技术领域
本发明涉及人类CTRP4蛋白质的新应用，具体地本发明涉及CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物的应用。
背景技术
本案申请人于2010年7月16日向中国专利局提交了发明名称为“人类CTRP4基因、其编码的蛋白质及它们的应用”的发明专利申请，该申请于2012年2月1日公开，公开号为CN102337268A。该专利申请公开了人类CTRP4基因、其编码的蛋白质及它们的一部分应用。
本案发明人基于此，对CTRP4蛋白质的应用进行进一步研究。尤其深入研究其作为制备治疗炎症性疾病和自身免疫性疾病的药物的应用。
LPS是革兰氏阴性细菌外壁层特有的化学成分，主要有类脂A、核心多糖和O-抗原三部分组成。机体固有免疫系统对LPS的识别具有两套不同的反应体系，细胞膜表面模式识别受体TLR4/MD2复合物可特异性识别被LPS结合蛋白（LPS binding protein，LBP）和CD14转运至细胞膜表面的LPS，并向胞内传递跨膜信号，通过依赖MyD88和非依赖MyD88途径活化下游NFκB、MAPK和JNK等信号通路，产生固有免疫应答；体液固有免疫分支中具有糖识别结构域的可溶性模式识别分子，如补体C1q、collectins（MBL、SP-A、SP-D）、pentraxins(CRP、SAP、PTX3)和ficlins等，也可以有效识别并结合LPS，防止LPS继续扩散诱发LPS毒性并介导LPS的清除。
内毒素休克（endotoxic shock）是由短时间大量LPS诱发严重的内毒素血症所致，给予足量的液体复苏仍无法纠正持续性低血压，并伴有器官低灌流状态和血管微循环障碍（DIC），最终大多死于多器官功能衰竭（multiple organ failure，MOF）。尽管现在的抗生素治疗和生命体征支持疗法都得到长足的发展，但是内毒素血症一旦发展为内毒素性休克，死亡率还是高达20%～80%。大量文献报道，固有免疫应答过强和后继的适应性免疫应答下降分别是内毒素性休克早期和晚期死亡的主要原因。而早期固有免疫应答过程开始于机体模式识别受体与病原体的识别后诱发的级 联炎症反应。
补体成分在固有免疫系统中发挥着举足轻重的作用。现已知有三条不同的补体活化途径：经典活化途径、旁路活化途径和凝集素活化途径，涉及30多种蛋白质分子。C1q是补体经典活化途径中的第一个成员，是由A、B和C三个亚基组成的异源18聚体。每个亚基都是由N-端信号肽、可变区、胶原样结构域（活化补体成分C1r等）和C-端C1Q球状结构域（识别免疫复合体等）组成。研究发现，除了免疫复合物之外，C1Q球状结构域还可以识别许多其他性质的配体，如聚集的IgG、IgM、HIV-1中gp21多肽、β-淀粉样蛋白、细菌细胞壁成分LPS、凋亡细胞和急性时相反应蛋白等。由于C1Q球状结构域的广谱的配体识别域，补体C1q分子表现出广泛而多样化的免疫调节功能，除了结合免疫复合体活化补体经典途径之外，还具有调节凋亡细胞清除诱导免疫耐受、中和病毒、局限并清除细菌、介导吞噬和细胞之间的粘附等 [30-32]。现有研究证实，补体C1q分子可直接与LPS结合，并可在多种细胞中调节LPS诱导的细胞因子分泌。CTRPs超家族成员分子均具有C1Q球状结构域，目前虽没有具体数据证明该家族中C1Q球状结构域与LPS之间的相互作用，但是作为该家族分子的种内同源分子脂联素可通过其C1Q球状结构域与LPS发生明显的相互作用，并可体外抑制LPS诱导的NF-κB活化及细胞因子分泌，另外，CTRP3虽然不能直接和LPS结合，但可能与LPS特异性受体复合物TLR4/MD2发生相互作用，阻断LPS与TLR4/MD2的有效结合，发挥抵抗LPS的生物学活性。
现有技术已经公开的CTRP4是具有两个C1Q球状结构域CTRPs超家族成员，其C1Q球状结构域与补体C1q分子高度同源。因此，为了深入探讨CTRP4在固有免疫系统中的生物学功能，我们将CTRP4与LPS之间的关系作为研究重点，以期发现CTRP4在固有免疫应答中可能发挥的作用。
炎症是机体对损伤因子、因素产生的应激和防御反应。任何对机体有害的因素都可以诱发炎症反应，如生物及理化因素引起的感染，组织与细胞损伤等。炎症反应是把双刃剑，适度的炎症反应对机体清除病原感染，组织修复以及稳态的维持具有积极意义，但是过度的或者持续不可控的慢性炎症反应会对机体造成严重的损害甚至危及生命，例如炎症性肠病和SARS。炎症反应是多细胞和多因子共同参与的反应，其中，吞噬细胞是启动炎症反应的重要细胞。吞噬细胞表面表达多种模式识别受体（甘露糖受体，葡聚糖受体，Toll样受体），能迅速识别入侵的外源性生物及内源性损伤信号，产生和释放大量促炎细胞因子，例如IL-6，TNF-α,IL-1β，IL-8等， 这些炎症性细胞因子发挥多种功能，包括致炎，致热，趋化炎性细胞，激活适应性免疫细胞等作用。单核巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞、T细胞、B细胞，上皮细胞等都参与炎症反应。因此，炎症是多细胞多因素参与的复杂过程，在研究炎症的过程中利用动物模型能够更好的模拟炎症的真实性。
