一种制备恒河猴局灶性脑缺血模型的方法.pdf

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1、10申请公布号CN101986834A43申请公布日20110323CN101986834ACN101986834A21申请号200910060244822申请日20090804A01K67/027200601A61D1/00200601A61B19/0020060171申请人四川大学华西医院地址610041四川省成都市外南国学巷37号申请人成都华西海圻医药科技有限公司国家成都中药安全性评价中心72发明人何俐王莉李宏霞郑洪波周沐科郭建陈宁杨觅曹文英肖力周东74专利代理机构北京律诚同业知识产权代理有限公司11006代理人李高峡54发明名称一种制备恒河猴局灶性脑缺血模型的方法57摘要本发明提供了一。

2、种制备恒河猴局灶性脑缺血模型的方法，它是采用弹簧圈栓塞构建动物模型。本发明还提供了一种筛选治疗局灶性脑缺血的药物的方法，它包括如下步骤A、采用恒河猴局灶性脑缺血模型；B、将候选药物一起施用于恒河猴；C、观察候选药物抑制恒河猴局灶性脑缺血模型的情况，并进行评分，评价潜在的治疗局灶性脑缺血的药物。本发明采用血管内介入弹簧圈栓塞法构建恒河猴局灶性脑缺血模型，有较高的稳定性，较高的安全性，较好的可重复性，是一种可良好模拟临床的简便易行的恒河猴局灶性脑缺血模型。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图4页CN101986834A1/1页21一种制备恒河猴。

3、局灶性脑缺血模型的方法，其特征在于它是采用弹簧圈栓塞构建动物模型。2根据权利要求1所述的恒河猴局灶性脑缺血模型的制备方法，其特征在于它包括如下步骤A、动物麻醉将恒河猴进行药物麻醉；B、脑缺血再灌注模型的建立采用SELDINGER技术行经皮股动脉穿刺；成功后以4F造影导管行主动脉弓上血管和脑血管造影了解颅内动脉走形情况；造影结束后，导管尾端接Y型带阀接头，其侧臂带三通软连接管并与加压输液袋相连，持续滴入生理盐水以防血栓形成；选择走形平直的一侧大脑中动脉，将微导管引至MCAM1段中远端后释放出弹簧圈，完全阻断一侧大脑中动脉中远端血流，之后退出支撑导丝；栓塞1H后，撤出弹簧圈，再次行超选择造影，证实。

4、MCA血流恢复，然后拔出微导管、动脉血管鞘，股动脉区局部压迫20MIN。3根据权利要求2所述的恒河猴局灶性脑缺血模型的制备方法，其特征在于B步骤是在DSA直视下进行血管内介入操作。4一种筛选治疗局灶性脑缺血的药物的方法，它包括如下步骤A、采用权利要求13的方法制备恒河猴局灶性脑缺血模型；B、将候选药物一起施用于恒河猴；C、观察候选药物抑制恒河猴局灶性脑缺血模型的情况，并进行评分，评价潜在的治疗局灶性脑缺血的药物。权利要求书CN101986834A1/7页3一种制备恒河猴局灶性脑缺血模型的方法技术领域0001本发明涉及恒河猴局灶性脑缺血模型的方法。背景技术0002脑卒中是严重危害人类生命健康的疾。

5、病，是目前导致人类死亡的第二大病因，也是成年人致残的一个主要原因。世界范围内大约2/3的卒中发生在发展中国家。在我国，由于人口基数大，人口老龄化问题日益突出，卒中发病率逐年增加。卒中存活者中50遗留严重残疾，10的患者需要长期专人护理，再加上昂贵的治疗费用，给社会和家庭带来沉重的负担。最常见的卒中类型是缺血性脑卒中，约占所有卒中的80。多年来人们一直致力于缺血性卒中的脑损伤机制以及治疗措施的研究。但迄今为止，缺血性脑损伤机制尚未完全探明，现有治疗的效果亦不尽人意，除卒中单元、抗血小板药物如阿司匹林和3小时内TPA静脉溶栓治疗有肯定疗效以外，其他治疗均无可靠证据说明其疗效。因此，进一步探明缺血性。

