一种固定相和利用该固定相纯化脂肽的方法 技术领域 本发明涉及脂肽的纯化方法， 更具体地， 本发明涉及到一种固定相和利用该固定 相纯化脂肽的方法。
背景技术 近年来， 在某些真菌的发酵液中发现了具有抗真菌活性的环肽类物质。 这些肽类， 主要是环状的六肽， 通常被称为棘白菌素类物质， 如纽莫康定， WF11899， 棘球白素等。对 这些环肽类物质进行化学修饰可以得到用于临床治疗的半合成抗生素。化合物 I( 纽莫康 定 B0) 是天然产物， 一般用于作为合成化合物 II 的原料。化合物 II 的醋酸盐作为一种肽 类抗生素用于治疗侵袭性曲霉菌感染、 食管念珠菌病、 由念珠菌属引起的腹内脓肿病、 胸膜 炎、 腹腔感染， 以及嗜中性粒细胞减少症患者不明致病源引起的发热等。该化合物的醋酸 盐 ( 醋酸卡泊芬净， 商品名科赛斯， CANCIDAS) 目前作为静脉给药的抗真菌药在多个国家销 售。
化合物 I化合物 II
脂肽类如化合物 I 是发酵过程中的常见产物， 在该发酵过程中， 许多密切相关的 类似物与所需产物一起产生。
具有 1065 道尔顿分子量的化合物 I( 纽莫康定 B0) 是天然产物， 通过发酵作为次 级代谢产物产生。化合物 I( 纽莫康定 B0) 和两种关键类似物杂质纽莫康定 B5 和 E0 的结构 都属于二甲基肉蔻酸酯侧链偶联的环状六肽， 如表 1 所示。
表 1 纽莫康定 B0 和其三种类似物R1 OH OH OH R2 OH H OH R3 Me Me Me R4 OH OH OH R5 H H H R6 OH OH H化合物 纽莫康定 B0(I) 纽莫康定 B5 纽莫康定 E0
硅胶色谱利用所需的产物包括纽莫康定 B5 和 E0 在内的类似物杂质的富羟基环状 六核的结合亲和性的细微差异来实现分离。纽莫康定 B5 和 E0， 是纽莫康定 B0 的发酵产物中 的两种关键类似物杂质， 在发酵产物中所占比例约为 6-10％， 在硅胶 HPLC 纯化中， 洗脱时非常接近纽莫康定 B0。故为了使含有这些类似物杂质的原料经纯化后能达到所需的纯度， 可以加载在色谱柱上的纽莫康定 B0 粗品的量受到很大的限制。所以人们极其努力地提高 对关键杂质的分离度。
国际申请 WO2004/042350 公开了一种利用氨基酸作为流动相改性剂， 以提高杂 质分离效果的方法， 但该方法后处理中需除去其中的氨基酸， 操作比较繁复。中国申请 CN1845751 公开了一种 N-β- 丙氨酰胺基丙基二氧化硅的固定相， 以及利用该固定相和特 定的流动相纯化肽或脂肽的方法， 但此方法对结构类似杂质如纽莫康定 B5 和 E0 的分离效果 较差， 且收率也不高。
因此， 本领域迫切需要提供一种操作简单、 得率和分离效果显著的纯化脂肽的方 法。 发明内容
本发明旨在提供一种固定相。 本发明的另一个目的是利用提供的固定相进行脂肽的纯化。 在本发明的第一方面， 提供了一种具有如下结构或其盐形式的固定相，
其中 R 是 H， (CH2)nCONH2， (CH2)nNH2 或 (CH2)nNH(CH2)nCONH2 ； m是2或3； n 是 1-8 ； 和 R1 是 C2-C6 烷基。 在另一优选例中， 所述的固定相具有以下结构 ：
其中 R1 是 C2、 C4、 C5、 或 C6 烷基。 在另一优选例中， 所述固定相具有如下结构 ：在另一优选例中， 所述固定相具有如下结构 ：
其中 R2 是 C1、 C2、 或 C3 烷基。 在另一优选例中， 所述固定相具有如下结构 ：在本发明的第二方面， 提供了一种利用具有固定相和流动相的液体色谱体系纯化 脂肽的方法， 所述的方法包括步骤 ： 负荷脂肽的选自上述本发明提供的固定相经流动相洗 脱， 得到纯化的脂肽。
所述方法的流动相包含溶剂 A， 溶剂 B 和水 ； 所述溶剂 A 选自 C1-4 醇、 C1-4 酮中的 一种或多种的混合物 ； 所述溶剂 B 选自二氯甲烷、 己烷、 庚烷、 乙酸乙酯、 乙酸异丙脂、 乙腈 中的一种或多种的混合物。在另一优选例中， 所述流动相中， 溶剂 A 和溶剂 B 的体积比为 0.01-100 ∶ 1， 该流动相含有水 0.1-10v/v％。