转基因小鼠是指通过实验方法将特定外源基因导入早期胚胎细胞并整合至染色体上,通过生殖细胞传递到子代，从而得到的小鼠。1980年Goden博士在实验室通过把重组基因注射到小鼠的受精卵中，获得了第一只转基因小鼠，这一技术为研究哺乳动物基因在体内的表达调空功能创造了一个非常有力的手段。1982年，Palmiter,R.D等人把金属硫蛋白I的基因和大鼠的生长激素基因融合后，同样应用显微注射的方式注入到小鼠的受精卵原核中，发现21只存活的小鼠中有6只体重大于同窝的小鼠，而这些转基因动物的血清中生长激素和肝脏中的融合基因的表达水平都是升高的，这一研究结果又使转基因技术前进了一步，提供了融合基因的转基因方法，为研究遗传性疾病的治疗提供了良好的开端。1988年之后，这种把外源性基因转入到受精卵并且在机体内成功表达的模型已经达到了空前的规模，应用范围扩展到了各种基因的功能研究，免疫系统，哺乳系统的发育等各个环节。例如，使用肺脏组织特异性的启动子高表达IL-9时,IL-9转基因小鼠出现了自发性肺部炎症反应；应用转基因技术研究人类慢性乙型肝炎已相当普遍。
近些年来，我们国家对于炎症性肠病（IBD=inflammatory bowel disease）的重视程度在上升，而从世界范围来看，我们对于炎症性肠病的认识也因为免疫学的发展和对肠道内菌群研究的深入得到了很大的发展。现在关于炎症性肠病的病因学研究认为，是因为多种因素导致的，包括遗传因素，环境因素，免疫系统的紊乱，还有肠道菌群的问题。
另外，肺炎也是一种危害很大的炎症性疾病，包括细菌性肺炎和病毒感染引起的肺炎或者急性严重肺损伤。因此期待本发明的CTRP4蛋白质能够在肺炎的治疗中发挥有效的作用。
葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性结肠炎模型，是通过在饮用水中加入DSS几天，诱导出以血便，溃疡，炎症细胞浸润，体重减轻，腹泻等为特点的急性结肠炎，这种化学药物是以其对基底隐窝的肠上皮细胞的直接毒害发挥作用的，因此影响了黏膜屏障的完整性。由于其症状、病理变化与人类溃疡性结肠炎的临床症状和病理变化类似，常被用于研究此病的发病机理，并且可以通过连续几个循环摄入DSS 诱导慢性肠炎的发生。另外，与致癌剂偶氮甲烷联用，可以制备慢性炎症到肿瘤的模型，对于临床炎症性肠病相关的结直肠癌的机制研究也是非常重要的工具。
此外，肥胖是21世纪人类面临的最严峻的公共卫生问题之一，随着都市化生活方式普及，肥胖人群日益增多，而我国快速的城镇化建设则会加重这一现状。卫生部调查显示，我国肥胖超重者近3亿，糖耐量受损者约1.5亿，糖尿病患者超过9000万。糖尿病已成为威胁我国人民健康的突出问题，同时对医疗保障体系和社会福利制度提出了严峻挑战。
20世纪90年代初已有人发现一些促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素、干扰素等在多种组织中影响葡萄糖浓度的稳定性。近年来炎症反应在糖尿病发生发展中的作用及与其他糖尿病危险因素关系问题的研究受到越来越广泛关注。2010年以来，Cell、Nature、Science期刊连续发表十余篇专题报道，从遗传因素、环境因素、基因信号转导、机体肠道菌群等多方面阐述了肥胖与糖尿病发生发展机制及调控现状，并提出一系列解决思路。肥胖和糖尿病常常同时存在，肥胖与糖尿病不仅是一个高血糖的疾病，也是一种炎症性疾病，而炎症反应是连接它们之间的纽带。肥胖患者体内存在慢性、低度炎性反应，其脂肪组织中的T细胞和巨噬细胞明显增加，二者通过影响前脂肪细胞和脂肪细胞的功能导致炎性因子的上调。但是这与典型的炎性反应不同，肥胖患者体内虽然有许多炎性介质升高，但没有典型的红、肿、热、痛炎性反应。因此，有学者把这种反应称为“代谢性炎性反应”。促炎因子IL-1、IL-6和TNFα等细胞因子不仅由免疫活性细胞产生，也可由脂肪和肌肉细胞产生。不仅参与机体的炎症反应过程，还是能量代谢平衡的重要调节因子。它们能够阻断体内胰岛素的生物学功能，使胰岛素敏感性下降，导致胰岛素抵抗的发生。人体总IL-6的30％来自脂肪组织，所以肥胖者脂肪组织分泌的IL-6可明显增加。长期过度分泌IL-6可导致胰岛β细胞分泌功能受损及产生胰岛素抵抗。