香烟 中， 第 3 天 8 支， 第 4 天 10 支。暴露于每支香烟的时间持续 16 分钟， 接着暴露于新鲜空气 8 分钟。每两支香烟后有 24 分钟暴露于新鲜空气的额外时间。没有暴露于香烟烟雾的小鼠 作为阴性对照。
     在第一天和第三天暴露之前两小时腹膜内施用 (i.p.)300μg 大鼠抗小鼠 GM-CSF 抗体 IgG2a( 克隆 MPI-22E9， Fa.eBioScienses， #16-7331)， 或 300μg 合适的同种型抗体 ( 大鼠 IgG2a， Fa.eBioSciences， #16-4321)， 或是 300μl 媒介 (PBS， 10mM NaCl)。最后一 次暴露 18 小时后对受试动物处以安乐死， 肺部用含 EDTA 的 2×0.8ml Hanks 溶液灌洗。将 支气管肺泡灌洗液 (BALF) 离心分离为细胞团与上清液。检测团中髓过氧化物酶 (MPO) 活 性作为髓样细胞流入的参数。在 4 ℃， 485×g 低速离心 500μl 灌洗液样品 10 分钟。用 200μl 0.5％的十六烷基三甲基溴化铵 (HTAB) 重悬细胞团。将 50μl 悬浮液转至 96 孔微 滴定板上。每孔加 250μl 底物溶液 (50mM KH2PO4， 5mM Na2HPO4， 0.2mg/ml 邻联茴香胺二盐 酸盐 (o-dianisidin dihydrochloride)， 0.2μl/ml H2O2) 以起始酶促反应。测定 450nm 处 的 90 秒消光 (extinction)。髓过氧化物酶 (MPO) 活性在酶促反应的稳定期计算。活性以 毫活性单位每分钟 (mAU/ 分钟 ) 形式给出。
     使用流式细胞仪 (LSR II， Becton Dickinson) 进行多重分析物检测 (multiple analyte detection) 测定 BALF 上清液中的细胞因子 MCP-1 和 MIP-1α。实验参照 Bender MedSystems(Flow Cytomix) 的说明书进行。 简要地说， 将 25μl BALF 上清液与 25μl× 测 定缓冲液 (Basic 试剂盒 BMS8440FF)， 25μl Bead 混合物 (MCP-1 和 MIP-1a 混合物 Simplex 试剂盒， BMS86005FF， BMS86013FF)， 50μl 生物素偶联的混合物混合 ( 包括在 Simplex 试剂 盒中 )， 并于室温在微孔板振荡器上 500rpm 温育 2 小时。用测定缓冲液洗两次后， 将珠子 溶解到 100μl 的测定缓冲液中， 加入 50μl 链霉亲合素 -PE- 溶液 ( 包括在 Basic 试剂盒 中 )。将珠子于室温在微孔板振荡器上 500rpm 保温 1 小时， 珠子用测定缓冲液洗两次。将 珠子溶于 500μl 测定缓冲液， 然后用 Bender MedSystems 提供的 FlowCytomix Pro 2.2 软 件进行流式细胞术分析。定量分析时， 按照供应商 (Bender MedSystems) 的说明书准备标 准品 ( 包括在 Simplex 试剂盒中 ) 的系列稀释物。细胞因子的浓度基于标准品确定。
     在用抗 GM-CSF 抗体预处理小鼠时， MPO 活性降低了约 25％ ( 图 9A)。与这个结果 一致， 细胞因子 MCP-I 和 MIP-Iα 分别降低了约 18％和 23％ ( 图 9B)。
     图 9A 和 9B 中的结果表明在香烟烟雾引发的炎症中， GM-CSF 发挥了重要作用， GM-CSF 的中和可以显著降低小鼠长期香烟烟雾暴露后诱导的细胞浸润和炎症性的细胞因 子。
     实施例 15GM-CSF 表位作图
     测试包括小鼠、 人类、 恒河猴和狨猴的 GM-CSF 的肽阵列以确定 GM-CSF 中特定的线 性序列是否可以作为表位被所讨论的抗体识别。
     以下的抗体被测试 ： BIBH1( 一种识别 FAP 的非相关的人源化 IgG1 阴性对照抗体( 参见 US20030103968 Use of FAP alpha specific antibody BIBH1 in the treatment of cancer(http://www.asco.org/ASCO/Abstracts+&+Virtual+Meeting/Abstracts ？ &vmview ＝ abst_detail_view&conflD ＝ 10&abstractID ＝ 1028)， EV1018， EV1019 和 EV1003。