所述方法中所述的脂肽为卡泊芬净、 米卡芬净、 或阿尼芬净的发酵产物前体。 在另 一优选例中， 所述脂肽为卡泊芬净的发酵产物前体 ： 纽莫康定 (Pneumocandin)B0。
在本发明的第三方面， 提供了一种利用上述本发明提供的方法制备的脂肽， 所述 的脂肽中纽莫康定 B5 和 E0 的 HPLC 含量小于 1％。
在另一优选例中， 所述的脂肽中纽莫康定 B5 和 E0 的 HPLC 含量小于 0.3％。
据此， 本发明提供了一种操作简单、 得率和分离效果显著的纯化脂肽的方法。
附图说明
图 1 为本发明的固定相 A 和 B 的制备流程图。 图 2 为实施例 7 中纽莫康定 B0 粗品原料的色谱分析图。 图 3 为实施例 7 中固定相为 N-β- 丙氨酰胺基丙基二氧化硅的纯化效果色谱分析 图 4 为实施例 7 中固定相 A 纯化效果色谱分析图。 图 5 为实施例 7 中固定相 B 纯化效果色谱分析图。 图 6 为实施例 7 中固定相 C 纯化效果色谱分析图。 图 7 为实施例 7 中固定相 D 纯化效果色谱分析图。 图 8 为实施例 7 中固定相 E 纯化效果色谱分析图。 图 9 为实施例 7 中固定相 F 纯化效果色谱分析图。7图。
102335596 A CN 102335605
说明书5/11 页图 10 为实施例 10 中乙酸乙酯、 甲醇、 水， 流动相体系纯化效果色谱分析图。 图 11 为实施例 10 中正己烷、 甲醇、 水， 流动相体系纯化效果色谱分析图。具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究， 发现了一种固定相， 具有以下结构或其盐形式 ：
其中 R 是 H， (CH2)nCONH2， (CH2)nNH2 或 (CH2)nNH(CH2)nCONH2 ； m是2或3； n 是 1-8 ； 和 R1 是 C2-C6 烷基。 进一步地， 发明人发现利用该固定相可纯化得到高纯度脂肽， 收率高， 且纯化方法简单。 在本发明的一个实施例中， 以上结构中的 m 为 3， 并且 R1 是 C2、 C4-C6 烷基， 也就是 固定相具有如下结构 ：
在本发明的另一个实施例中， 以上结构中的 m 为 2， 固定相具有如下结构 ：
其中 R2 是 C1、 C2、 或 C3 烷基。 特别地， 作为一个优选的例子， 所述固定相具有如下结构 ：
固定相 A
或具有如下结构 ：
固定相 B
或具有如下结构 ： 固定相 C 或具有如下结构 ：
固定相 D
或具有如下结构 ：
固定相 E
或具有如下结构 ：
固定相 F本发明提供了利用上述本发明提供的各种结构的固定相和流动相的液体色谱体 系纯化脂肽的方法。
本发明所述的脂肽为卡泊芬净， 米卡芬净或阿尼芬净的发酵产物前体， 特别地， 所 述的脂肽为卡泊芬净的发酵产物前体 ： 纽莫康定 (Pneumocandin)B0。
本发明一个优选实施例中， 纯化脂肽的方法包括步骤 ：
第一步， 将含纽莫康定 B0 的发酵产物 ( 粗品 ) 加载到装填有本发明提供的下述结 构的固定相的高效液相色谱 (HPLC) 柱上 ：
或
其中 R 是 H， (CH2)nCONH2， (CH2)nNH2 或 (CH2)nNH(CH2)nCONH2 ； n 是 1-8 ；R1 是 C2-C6 烷基 ；
R2 是 C1、 C2、 或 C3 烷基 ；
第二步， 用洗涤缓冲液进行洗涤 ；
第三步， 用流动相进行洗脱， 得到纯化的脂肽。
上述第一步中， 高效液相色谱 (HPLC) 柱的体积为 0.004-1.8L， 加载在色谱柱上的 纽莫康定 B0 粗品的量为 0.018-40g， 较佳的为 0.036-30g
本文使用的术语 “洗涤缓冲液” 指在洗脱目标多肽分子之前， 用来洗涤或重平衡装 填有固定相的 HPLC 色谱柱的缓冲液。方便的， 洗涤缓冲液和加样缓冲液可以同一缓冲液， 但这不是必须的。