而高血糖又可促进胰岛细胞分泌IL-6，大量的IL-6可促进B淋巴细胞分化，产生过量的IgG，该作用和其他细胞因子产生的细胞毒作用结合，可引起胰岛β细胞凋亡。TNF-α在胰岛素抵抗的病理过程中起了重要的作用，肥胖者脂肪细胞产生的过量的TNF-α抑制肌肉组织胰岛素受体酪氨酸激酶活性，降低胰岛素作用。TNF-α还能降低PPAR mRNA的表达而减少PPAR的产生，PPAR在免疫细胞和血管壁细胞中表达具有抗炎和促凋亡作用；TNF-α又可引起胰岛内巨噬细胞活化释放IL-1、IL-6等，因此，长期高浓度的炎症因子刺激可导致胰岛细胞分泌功能受损及产生胰岛素抵抗。 对炎症因子与肥胖和糖尿病之间关系的研究或许可以提供新的更有效的诊断、预防和治疗手段。
TLR4是一种重要的模式识别受体，在肥胖与高血糖的发生、发展中也起了重要作用。它几乎在所有人体细胞表达，并有实验证实在胰岛β细胞上也存在TLR4的表达，而且TLR4的配体种类多样，可以是细菌胞壁，内毒素，也可以是非细菌的配体，如饱和脂肪酸(棕榈酸)。细菌性炎症免疫应答需要TLR4参与和活化；游离脂肪酸也能够活化TLR4引起炎症免疫反应。营养过剩，肥胖，导致胰岛素抵抗的发生需要TLR4的参与，TLR4激活后，其胞浆区通过募集接头蛋白MyD88引起下游转录因子NFKB，IRF3和MAP激酶的激活。通过MyD88依赖的通路引起的NFKB和MAPKs的激活促炎症因子释放。
CTRP4是C1QTNF相关蛋白质家族成员。C1QTNF（CTRP）家族是一类新发现的主要来自脂肪组织的脂肪细胞因子，以其高度保守的C端补体C1Q球状结构域为特征而命名。发明人初期的体外研究表明CTRP4在肝癌细胞系可以活化NFκB，上调IL-6的表达以及促进STAT3的磷酸化，相关的文章发明人发表在CANCER LETTER上。继续的研究发现，对髓系来源的细胞CTRP4显示了明显的抗炎的作用；而不同的动物模型研究在体内也均显示了抗炎作用。根据已有报道，很多CTRP家族的成员均在脂代谢中发挥了很重要的作用，那么CTRP4在脂代谢中起了什么作用呢？CTRP4会不会通过抑炎而抑制肥胖呢？之前的实验已经证明，CTRP4能够抑制TLR4与LPS的结合，从而可以抑制LPS引起的内毒素性休克。因此，我们的假设是：CTRP4是通过抑制TLR4，抑制STAT3而抑制炎症细胞因子的产生从而抑制肥胖和胰岛素抵抗，进而抑制了高血糖的发生。我们希望通过实验验证我们的假设。阐明CTRP4的作用机制具有重要的理论意义与实用价值，理论上阐明它的作用机制对肥胖与糖尿病的发病机制的研究将是一种重要贡献；应用上，CTRP4是一种分泌蛋白，已经证明其重组蛋白具有生物学活性，因此CTRP4具有潜在的临床应用价值。肥胖与代谢综合征糖尿病不仅是一个高血糖的疾病，也是一种炎症性疾病，肥胖患者体内存在慢性、低度炎性反应。其脂肪组织中的T细胞和巨噬细胞明显增加，二者通过影响前脂肪细胞和脂肪细胞的功能导致炎性反应因子的上调。但是这与典型的炎性反应不同，肥胖患者体内虽然有许多炎性反应介质升高，但没有典型的红、肿、热、痛炎性反应。因此，有学者把这种慢性炎性反应称为“代谢性炎性反应”。IL-1、IL-6及TNFα可能均参与糖尿病发病，长期过度分泌的IL-1及TNFα可导致胰岛B细胞分泌功能受损及产生胰岛素抵抗。
自身免疫病性疾病的病因之一在于机体无法清除自身所产生的凋亡细胞，本发明已经在体内外证明，CTRP4蛋白可以明确促进吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬和清除，因此，CTRP4可以应用于治疗自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮的药物制备。
发明内容
本发明的目的是提供CTRP4蛋白质在作为制备治疗炎症性疾病和自身免疫性疾病的药物中的应用。
为此，本发明提供了一种CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病的药物的应用。其中所述炎症性疾病选自下列的一种或多种：LPS所引起的内毒素性休克；急、慢性结肠炎；肺炎；肥胖和高血糖。
本发明也提供了CTRP4蛋白质在作为制备促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞的药物的应用。
本发明也提供了CTRP4蛋白质作为制备治疗自身免疫性疾病的药物的应用。
本发明也提供了CTRP4蛋白质作为制备治疗系统性红斑狼疮的药物的应用。
本发明的上述应用可以制备有效地治疗炎症性疾病和自身免疫性疾病的药物。
附图说明
图1是CTRP4F1代转基因小鼠66号小鼠的PCR鉴定。
图2是CTRP4F2代CTRP4转基因小鼠65号的鉴定。