6、脑损伤机制，探索其他有效安全的治疗措施是亟待解决的问题。0003无论是脑损伤机制的研究还是新治疗措施的探索，都离不开脑缺血动物模型。理想的脑缺血动物模型应该具备接近临床、可重复性好、操作简便以及避免产生附带效应干扰实验结果等特征。0004有文献报道局灶性脑缺血模型的建立方法，多是采用大鼠、家兔建模，如肖育华，局灶性脑缺血模型的建立，中国比较医学杂志，2008年18卷10期，方法随机将26只新西兰兔分成对照组与缺血组，利用三氯化铁溶液刺激实验组兔大脑中动脉，在缺血24H处死，测定脑组织H2O、NA、K、CA2含量，并测定脑梗死范围，观察模型建立的效果。李金国，等，线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型的。

7、研究，泰山医学院学报，2008年4期，采用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型，采用的动物有鼠种和种系制作脑缺血模型选用的实验动物有小鼠、大鼠、蒙古沙土鼠、猫、狗、猪、羊以及灵长类动物猕猴等，其中最为常用的是大鼠，使用率超过90。王晓云，兔大脑中动脉局灶性脑缺血模型制作和正电子发射断层显像观察，中国脑血管病杂志，2007年4卷1期，线栓法制作兔大脑中动脉局灶性脑缺血模型的最适线栓头端直径，并采用正电子发射断层显像技术PET检查缺血脑组织葡萄糖代谢水平的变化。0005非人灵长目动物在种属上与人类十分接近，其脑血管和脑组织对缺血的反应类似于人类。用其构建的脑缺血模型最有可能模拟出人类缺血性脑损伤的疾病过。

8、程。因此，这类动物可能是目前制作脑缺血模型的最佳选择。其中，以大脑中动脉MIDDLECEREBRALARTERY，MCA缺血再灌注模型最为重要。既往的研究通过外科手术暴露MCA然后微血管夹闭、气囊充气压迫等方式阻塞MCA，但术后并发症较多，限制了该模型的应用；近年来，随着血管内介入诊疗技术的快速发展，该技术也被用于各种实验研究，目前已有采用血管内介入法构建的局灶性脑缺血猴模型，但均存在梗死位置不恒定，模型建立后梗死灶大小和瘫痪症状变化较大等不足，很难将该模型用于药物效果的评估。说明书CN101986834A2/7页4发明内容0006本发明的技术方案是提供了一种制备恒河猴局灶性脑缺血模型的方法。。

9、0007本发明提供了一种制备恒河猴局灶性脑缺血模型的方法，它采用弹簧圈栓塞构建动物模型。0008具体地，它包括如下步骤0009A、动物麻醉将恒河猴进行药物麻醉；0010B、脑缺血再灌注模型的建立采用SELDINGER技术行经皮股动脉穿刺；成功后以4F造影导管行主动脉弓上血管和脑血管造影了解颅内动脉走形情况；造影结束后，导管尾端接Y型带阀接头，其侧臂带三通软连接管并与加压输液袋相连，持续滴入生理盐水以防血栓形成；选择走形平直的一侧大脑中动脉，将微导管引至MCAM1段中远端后释放出弹簧圈，完全阻断一侧大脑中动脉中远端血流，之后退出支撑导丝；栓塞1H后，撤出弹簧圈，再次行超选择造影，证实MCA血流恢。

10、复，然后拔出微导管、动脉血管鞘，股动脉区局部压迫20MIN。0011其中，B步骤是在DSA直视下进行血管内介入操作。0012本发明还提供了一种筛选治疗局灶性脑缺血的药物的方法，它包括如下步骤0013A、采用权利要求13的方法制备恒河猴局灶性脑缺血模型；0014B、将候选药物一起施用于恒河猴；0015C、观察候选药物抑制恒河猴局灶性脑缺血模型的情况，并进行评分，评价潜在的治疗局灶性脑缺血的药物。0016本发明采用血管内介入弹簧圈栓塞法构建恒河猴局灶性脑缺血模型，有较高的稳定性，较高的安全性，较好的可重复性，是一种可良好模拟临床的简便易行的恒河猴局灶性脑缺血模型。0017显然，根据本发明的上述内容。