如本文所用， “流动相” 和 “洗脱缓冲液” 可以互换使用， 都是指用来将目标多肽从 固相上洗脱下来的缓冲液。
在本发明中， 所述流动相包含溶剂 A， 溶剂 B 和水 ； 所述溶剂 A 选自下述的一种或 多种的混合 ： C1-4 醇、 C1-4 酮 ； 所述溶剂 B 选自下述的一种或多种的混合 ： 二氯甲烷、 己烷、 庚 烷、 乙酸乙酯、 乙酸异丙脂、 和乙腈。
所述流动相中， 溶剂 A 和溶剂 B 的体积比为 0.01-100 ∶ 1， 较佳地为 0.1-10 ∶ 1 ； 所述流动相含有水 0.1-10v/v％， 较佳地含有水 1.0-8.0％。 特别地， 所述流动相为二氯甲烷， 甲醇和水的混合物， 且其体积比为 80 ∶ 20 ∶ 2。
本发明提到的上述特征， 或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示 的所有特征可与任何组合物形式并用， 说明书中所揭示的各个特征， 可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明， 所揭示的特征仅为均等或相似特 征的一般性例子。
本发明的主要优点在于 ：
1、 本发明提供的纯化脂肽的方法不需要在流动相中添加流动相改性剂， 避免了繁 杂的后处理操作， 有利于工业化生产和降低成本。
2、 本发明的纯化脂肽的方法物质得率和分离效果得到特别显著的提高。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则所有的百分数、 比率、 比例、 或份数按 重量计。
文中所提到的柱体积 ( 此后称作 cv) 定义为穿过柱体所需溶剂的体积。柱负荷是 指一次纯化施加到柱内的物质 ( 粗脂肽 ) 的量。柱负荷还可以称柱进样或进样负荷。
除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之。
下述实施例中纽莫康定 B0 纯度检测所用的方法 ：
收集组分， 通过反相 HPLC 进行分析， 样本在 Waters 分析性 HPLC 体系上进行分析。 反相 HPLC 分析用于测定纽莫康定 B0 和其它类似物， 包括纽莫康定 E0， 纽莫康定 B5。反相分 析采用 YMCJ’ 球柱 (JM08SO4-2546WT) 的梯度 HPLC 法， 粒径 4μm 和孔径 80 。 柱子为 4.6mm 内径 (i.d..)×250cm 并且保持在 30℃。采用的两种流动相是 0.1％磷酸 (A) 和乙腈 (B)。
洗脱梯度是从 60％ A 和 40％ B( 体积比 ) 开始并且在 45 分钟内以 1.5mL/ 分钟变化为 1％ A 和 99％ B， 并且在 210nm 下 UV 检测。
实施例 1
固定相 A 的制备
于 500ml 圆底烧瓶中， 依次投入 99g 丙烯酰胺、 33g 4- 氨基丁基三乙氧基硅烷和 300ml 二氯甲烷， 20 ～ 25℃下搅拌 17 ～ 18h。过滤去除未反应完的丙烯酰胺， 向滤液中加 入 110ml 水， 搅拌 10min， 静置， 分层后， 弃除水相。有机相加入 30g 无水硫酸钠脱水。真空 浓缩得到 22.5g 油状物。
于 1L 四颈烧瓶中， 依次投入 600ml 甲苯和 150g 300 ～ 400 目硅胶。加热到 110℃ 下回流脱水 3h。 停止加热， 降温， 待反应液的温度降至 50℃后， 用 30ml 甲苯溶解 22.5g 油状 物， 将含有 22.5g 油状物甲苯溶液， 缓慢滴加其中， 约 30min 滴毕， 滴毕后继续加热至 110℃， 回流 2h。停止加热， 待反应液冷却到室温后， 过滤。滤饼用 800ml 的二氯甲烷和甲醇 (V/V ＝ 1 ∶ 1) 的混合溶液洗涤三到四次。洗涤完毕后抽干， 得到 150g 固定相 A， 取部分填充到 4.6mm 内径 (i.d.)×250mm 长 HPLC 柱内用于评估。