图3是F2代纯合子小鼠的鉴定。
图4是Western Blotting检测纯合子小鼠中各个CTRP4的表达。
图5是CTRP4-His融合蛋白与LPS之间的结合作用。
其中1：PBS；2：1%BSA；3：煮沸15分钟的CTRP4(2ug/ml)（目的是为证明CTRP4的作用不是由于残留的LPS所致）；4：VSTM-1-V2-HIS(1.4ug/ml)；5：CTRP4(0.1ug/ml)；6：CTRP4(0.5ug/ml)；7：CTRP4(2ug/ml)；8：LPS(20ug/ml)+CTRP4(2ug/ml)。
图6是THP1细胞中TLR4的mRNA表达。
图7A-D是FITC-LPS与THP1细胞的结合。
其中(A）CTRP4-His融合蛋白与FITC-LPS同时处理THP1细胞，CTRP4-His融合蛋白的高、中、低剂量浓度分别为100ng/ml，1ug/ml，10ug/ml；（B）CTRP4-His融合蛋白与FITC-LPS先37℃孵育30min再加入处理THP1细胞，CTRP4-His融合蛋白的高、中、低剂量浓度分别为100ng/ml，1ug/ml，10ug/ml；（C）多粘菌素B与FITC-LPS同时处理THP1细胞，多粘菌素B的高、中、低剂量浓度分别1ug/ml， 10ug/ml，100ug/ml；（D）未标记的LPS与FITC-LPS同时处理THP1细胞，游离LPS的高、中、低剂量浓度分别1ug/ml，10ug/ml，100ug/ml。灰底峰代表阴性对照，黑线白底代表FITC-LPS组，彩色白底代表实验组。
图8是CTRP4抑制LPS诱导的细胞因子表达。
其中(A)1ug/mlLPS或者1ug/mlLPS与不同浓度CTRP4-His融合蛋白联合处理THP1细胞6小时后，IL-6、TNF-α和IL-10的mRNA水平的变化;(B)1ug/mlLPS或者1ug/mlLPS与不同浓度CTRP4-His融合蛋白联合处理THP1细胞6小时后，IL-6的蛋白水平的变化；(C)1ug/mlLPS或者1ug/mlLPS与不同浓度CTRP4-His融合蛋白联合处理THP1细胞后细胞培养上清中TNF-α含量的时间变化；**代表P＜0.01， ***代表P＜0.001。
图9是野生型小鼠和CTRP4转基因小鼠诱导内毒素休克后的生存曲线。
其中野生型C57BL/6小鼠（n=16）和CTRP4转基因C57BL/6小鼠（n=11）腹腔注射30mg/kg来自菌株E.coli055:B5的LPS诱导内毒素休克后，每2h观察1次。数据来自2次独立实验的联合数据，**代表P＜0.01。
图10表示在急性结肠炎模型中CTRP4转基因小鼠的结肠长度比对照组长。A图为模型构建后牺牲小鼠的结肠长度情况。B图为A图的统计图。P=0.0021
图11表示转基因CTRP4小鼠的腹泻情况减轻。在DSS诱导的急性结肠炎模型中CTRP4转基因小鼠和阴性对照组小鼠腹泻程度的比较，**代表P<0.01。
图12表示转基因CTRP4小鼠的血便情况减轻。在DSS诱导的急性结肠炎模型中CTRP4转基因小鼠和阴性对照组小鼠的血便评分情况。**代表P<0.01。
图13表示转基因CTRP4小鼠的体重变化情况。在DSS诱导的急性结肠炎模型中转基因CTRP4小鼠和阴性对照组小鼠体重的比较。**代表P<0.01.
图14表示转基因CTRP4小鼠在结肠炎模型中结肠病理情况减轻。图为代表性的显微镜图片，放大倍数为200倍。
图15表示通过组织学评分CTRP4转基因小鼠在结肠炎模型中炎症程度减轻。反应肠炎严重程度的组织学评分显示转基因小鼠的评分比阴性对照组低。
图16表示转基因CTRP4小鼠在急性结肠炎模型中的生存率明显提高。在葡聚糖硫酸钠诱导的急性结肠炎模型中转基因CTRP4小鼠和对照组小鼠的生存曲线横坐标为DSS诱导的天数，纵坐标为小鼠的死亡百分比，CTRP4组n=8，WT组n=8.WT小鼠在第7、8、9、10天每天死亡一只小鼠，而CTRP4小鼠在11天未见死亡。
图17表示CTRP4转基因小鼠结肠中细胞因子TNF-α的表达量明显降低。急性结肠炎模型中结肠匀浆上清检测TNF-α的数值，P=0.0026。
图18表示CTRP4转基因小鼠的糖耐量实验。CTRP4转基因鼠糖耐量比野生型鼠有明显差异，转基因鼠的血糖水平较野生鼠明显降低。
图19和图20表示高脂喂养的结果。
图21表示高脂喂养16周后，CTRP4基因鼠体重较野生鼠的体重明显减低，具有统计学意义。
图22表示CTRP4与凋亡细胞的识别。
其中（A）Jurkat细胞凋亡状态。Jurkat细胞UV照射1.2min（早期凋亡）和5min（晚期凋亡），用AV-PI双染方法流式细胞术分析凋亡状态；（B）、（C）活细胞、早期凋亡和晚期凋亡Jurkat细胞与FITC-BSA、FITC-CTRP4室温孵育30min后流式细胞术分析FITC荧光强度。