     肽阵列的结果表明与阴性对照抗体没有高于特异性结合的水平， 而经固定化的 GM-CSF 和人类 IgG 阳性对照有强信号。 由于正确折叠的 GM-CSF 可被识别， 但是来自 GM-CSF 衍生出的多肽不被识别， 我们得出结论 ： 受试的抗 GM-CSF 抗体识别非线性或构象特异性的 表位。这与文献 ( 如 WO2007/092939) 中已知的其它几种抗 GM-CSF 抗体不同。
     采用以下的方法 ：
     定制的阵列在 JPT( 德国柏林 ) 被合成并印制到载玻片上， 室温下用 PBS+1 ％ BSA+0.1％ Tween 20 封闭阵列 3 小时， 并轻轻摇动。用探针缓冲液 (PBS， 5mM MgCl2， 0.5mM DTT， 0.05％ Triton X-100， 5％甘油， 1％ BSA) 稀释抗体至 5μg/ml， 然后于 4℃在阵列上温 育 1-2 小时。然后用探针缓冲液洗涤阵列三次 ( 每次在冰上洗涤一分钟 )， 接着用 Cy5 标 记的山羊抗人 IgG(0.5μg/ml)4℃温育 1 小时， 如上所述再次洗涤， 离心干燥 (800x g)， 以 Cy5 滤镜， 在恒定 PMT 下， 用 Perkin-Elmer ProScan 微阵列扫描仪扫描。
     还通过直向同源取代 (orthologous replacement) 进行表位作图。由于受试的抗 体识别构象或非连续表位， 只能在正确折叠的 GM-CSF 背景下才能识别各自的表位。如上描 述的 Biacore 结果表明， 即使有结合， 所述的抗体与小鼠 GM-CSF 的结合也很微弱。因此， 我 们设计了嵌合版本的 GM-CSF， 其中人类 GM-CSF 的选定区域被相应的小鼠序列所代替。 由于 推定人类和小鼠的 GM-CSF 具有相似的三维结构， 但是仅有 73％的同一性 (identity)， 嵌合 蛋白应该保持正确的 GM-CSF 折叠， 这与可能影响蛋白折叠的丙氨酸扫描方法不同 ( 用连续 的聚丙氨酸取代 )。 其中的表位或其部分被小鼠序列取代的嵌合体， 不再与所讨论的抗体结 合 ( 或显示降低的结合 )。将序列作图回已知的人类 GM-CSF 三维结构， 容许重建构成表位 的氨基酸的空间定位。在人类和小鼠间保守的 GM-CSF 氨基酸无法用这种方法分析。
     十一种不同的嵌合体被设计出来， 其中七种线性多肽序列分别或组合被取代。对 于每一种嵌合体， 小鼠的 GM-CSF 氨基酸用粗体标出。预测的各嵌合体间不同的 N- 连接的 糖基化位点用下划线标出。每一种嵌合体都在 HEK293 细胞作为家兔 Fc 融合蛋白来表达， 以容许通过家兔 Fc 部分来进行纯化和定量。使用抗家兔 Fc 抗体进行的融合蛋白的对照 Western 印迹显示相同量的各种 GM-CSF 嵌合融合蛋白加载在凝胶中。 不同嵌合体迁移率变 动 (mobility shift) 的不同是由于人和小鼠 GM-CSF 糖基化不同导致的。
     GM-CSF 嵌合体与 EV1003 的 Western 印迹显示嵌合体 3、 6、 9 和 10 显示微弱结合或 不结合。嵌合体 9 是嵌合体 3 和 6 的组合， 而嵌合体 10 是嵌合体 2 和 6 的组合。因此， 在 嵌合体 3 和 6 或包含一个或全部两个这些区域的组合所代表的位置上包含小鼠氨基酸的所 有嵌合体不再被 EV1003 识别。因此这些代表 EV1003 的表位。将嵌合体 3 和 6 空间作图到 GM-CSF 三维晶体结构上显示， 这些嵌合体在 GM-CSF 分子的一个面上相互邻接， 与这些发现 吻合得很好。这个面代表被 EV1003 识别的不连续的表位。
     用 EV1019 对 GM-CSF 嵌合体的 Western 印迹显示， 嵌合体 4、 5 和 11 显示微弱结合 而嵌合体 8 几乎不结合。嵌合体 11 是嵌合体 1 和 5 的组合， 而嵌合体 8 是嵌合体 4 和 5 的 结合。因此， 在嵌合体 4 或 5 所代表的位置上包含小鼠氨基酸的所有嵌合体显示与 EV1019的微弱结合。嵌合体 8， 其包含了嵌合体 4 和 5 所代表的位置上小鼠氨基酸的组合， 不再被 EV1019 识别。 因此嵌合体 4 和 5 的组合代表 EV1019 的表位。 将嵌合体 4 和 5 的空间作图到 GM-CSF 三维晶体结构上显示， 这些嵌合体在 GM-CSF 分子的一个面上相互邻接， 与这些发现 吻合得很好。这个表面代表被 EV1019 识别的不连续的表位。因为这两个区域均对 EV1019 的高亲和力结合是必要的， 所述不连续的表位必须由变体 4 和 5 的氨基酸组成， 这两个变体 彼此非常靠近， 并且位于或靠近 GM-CSF 的表面 ( 因此影响表面暴露的氨基酸残基 )。这些 分别是氨基酸 60-63(ELYK) 和 78-87(TMMASHYKQH)(SEQ ID NO ： 3)。76(P) 位氨基酸可能有 作用。嵌合体 4 的 68-69(SL) 位氨基酸不太可能在结合的表位中发挥重要作用， 因为其与 嵌合体 4 和 5 接触面的距离较远， 但是， 这不能完全排除。