实施例 2 固定相 B 的制备
于 1000ml 圆底烧瓶中， 依次投入 200g 丙烯酰胺、 58g 4- 氨基丙基甲基二甲氧基硅 烷和 600ml 二氯甲烷， 20 ～ 25℃下搅拌 17 ～ 18h。过滤去除未反应完的丙烯酰胺， 真空浓 缩滤液得到 62.5g 油状物。
于 3000mL 四颈烧瓶中， 依次投入 1200mL 甲苯和 300g 300 ～ 400 目硅胶。加热到 110℃下回流脱水 3h。 停止加热降温， 待反应液的温度降至 50℃后， 用 60ml 甲苯溶解 62.5g 油状物， 将含有 62.5g 油状物甲苯溶液， 缓慢滴加其中， 约 30min 滴毕， 滴毕后继续加热至 110℃， 回流 2h。停止加热， 待反应液冷却到室温后， 过滤。滤饼用 1600mL 的二氯甲烷和甲 醇 (V/V ＝ 1 ∶ 1) 的混合溶剂洗涤三到四次。洗涤完毕后抽干， 得到 312g 固定相 B， 取部 分填充到 4.6mm 内径 (i.d.)×250mm 长 HPLC 柱内用于评估。
实施例 3
固定相 C 的制备
于 1L 四颈烧瓶中， 依次投入 600ml 甲苯和 150g 300 ～ 400 目硅胶。加热到 110℃ 下回流脱水 3h。 停止加热降温， 待反应液的温度降至 50℃后， 用 30ml 甲苯溶解 35g N-(2- 氨 乙基 )-3- 氨丙基三甲氧基硅烷， 然后缓慢滴加至反应液中， 约 30min 滴毕， 滴毕后继续加热 至 110℃， 回流 2h。停止加热， 待反应液冷却到室温后， 过滤。滤饼用 800ml 的二氯甲烷和 甲醇 (V/V ＝ 1 ∶ 1) 的混合溶剂洗涤三到四次。洗涤完毕后抽干， 得到 140g 固定相 C， 取部 分填充到 4.6mm 内径 (i.d.)×250mm 长 HPLC 柱内用于评估。
实施例 4
固定相 D 的制备
于 1L 四颈烧瓶中， 依次投入 600ml 甲苯和 150g 300 ～ 400 目硅胶。加热到 110℃ 下回流脱水 3h。 停止加热降温， 待反应液的温度降至 50℃后， 用 30ml 甲苯溶解 35gN-(2- 氨 乙基 )-3- 氨丙基二甲氧基甲基硅烷， 然后缓慢滴加至反应液中， 约 30min 滴毕， 滴毕后继续 加热至 110℃， 回流 2h。停止加热， 待反应液冷却到室温后， 过滤。滤饼用 800ml 的二氯甲
烷和甲醇 (V/V ＝ 1 ∶ 1) 的混合溶剂洗涤三到四次。洗涤完毕后抽干， 得到 145g 固定相 D， 取部分填充到 4.6mm 内径 (i.d.)×250mm 长 HPLC 柱内用于评估。
实施例 5
固定相 E 的制备
于 500ml 圆底烧瓶中， 依次投入 99g 丙烯酰胺、 46g N-(2- 氨乙基 )-3- 氨丙基二甲 氧基甲基硅烷和 300ml 二氯甲烷， 20 ～ 25℃下搅拌 17 ～ 18h。过滤去除未反应完的丙烯酰 胺， 向滤液中加入 110ml 水， 搅拌 10mi n， 静置， 分层后， 弃除水相。有机相加入 30g 无水硫 酸钠脱水。真空浓缩得到 29.5g 油状物。
于 1L 四颈烧瓶中， 依次投入 600ml 甲苯和 150g 300 ～ 400 目硅胶。加热到 110℃ 下回流脱水 3h。停止加热降温， 待反应液的温度降至 50℃后， 用 30ml 甲苯溶解 29.5g 油状 物， 将含有 29.5g 油状物甲苯溶液， 缓慢滴加其中， 约 30min 滴毕， 滴毕后继续加热至 110℃， 回流 2h。停止加热， 待反应液冷却到室温后， 过滤。滤饼用 800ml 的二氯甲烷和甲醇 (V/V ＝ 1 ∶ 1) 的混合溶剂洗涤三到四次。洗涤完毕后抽干， 得到 165g 固定相 E， 取部分填充到 4.6mm 内径 (i.d.)×250mm 长 HPLC 柱内用于评估。
实施例 6 固定相 F 的制备