图23A-B表示CTRP4可以与小鼠腹腔巨噬细胞结合。
图24A-B表示THP1细胞用PMA(10ng/ml)处理2天使其分化成巨噬细胞，用(5ug/ml)FITC-CTRP4孵育60分钟进行检测。
图25A-D表示CTRP4促进体内凋亡细胞的清除。
具体实施方式
实施例1：制备:CTRP4转基因小鼠
真核细胞表达质粒pcDNA3.1-Myc/HisB(-)（本论文中简称PCDB）购自Invitrogen公司，制备pCAGGS-CTRP4转基因质粒。具体过程如下：真核细胞表达质粒pcDNA3.1-Myc/HisB(-)（本论文中简称PCDB）购自Invitrogen公司，pCAGGS-CTRP4质粒的构建方案如图所示。其基本过程如下：设计包含Xho1酶切序列的CTRP4基因特异性引物，以pcDNA3.1-Myc/HisB(-)质粒为模板，克隆方案中，上下游引物具体序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2：
PCR扩增得到的片段连同真核表达载体pcDNA3.1-myc/his(-)B采用同样的限制性内切酶进行酶切。酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，切胶回收目的条带。回收的载体和PCR片段用T4DNA连接酶进行连接，16℃，12小时。将连接产物进行转化。
以下为转化过程：缓慢抽吸50μl感受态大肠杆菌XL1-BLUE到连接产物中， 在冰上放置30分钟，在42℃水浴中热激90秒钟，迅速放到冰上，经过5分钟的恢复后，加入LB的培养基400μl，后37℃培养45分钟让细菌恢复状态并表达抗性，离心8000rpm，2分钟，弃上清，留400μl重悬，涂布于LA平皿上，30℃倒置培养过夜。挑取克隆扩增培养，提取质粒进行鉴定。鉴定是否有插入片段、插入片段的大小、片段插入的方向。对符合目的要求的阳性克隆进行质粒测序，测序结果与NCBI标准数据库中的CTRP4ORF序列进行比对，准确无误后进行质粒大量提取，质粒线性化，定量除菌后通过商业付费委托给中国医学科学院医学实验动物研究所（地址：北京市朝阳区潘家园南里5号院，邮编：100021）制作转基因小鼠。由其提供合格的CTRP4转基因小鼠。
1.提取鼠尾基因组DNA
1)在剪取鼠尾的前一天配制鼠尾裂解液（商购）；
2)编号并剪去小鼠的尾巴0.5cm左右，放入EP管中；
3)在每个EP管中加入上述的裂解液500ul并加入0.1mg/ml的蛋白酶K(Proteinase K)放入55℃水浴锅里过夜；
4)第二天，加入300μl饱和的NaCl(35.2g NaCl定容至100ml)，颠倒混匀6-8次，冰浴15分钟；
5)12000rpm，，室温离心15分钟；
6)转移400μl上清液至另一新的离心管，加入700μl的异丙醇，颠倒直至形成絮状沉淀；
7)12000rpm室温离心15分钟；
8)弃掉上清，加入1ml70%乙醇洗涤沉淀，弃掉乙醇并晾干；
9)根据得到的沉淀（即DNA)的量加入50ul，65℃的双蒸水溶解。
2.PCR鉴定CTRP4转基因小鼠
（1）引物：根据pCAGGS载体的启动子序列小鸡β-肌动蛋白，使用中国医学科学院医学实验动物研究所设计的引物序列和扩增条件如下：
PCR反应体系：5μl2*TAQ-Mix，4μl H2O，0.2μl前向引物，0.2μl反向引物，0.6ul模板，反应结束后取5μl进行1%琼脂糖电泳。
3.转基因小鼠各个组织蛋白的提取
1）分离小鼠各器官，称重，每100mg组织中加入500μl的RIPA裂解液(商购)（其中加入1mM的PMSF（苯甲基磺酰氟））至匀浆管中，匀浆20S后，将匀浆管从匀浆机上取回迅速插入冰上30s以防止蛋白降解，然后再匀浆20s。
2）把组织匀浆液放入离心机12000rpm，4℃，20分钟，小心吸取上清液至另一离心管中。
3）蛋白定量：按BCA定量试剂盒说明书提供的方法进行蛋白定量。
4.检测CTRP4转基因小鼠各个组织的蛋白水平的表达（Western Blotting）
收集上一步的组织匀浆液上清，加入SDS加样缓冲液（β巯基乙醇，甘油，20％SDS，0.1溴酚蓝），99℃保温10分钟，离心后取上清，12.5％的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳分离蛋白样品后，用100v，1.5小时，湿法电转印至硝酸纤维素膜上，以TBST（Tris-HCl,NaCl，0.1%Tween-20）配制5％脱脂牛奶，4℃封闭2小时后，与一抗结合4℃过夜，之后用TBST震荡洗膜三次，每次10分钟，再加入相应的IRDyeTM800/700conjugated二抗避光反应一小时，TBST重复洗膜三次，然后用Odyssey Imaging System仪器扫描成像分析。