11、，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。0018以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明0019图1恒河猴脑缺血再灌注后不同时间神经功能评分结果0020图21为右MCA栓塞前经4F导管行右侧颈内动脉造影结果，可见右MCA显影良好图中白色箭头所示0021图22为右MCA栓塞后经4F导管行右侧颈内动脉造影结果，可见右MCA的M1中远端未显影图中黑色箭头所示0022图23为弹簧。

12、圈退出后行超选择造影结果，显示M1段中远端血供情况，可见M2段及其远端血管显影良好图中白色箭头所示，证实血流再通。0023图3为缺血再灌注后，动物MCAO004的3个连续扫描层面图像轴位。A图为T2FLAIR，可见异常高信号病灶，其分布与栓塞血管供血区一致；B图为DTI，仍可见右MCA的M1段中远端供血区内异常高信号病灶；说明书CN101986834A3/7页50024图4脑组织切片HE染色结果，其中，图41假手术组HE染色，400，图42模型组HE染色，400，图43模型组HE染色，400，图44模型组HE染色，400具体实施方式0025实施例1本发明动物模型的制备0026一、材料与方法00。

13、27一实验动物0028成年恒河猴3只雄性，4256KG，34岁，动物随机分为2组模型组N2及假手术组N1。假手术组除不进行血管堵塞外，其余所有过程同模型组一致。0029二实验试剂00301麻醉用药00311速眠新00322戊巴比妥钠300333阿托品1ML05MG00344麻黄素30MG；肾上腺素1MG；氯化琥珀胆碱100MG；氯胺酮100MG；咪唑安定10MG；芬太尼01MG；异丙酚200MG；菲克雪浓或贺斯1瓶500ML/瓶00352介入手术用药00361欧乃派克100ML30G00372罂粟碱30MG/1ML00383肝素钠125万U00394尼莫地平20ML4MG0040三实验仪器设备。

14、00411介入手术设备00421PHILIPALLURAXPERFD20血管造影系统004324F导管CORDIS，AJOHNSONJOHNSONCOMPANY00443微导管CORDIS，AJOHNSONJOHNSONCOMPANY00454弹簧圈BOSTONSCIENTIFIC00462磁共振检查设备0047GESIGNAEXCITE30T超导型磁共振成像系统00483动物监护仪器00491心电监护仪RM6240BD，成都仪器厂00502耳温计IR1DA1，MICROLIFE00513腕式血压计EW3012，欧姆龙，日本00524麻醉机、监护仪含心率、心电图、脉搏氧饱和度等模块、微量输液泵。

15、、插管喉镜。00534病理指标检测仪器00541石蜡切片机LEITZ2135，GERMANY00552显微镜OLYMPUSBX51，JAPAN00563微量加液器EPPENDORF4710，10UL，100UL，1000UL，GERMANY说明书CN101986834A4/7页60057二、实验方法0058一动物麻醉及管理0059模型建立手术均在全麻状态下进行，麻醉前动物禁饮禁食12H；麻醉前30MIN给药采用阿托品004MG/KG，IM和氯胺酮10MG/KG，IM。麻醉诱导采用异丙酚152050MG/KG；芬太尼001002MG；氯化琥珀胆碱051MG/KG静脉注射。麻醉维持采取气管插管，使。

16、用麻醉机，采用静脉复合麻醉异丙酚0510MG/KG/MIN；芬太尼001MG/H；咪唑安定05MG/KG/H。0060二术前准备0061为了排除颅内病变，留取基线数据，所有动物术前均行磁共振检查。术前抽取静脉血标本送实验室检查，检查指标包括肝肾功、血糖、电解质、凝血常规等。0062三介入手术操作脑缺血再灌注模型的建立0063DSA直视下进行血管内介入操作。采用SELDINGER技术行经皮股动脉穿刺。成功后以4F造影导管行主动脉弓上血管和脑血管造影以了解颅内动脉走形情况。造影结束后，导管尾端接Y型带阀接头，其侧臂带三通软连接管并与加压输液袋相连，持续滴入生理盐水4ML/MIN以防血栓形成。在DS。