     GM-CSF 嵌合体与 EV1018 的 Western 印迹显示， 嵌合体 4、 5 和 11 表现微弱结合而 嵌合体 8 几乎不结合。嵌合体 11 是 1 和 5 的结合， 而嵌合体 8 是 4 和 5 的结合。因此， 在嵌 合体 4 或 5 所代表的位置上包含小鼠氨基酸的所有嵌合体与 EV1018 微弱结合。嵌合体 8， 其包含了嵌合体 4 和 5 所代表的位置上小鼠氨基酸的组合， 不再被 EV1018 识别。因此嵌合 体 4 和 5 的组合代表 EV1018 的表位。将嵌合体 4 和 5 空间作图到 GM-CSF 三维晶体结构上 显示， 这些嵌合体在 GM-CSF 分子的一个面上相互邻接， 与这些发现吻合得很好。这个表面 代表被 EV1018 识别的不连续的表位。因为这两个区域均对 EV1018 的高亲和力结合是必要 的， 所述不连续的表位必须由变体 4 和 5 的氨基酸组成， 这两个变体彼此非常靠近， 并且位 于或靠近 GM-CSF 的表面 ( 因此影响表面暴露的氨基酸残基 )。 这些分别为氨基酸″ ELYK″ 和″ TMMASHYKQH″。
     这些结果表明 EV1018 和 EV1019 识别 GM-CSF 分子的相同的不连续表位， 然而 EV1003 识别的 GM-CSF 分子表位与 EV1018 和 EV1019 识别的表位不同。
     序列表
     全长 hGM-CSF
     MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEP
     TCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDC
     WEPVQE
     (SEQ ID NO ： 1)
     EV1018 和 EV1019 的不连续表位
     ＞残基 77-80
     ELYK
     (SEQ ID NO ： 2)
     残基 95-104
     TMMASHYKQH
     (SEQ ID NO ： 3)
     EV1018 CDR
     ＞ EV1018 HC CDR1
     SYGMH
     (SEQ ID NO ： 4)
     ＞ EV1018 HC CDR2LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO ： 5) ＞ EV1018 HC CDR3 ESMGAINDN (SEQ ID NO ： 6) ＞ EV1018 LC CDR1 IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO ： 7) ＞ EV1018 LC CDR2 GRSPPS (SEQ ID NO ： 8) ＞ EV1018 LC CDR3 STWDSSLSAVV (SEQ ID NO ： 9) 不带信号序列的 EV1018 重链
     不带信号序列的 EV1018 轻链
     不带信号序列的 EV1018 重链
     带信号序列的 EV1018 重链
     带信号序列的 EV1018 轻链
     带信号序列的 EV1018 重链
     不带信号序列的 EV1019 重链可变区
     不带信号序列的 EV1019 重链
     不带信号序列的 EV1019 轻链可变区
     不带信号序列的 EV1019 轻链
     不带信号序列的 EV1019 重链
     带信号序列的 EV1019 重链
     带信号序列的 EV1019 轻链
     带信号序列的 EV1019 重链
     (SEQ ID NO ： 313) EV1018 和 EV1019 的共有序列＞ VH-CDR1
     FTFSX1X2MH