5.CTRP4转基因动物繁殖及纯合子筛选
5.1转基因小鼠F1代的繁殖
我们将CTRP4转基因鼠首建鼠（founder）（CTRP4♂1、7、17、23、66，♀5、14、22、3、65、29、54、18）分别与育龄期的野生型C57BL/6J小鼠交配，小鼠一般在受精后19-21天分娩，据此，我们在大约两周之后观测小鼠腹部并用指揉法判断小鼠的胚胎情况，如果证实确已受孕，即把雌鼠分笼。小鼠一代生育的子鼠在6-12只左右，在F1代小鼠出生12天左右对小鼠编号并鉴定小鼠的基因型，得到CTRP4杂合子转基因小鼠，在4周时将新生小鼠离乳。
5.2F2代转基因小鼠的繁育
用F1代鉴定阳性的CTRP4杂合子小鼠进行近亲交配，即同窝阳性小鼠的雌雄交 配，根据最适的雌雄比例（雄:雌=1:2）进行，编号及鉴定方法同F1代。
5.3F2转基因纯合子小鼠的筛选
根据孟德尔遗传定律，F2代小鼠中有一定概率纯合子小鼠出现（约1/4）。因此，通过测交的方法来筛选F2代中的纯合子小鼠，即把得到的每一只CTRP4阳性F2代小鼠与野生型的C57BL/6J小鼠进行交配，通过子代小鼠判断F2代小鼠中的纯合子鼠，如果子代小鼠经过PCR鉴定100%为CTRP4阳性，则表明亲代小鼠为纯合子小鼠，否则为杂合子小鼠。PCR鉴定方法同上。
阴性鼠的来源：我们把F1代小鼠中的阴性小鼠进行交配，并大量繁殖，进而得到用于实验对照的阴性小鼠。
6.F1代小鼠的繁殖和基因型鉴定
通过F0代转基因小鼠和野生型C57BL/6J小鼠交配，得到F1代小鼠。最终鉴定CTRP4有30只阳性小鼠，参见图1，为代表性的图片。1-6号和7-12号小鼠分别是66号小鼠生产的两窝小鼠，共12只，只有2只阳性，分别为11、12号，两只都为雌性。
7.F2代小鼠的繁殖和鉴定
我们选择F1代小鼠同窝并且至少有1只雄性，1只雌性的小鼠进行同窝交配，最终我们筛选出CTRP45号1♂2♀，7号和65号分别1♂1♀，即CTRP4一共有4窝进行繁殖。结果见图2，CTRP4小鼠65号生产的7只小鼠中第1只和第6只为阳性，其中1号为雌性，6号为雄性。
8.F2代纯合子小鼠的筛选
最终经过PCR的鉴定，发现了CTRP4共8只纯合子，分别为CTRP4：5-4-1；5-4-2；7-4-1；7-4-2；7-4-4；65-1-1；65-1-9；65-1-11。见图3，通过CTRP4F2代小鼠与野生型小鼠交配生成的F3代小鼠的鼠尾DNA经过PCR鉴定的结果，1-7号分别为F3代小鼠中的同窝小鼠。
9.CTRP4转基因小鼠体内表达的鉴定
我们取小鼠的各个器官进行匀浆处理得到的器官进行Western Blotting，结果发现纯合子转基因小鼠蛋白表达水平要比野生型小鼠明显升高，证明纯合子小鼠确实高表达人类CTRP4基因，结果见图4，通过Western检测了对照组小鼠和野生型小鼠心肝脑肾的CTRP4表达情况。WT代表对照组小鼠，C4代表CTRP4转基因小鼠。 阴性鼠为通过上述F1阴性小鼠经过交配后大量繁殖的小鼠。
实施例2：CTRP4体外和体内抑制LPS所引起的内毒素性休克
1.ELISA检测CTRP4与LPS之间的直接相互作用
检测方法具体步骤如下：
包被：购自Sigma公司的E.coli055:B5LPS以10ug/ml的终浓度溶解于蒸馏水，超声3次，每次15s。然后用50ul/孔（500ng）LPS水溶液包被96孔ELISA板室温过夜，让孔中蒸馏水蒸发完全；
封闭：包被好的ELISA板60℃热激活30min，200ul/孔的Tris缓冲液37℃封闭2h，Tris缓冲液的配方是50mmol/L Tris-HCI，50mmol/L NaCI，1mg/ml BSA，PH8.0；
洗涤：0.05%的PBST洗涤5遍；
结合反应：50ul/孔含有5mmol/L CaCI2和0.1mg/ml BSA的不同浓度的CTRP4-His融合蛋白溶液室温反应3h，50ul/孔PBS缓冲液和1%BSA作为阴性对照，50ul/孔VSTM1-V2-His融合蛋白作为无关对照；
洗涤：0.05%的PBST洗涤5遍；
一抗反应：50ul/孔的小鼠来源的抗His-标签抗体37℃反应1.5h；
洗涤：0.05%的PBST洗涤5遍；
二抗反应：50ul/孔HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，室温反应1h；
洗涤：0.05%的PBST洗涤5遍；
显色：50ul/孔TMB工作液室温反应20min；