17、A监视下，、选择走形平直的一侧大脑中动脉，将微导管引至MCAM1段中远端后释放出弹簧圈，完全阻断一侧大脑中动脉中远端血流，之后退出支撑导丝。0064栓塞1H后，撤出弹簧圈，再次行超选择造影，证实MCA血流恢复，然后拔出微导管、动脉血管鞘，股动脉区局部压迫20MIN。术中持续监测动物的体温、呼吸及血压状况。0065四模型评价00661脑血管造影0067弹簧圈到位后，分别经4F导管头端位于颈内动脉起始部和微导管头端位于MCAM1段中远端造影，判断MCA血流是否被阻断，并观察MCAM1段中远端及分支的血供情况。阻断1H后，撤出弹簧圈再次行超选择造影，观察MCA血流是否恢复。00682磁共振检查006。

18、9缺血后2H、24H、7D进行头颅DTI、T2FLAIR扫描，观察缺血病灶变化情况。0070扫描时点和扫描序列安排详见表1。0071表1磁共振扫描序列安排007200733神经功能评价0074采用猴局部脑缺血后神经行为评分标准表2，分别在术前、术后第1、2、5、7天对动物进行神经功能评分。该评分标准共分为四个大项目，包括意识状态、运动系统、骨骼肌协调功能和感觉系统，最高评分为100分，评分越高，提示神经功能缺损越严重。评分由2位专业动物管理人员独立完成。0075表2猴局部脑缺血后神经行为打分标准说明书CN101986834A5/7页700760077注总计最高分为100分0078五组织病理学观。

19、察说明书CN101986834A6/7页800791脑组织取材0080将动物麻醉，左心室插管，以PBS和多聚甲醛灌注固定后，开颅取脑放入10甲醛固定液中保存。00812脑组织石蜡切片的制备0082将固定好的标本置于001MPBS的缓冲液中2小时，以置换标本中的固定剂，经梯度酒精脱水，透明，浸蜡，包埋等处理后完成切片。00833HE染色0084光镜下观察HE染色切片常规病理改变梗死周围形态改变，血管段及胶质增生。0085结果0086一、模型建立情况0087一一般资料0088模型组成功完成3只动物MCA缺血再灌注模型，经神经功能评分、脑血管造影和磁共振检查证实造模成功。0089二神经功能评分009。

20、0所有动物术前神经功能评分均为0分，模型建立成功的3只猴术后均出现明显的神经功能缺损表现，包括不同程度的意识障碍，病灶对侧肢体运动强度减弱，不能完成攀爬及取食等动作，对疼痛刺激反应减退或消失，运动不协调等。分别在术后第1、2、5、7天对动物进行神经功能评分。术后各时点动物神经功能评分结果见表3、图1。0091表3动物神经功能评分结果00920093三影像学评估00941DSA结果0095分别于栓塞前、栓塞后和再灌注后行DSA扫描摄片，结果见图200962MRI结果0097模型组造模成功的3只动物MRI结果都显示了与栓塞侧MCA供血区分布一致的缺血损伤病灶，见图3。0098二、脑组织切片HE染色。

21、结果0099假手术组低倍镜下脑组织结构完整，着色均匀，未见神经元的损伤；高倍镜下显示大脑皮层的神经细胞胞核位于中央部，核结构清晰，胞浆清楚可见，染色均匀，胞膜完整，说明书CN101986834A7/7页9间质无水肿图41。0100模型组低倍镜下观察可见坏死性病灶，高倍镜下可见缺血坏死区内神经细胞变性，形态不整，胞核变形，核膜不清，胞浆着色不均匀，尼氏体消失，有大量胶质细胞增生图423。在缺血及周边区可见新生血管，血管壁不完整，其周围组织结构疏松图44。0101实施例2筛选治疗局灶性脑缺血的药物的方法0102A、采用实施例1制备恒河猴局灶性脑缺血模型；0103B、将候选药物一起施用于恒河猴；0104C、观察候选药物抑制恒河猴局灶性脑缺血模型的情况，并进行评分，评价潜在的治疗局灶性脑缺血的药物。0105本发明采用血管内介入弹簧圈栓塞法构建恒河猴局灶性脑缺血模型，有较高的稳定性，较高的安全性，较好的可重复性，是一种可良好模拟临床的简便易行的恒河猴局灶性脑缺血模型。说明书CN101986834A1/4页10图1图21说明书附图CN101986834A2/4页11图22图23说明书附图CN101986834A3/4页12图3图41图42说明书附图CN101986834A4/4页13图43图44说明书附图。