     X1 是 Y 或 H， 且 X2 是 G 或 A
     (SEQ ID NO ： 314)
     ＞ VH-CDR2
     X3X4X5HXnGXnX6KX7YADSVX8G
     每个 Xn 独立地是任何天然存在的氨基酸， X3 是 L 或 V， X4 是 T 或 I， X5 是 Y 或 W， X6 是 R 或 K， X7 是 F 或 Y， 且 X8 是 R 或 K
     (SEQ ID NO ： 315)
     ＞ VH-CDR3
     EXnX9GX10XnXnDXn
     每个 Xn 独立地是任何天然存在的氨基酸， X9 是 M 或 V， 且 X10 是 A 或 G
     (SEQ ID NO ： 316)
     ＞ VL-CDR1
     XnGNXnXnNIGSX11AVG
     每个 Xn 独立地是任何天然存在的氨基酸， 且 X11 是 H 或 Y
     (SEQ ID NO ： 317)
     ＞ VL-CDR2
     GX12SPX13SG
     X12 是 R 或 K， 且 X13 是 A 或 P
     (SEQ ID NO ： 318)
     ＞ VL-CDR3
     STWDSX14LSAVX15
     X14 是 R 或 S， 且 X15 是 V 或 L
     (SEQ ID NO ： 319)
     EV1003 和 EV1007 序列
     信号序列和别的序列 ＞ EV1018 MEFGLIWVFLVTLLRGVQC (SEQ ID NO ： 324) ＞ EV1018-wt IgG1KO MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO ： 325) ＞ EV1018 wt-original MAWTPLLLQLLTLCSGSWA (SEQ ID NO ： 326) TGTSSDVENYNLVS (SEQ ID NO ： 327) EGSKRPS (SEQ ID NO ： 328) CSYAGSSVVV (SEQ ID NO ： 329) SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO ： 330) GKSPAS (SEQ ID NO ： 331) STWDSRLSAVL (SEQ ID NO ： 332) SHAMH (SEQ ID N0 ： 333) VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO ： 334) EWVGGTCDS (SEQ ID NO ： 335)SGSSSNIGNSYVY (SEQ ID NO ： 336) RNNRRPS (SEQ ID NO ： 337) ATWDDSLSGRL (SEQ ID NO ： 338) RYGIK (SEQ ID NO ： 339) WINTRSGVPAYAQGFTG (SEQ ID NO ： 340) RPPRFYDKTEYWEDGFDV (SEQ ID NO ： 341) RASHRVSSNYLA (SEQ ID NO ： 342) GASNRAT (SEQ ID NO ： 343) QQYASSPVT (SEQ ID NO ： 344) TFALH (SEQ ID NO ： 345) SINTASGKTKFSTKFQD (SEQ ID NO ： 346) DRFQNIMATILDV (SEQ ID NO ： 347) EV1018 重链可变区
     EV1018 轻链可变区 ＞ EV1018-VL-wt-original QSALTQETSVSGTVGQKVTLSCIGNNNNIGSHAVGWYQQISRGAPKMVLFGRSPPSGVPDRFSGSKSGT TASLIISGLQPEDEADYYCSTWDSSLSAVVFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO ： 364) ＞ EV1018-VL-wt-BI QSALTQETSVSGTVGQKVTLSCIGNNNNIGSHAVGWYQQISRGAPKMVLFGRSpPSGVPDRFSGSKSGT TASLIISGLQPEDEADYYCSTWDSSLSAWFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO ： 365)