终止反应：50ul/孔2M硫酸终止反应；
读数：ELISA读板机测定OD450。
CTRP4-His融合蛋白的制备方法如下：采用PCR技术从pcDB-hCTRP4重组载体中，扩增或人工合成CTRP4基因ORF中不含信号肽的目的基因片段，在上下游引物的5’端分别插入Nde I和Xho I限制性内切酶位点。PCR产物长度964bp，回收产物经Nde I和Xho I双酶切，同时也双酶切pET-32a质粒，将hCTRP4片段和pET-32a载体片段连接构建质粒pET-32a-hCTRP4经PCR和测序鉴定pET-32a-hCTRP4质粒。缓慢抽吸50μl感受态大肠杆菌XL1-BLUE到连接产物中， 在冰上放置30分钟，在42℃水浴中热激90秒钟，迅速放到冰上，经过5分钟的恢复后，加入LB的培养基400μl，后37℃培养45分钟让细菌恢复状态并表达抗性，离心8000rpm，2分钟，弃上清，留400μl重悬，涂布于LA平皿上，30℃倒置培养过夜。挑取克隆扩增培养，提取质粒进行鉴定。根据不同条件的小量诱导表达，最后确定采用24℃、10h、IPTG终浓度为0.4mmol/L的条件进行CTRP4-his重组融合蛋白的诱导表达。用镍柱进行亲和层析纯化，在pH8.0、咪唑浓度为500mmol/L的洗脱液洗脱得到目的蛋白。超滤去除咪唑，最后通过DEAE阴离子交换柱去除内毒素，200mL菌液最后能得到大约500μg纯度为95%以上的融合蛋白。上述CTRP4-His融合蛋白也可以通过商业付费委托制备而获得。
2．FITC标记CTRP4-His融合蛋白和LPS
CTRP4-His融合蛋白FITC标记：称FITC粉末5mg溶于100ulDMSO中，与浓度为1mg/ml的CTRP4-His融合蛋白混合与pH为9.5的0.5mol/L的碳酸盐缓冲液中。4度混匀过夜。混合液穿过过PD-10柱，收集最先穿过柱子的FITC-CTRP4-His，PBS缓冲液洗脱没结合的FITC。在标记好的融合蛋白中加1%BSA，0.1%NaN3除菌过滤，4度保存。加50%甘油-30度保存。
LPS的FITC标记：具体操作如下：
称4mg LPS溶解于2ml的0.5%三乙胺水溶液，冰上超声3x15s使LPS变为单体，称5mg FITC溶解于1ml的PH为9.5的0.5mol/L碳酸盐中，将二者混合后加入1.6%的脱氧胆酸钠1ml，37℃旋转过夜。混合液穿过过PD-10柱，收集最先穿过柱子的FITC-LPS，PBS缓冲液洗脱没结合的FITC。
3.流式细胞术分析
采用流式细胞术的方法检测CTRP4-His融合蛋白对凋亡细胞的识别：收集未处理或者UV照射诱导凋亡的Jurkat细胞于流式管中，冰PBS清洗2遍，200ul/管PBS（含0.2%的NaN3）重悬Jurkat细胞。加入不同浓度的FITC-CTRP4-His融合蛋白或者FITC-BSA室温孵育30min，冰PBS清洗2遍，500ul/管PBS（含0.2%的NaN3）重悬Jurkat细胞，上机检测。
采用流式细胞术的方法检测CTRP4-His融合蛋白对LPS与THP1细胞表面受体的抑制作用：800转/min离心3min收集THP1细胞于流式管，冰PBS清洗2遍，重悬于 200ul/管的SEBDAF缓冲液[43]（20mM HEPES PH7.4，150mM NaCI，1mM EDTA，300ug/ml BSA，10mM NaN3，2Mm NaF,5mM脱氧葡萄糖），再37℃孵育30min以防止受体内化，然后加入FITC-LPS或者同时加入CTRP4-His融合蛋白、多粘菌素B和游离LPS等37℃反应30min，抑或加入事先37℃孵育过30min的FITC-LPS和CTRP4-His融合蛋白混合溶液，最后冰PBS缓冲液清洗1遍，上机检测。
4.ELISA检测细胞因子含量
THP1细胞培养上清中的细胞因子检测：操作流程严格遵照厂家说明书，具体流程如下：收集目的时间点的THP1细胞3000转/min4℃离心20min，转移培养上清于EP管中，加入等体积的样品稀释液将上清稀释1倍。将按说明稀释好的标准品和待测上清样品加入ELISA孔板中，100μl/孔，每个样品2个复孔，室温孵育2-3小时。洗涤5次，加入检测抗体，100μl/孔，室温孵育1小时后，洗涤5次，加入生物素标记的HRP，30分钟后洗涤5次。最后加入TMB，100μl/孔，避光孵育20分钟后加入反应终止液。用酶标仪在450nm读取数值。
5.LPS诱导内毒素性休克动物模型建立
腹腔给予野生型C57BL/6小鼠和CTRP4转基因C57BL/6小鼠来自菌株E.coli055:B5的LPS30mg/kg，建立高剂量LPS诱导的内毒素休克小鼠模型。LPS最终剂量由已有文献推荐和我们自己试验摸索确定。给药后每2h观察1次，记录休克症状和死亡时间并绘制生存曲线。