于 500ml 圆底烧瓶中， 依次投入 99g 丙烯酰胺、 45g N-(2- 氨乙基 )-3- 氨丙基三甲 氧基硅烷和 300ml 二氯甲烷， 20 ～ 25℃下搅拌 17 ～ 18h。过滤去除未反应完的丙烯酰胺， 向滤液中加入 110ml 水， 搅拌 10min， 静置， 分层后， 弃除水相。有机相加入 30g 无水硫酸钠 脱水。真空浓缩得到 28.9g 油状物。
于 1L 四颈烧瓶中， 依次投入 600ml 甲苯和 150g 300 ～ 400 目硅胶。加热到 110℃ 下回流脱水 3h。停止加热降温， 待反应液的温度降至 50℃后， 用 30ml 甲苯溶解 28.9g 油状 物， 将含有 28.9g 油状物甲苯溶液， 缓慢滴加其中， 约 30min 滴毕， 滴毕后继续加热至 110℃， 回流 2h。停止加热， 待反应液冷却到室温后， 过滤。滤饼用 800ml 的二氯甲烷和甲醇 (V/V ＝ 1 ∶ 1) 的混合溶剂洗涤滤饼三到四次。洗涤完毕后抽干， 得到 150g 固定相 F， 取部分填 充到 4.6mm 内径 (i.d.)×250mm 长 HPLC 柱内用于评估。
实施例 7
七种固定相分离效果比较
采用 4.6mm 内径 (i.d.)×250cm 长分析级 HPLC 柱， 来比较采用纽莫康定 B0 及其 类似物的分析负荷时通过不同的固定相得到的保留和选择特性。不同的固定相包括 ： (1) N-β- 丙氨酰胺基丙基二氧化硅 (CN1845751 中使用的固定相 )， (2) 本发明的固定相 A， (3) 本发明的固定相 B， (4) 本发明的固定相 C， (5) 本发明的固定相 D， (6) 本发明的固定相 E， (7) 本发明的固定相 F。所有这些固定相填充物具有 300-400 目粒径， 所使用的流动相为 80/20/2(v/v/v) 的二氯甲烷 / 甲醇 / 水。用纯度为 82.5％的纽莫康定 B0 粗品 ( 其分析色 谱图见图 2) 作为纯化的样品， 其中纽莫康定 B5 和 E0 的含量为 8.5％， 制备该粗品的方法公 开在美国专利 5202309、 5194377 和 6610822 中。
使用之前， 柱子用 10 个柱体积的甲醇冲洗， 并且用 2 个柱体积的二氯甲烷冲洗， 然 后用 3 个柱体积的流动相平衡， 纽莫康定 B0 的进样量为 36mg， 流动相流速为 0.15mL/ 分钟。 在每次运行时， 通过 UV 检测 278nm 的吸收度。
流动相为 80/20/2(v/v/v) 的二氯甲烷 / 甲醇 / 水洗脱， 收集馏分用反相 HPLC 检 测纽莫康定 B0 的纯度， 其分析色谱图见图 3， 图 4， 图 5， 图 6， 图 7， 图 8， 图 9， 评价分离的效 果见表 2， 表 3。
表2
表3固定相 C B0 纯度 (％ ) B5 和 E0(％ ) 收率 (％ ) 97.7 0.28 94.0 固定相 D 97.9 0.31 94.8 固定相 E 98.0 0.22 95.2 固定相 F 97.4 0.24 93.9
实施例 8
固定相 A 纯化纽莫康定 B0 中试实施
将实施例 1 中制备的固定相 A 填充入内径 80mm(i.d.)×600mm 制备柱中， 柱压 30bar， 柱床体积约 1.8L。柱子用 2 个柱体积的甲醇冲洗， 并且用 1 个柱体积的二氯甲烷冲 洗， 在进行纯化的一个样品进样前， 用 2 个柱体积流动相平衡。 用纯度为 83.1％的纽莫康定 B0 粗品作为纯化的样品， 制备该粗品的方法公开在美国专利 5202309、 5194377 和 6610822 中。其中纽莫康定 B5 和 E0 的含量为 8.5％， 纽莫康定 B0 的进样量为 19.2g， 上样后用流动 相为 80/20/2(v/v/v) 的二氯甲烷 / 甲醇 / 水洗脱， 流速 100 毫升 / 分钟， 5-12 个柱体积为 纽莫康定 B5 和纽莫康定 E0 的馏分， 13-14 柱体积为纽莫康定 B0 的馏分。得到的富集截留物 ( 纽莫康定 B0) 收率 96.1％， 纯度 97.7％， 纽莫康定 B5 和 E0 的含量为 0.28％。
实施例 9
固定相 B 纯化纽莫康定 B0 中试实施
按实施例 2 中制备方法制备固定相 B 填充入内径 80mm(i.d.)×600mm 制备柱中， 柱压 30bar， 柱床体积约 1.8L。柱子用 2 个柱体积的甲醇冲洗， 并且用 1 个柱体积的二氯甲 烷冲洗， 在进行纯化的一个样品进样前， 用 2 个柱体积流动相平衡， 用纯度为 81.9％的纽莫 康定 B0 粗品作为纯化的样品。其中纽莫康定 B5 和 E0 的含量为 8.5％， 制备该粗品的方法公 开在美国专利 5202309、 5194377 和 6610822 中。纽莫康定 B0 的进样量为 20.1g， 上样后用 流动相为 80/20/2(v/v/v) 的二氯甲烷 / 甲醇 / 水洗脱， 流速 100 毫升 / 分钟， 4-12 个柱体积为纽莫康定 B5 和纽莫康定 E0 的馏分， 13-15 柱体积为纽莫康定 B0 的馏分。得到的富集截 留物 ( 纽莫康定 B0) 收率 95.4％， 纯度 97.9％， 纽莫康定 B5 和 E0 的含量为 0.22％。
实施例 10
不同流动相纯化纽莫康定 B0 实验比较
将实施例 1 中制备的固定相 A 填充入 80mm 内经 (i.d.)×600mm 制备柱中， 柱压 30bar， 柱床体积约 1.8L。柱子用 2 个柱体积的甲醇冲洗， 并且用 1 个柱体积的乙酸乙酯冲 洗， 在进行纯化的一个样品进样前， 用 2 个柱体积流动相 88/9/7(v/v/v) 乙酸乙酯 / 甲醇 / 水平衡。用纯度为 83.1％的纽莫康定 B0 粗品作为纯化的样品， 纽莫康定 B5 和 E0 含量为 8.5％。通过将粗品溶解在为 75/20/8(v/v/v) 乙酸乙酯 / 甲醇 / 水的混合物中制备进样溶 液， 纽莫康定 B0 的进样量为 18.3g， 上样后用流动相为 88/9/7(v/v/v) 乙酸乙酯 / 甲醇 / 水 洗脱， 流速为 100mL/ 分钟， 6-10 个柱体积为纽莫康定 B5 和纽莫康定 E0 的馏分， 11-13 柱体 积为纽莫康定 B0 的馏分。得到的富集截留物 ( 纽莫康定 B0) 收率 94.1％， 纯度 96.9％， 纽 莫康定 B5 和 E0 的含量为 0.94％， 分析色谱图见图 10。
实施例 11
将实施例 1 中制备的固定相 A 填充入 80mm 内经 (i.d.)×600mm 制备柱中， 柱压 30bar， 柱床体积约 1.8L。 柱子用 2 个柱体积的甲醇冲洗， 并且用 1 个柱体积的正己烷冲洗， 在进行纯化的一个样品进样前， 用 2 个柱体积流动相 75/24/4(v/v/v) 正己烷 / 甲醇 / 水平 衡， 流速为 100mL/ 分钟。用纯度为 83.1％的纽莫康定 B0 粗品作为纯化的样品， 纽莫康定 B5 和 E0 含量为 8.5％。纽莫康定 B0 的进样量为 18.3g， 上样后用流动相为 75/24/4(v/v/v) 正 己烷 / 甲醇 / 水洗脱， 7-12 个柱体积为纽莫康定 B5 和纽莫康定 E0 的馏分， 13-16 柱体积为 纽莫康定 B0 的馏分。得到的富集截留物 ( 纽莫康定 B0) 收率 91.1％， 纯度 97.2％， 纽莫康 定 B5 和 E0 的含量为 0.70％分析色谱图见图 11。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并非用以限定本发明的实质技术内容范 围， 本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中， 任何他人完成的技术 实体或方法， 若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同， 也或是一种等效的变更， 均将 被视为涵盖于该权利要求范围之中。