实验结果：
1.CTRP4与LPS
首先，我们采用ELISA结合试验检测了CTRP4与LPS之间的识别，该实验重复3次。实验结果表明，CTRP4与LPS之间确实存在较强的直接结合（图5）。在10ug/ml LPS包被ELISA板孔的条件下，0.1ug/ml CTRP4-His融合蛋白就显示出明显的结合，随着CTRP4的浓度增加，结合作用相应增强。为了排除非特异性吸附的干扰，我们用1%BSA和VSTM-1-V1-His融合蛋白（纯化条件与CTRP4-His一致）作为无关蛋白对照，结果显示，LPS与二者并无明显的结合。另外，为了进一步证明CTRP4与LPS之间结合的特异性，我们使用游离的LPS去竞争性抑制CTRP4-His融合蛋白与固化的LPS之间的特异性结合，在游离的LPS浓度为20ug/ml时，能显著抑制浓度为2ug/ml的CTRP4-His融合蛋白与固化的LPS之间的结合， 抑制效率高达50%。现有科学研究证实，C1Q球状结构域主要是通过电荷相互作用识别配体。为了验证CTRP4-His融合蛋白与LPS之间的结合是否也受到电荷作用的影响，我们通过调节PH值以改变电荷的作用。实验结果显示，在PH值降低至6.2时，CTRP4-His融合蛋白与LPS之间的结合作用发生明显的升高。
2.CTRP4抑制FITC-LPS与THP1细胞表面受体结合
前面实验已经证实CTRP4-His融合蛋白可特异性结合LPS，那么，在与LPS结合之后对其诱发的生物学反应会有什么影响？为了回答这一科学问题，我们首先利用THP1细胞模型观察了CTRP4对LPS与其细胞表面受体相结合的调节作用该实验重复3次以上。我们知道，广泛表达于免疫细胞膜表面的TLR4/MD2受体复合物是LPS的特异性受体。因此，我们首先采用RT-PCR的方法检测了THP1细胞TLR4受体的表达情况。结果表明，TLR4在THP1细胞有较高的表达丰度（图6）。接着，我们采用流式细胞术分析FITC-LPS与THP1细胞表面受体的相互作用，结果显示，FITC-LPS可明显地结合在THP1细胞膜表面。当我们在FITC-LPS与THP1细胞共孵育的同时加入CTRP4-His融合蛋白、多粘菌素B（LPS特异性抑制剂）和未标记的LPS时，CTRP4-His融合蛋白和多粘菌素B可显著抑制FITC-LPS与THP1细胞的结合，并且具有剂量依赖作用，最高剂量抑制率分别可达到16%和60%（图7A、7C）。另外，将CTRP4-His融合蛋白和FITC-LPS先在37℃孵育30min再加入THP1细胞中时，这种抑制效果更加明显，最高剂量抑制率为34%（图7B）。
3.CTRP4抑制LPS诱导的细胞因子的表达
为了进一步明确CTRP4对LPS生物学反应的影响，我们分别以IL-6和TNF-α作为检测指标，在THP1细胞模型中检测了CTRP4-His融合蛋白对LPS诱导细胞因子分泌的调节作用。以1ug/ml LPS处理THP1细胞作为对照组，LPS处理THP1细胞的同时加入不同浓度的CTRP4-His融合蛋白作为实验组，处理6h后，RT-PCR检测THP1细胞中IL-6、TNF-α和IL-10的mRNA水平的变化，ELISA检测培养上清中IL-6的蛋白水平变化，并分别以未处理组和多粘菌素B作为阴、阳性对照组。实验结果显示，CTRP4-His融合蛋白能显著抑制LPS诱导的TNF-α和IL-6mRNA和蛋白水平，并且具有剂量依赖作用，随着CTRP4-His融合蛋白浓度增加，抑制效应也明显增强（图8A、8B）。接着，我们又检测了CTRP4-His融合蛋白抑制LPS诱导TNF-α分泌的时间变化，在1ug/ml LPS刺激THP1细胞2h后，细胞培养上清中的TNF-α就出现较明显的增加，并于6h达到高峰，而CTRP4-His融合蛋白在2h 表现出较强的抑制作用，之后逐渐降低（图8C）。
4.CTRP4转基因鼠抵抗LPS诱导的内毒素性休克
基于上文的实验结果，为了探讨CTRP4在体内对LPS的抑制作用，我们利用野生型C57BL/6小鼠作为对照组，CTRP4转基因C57BL/6小鼠作为实验组建立由浓度为30mg/kg的高剂量LPS诱导的内毒素休克动物模型，观察CTRP4转基因C57BL/6小鼠的反应性。实验结果显示，在腹腔给予高剂量的LPS之后，两组小鼠均出现明显的休克症状，体温下降、四肢震颤、活动缓慢都蜷缩于鼠笼的一角，没有明显的差异。但野生型小鼠在14h开始死亡，而转基因小鼠在27h才开始死亡，死亡时间显著延迟。在继续观察至96h以后，野生型小鼠死亡14只，2只存活，死亡率为87.5%，而转基因鼠8只死亡，3只存活，死亡率72.7%，两组之间具有明显的统计学差异，P＜0.01（图9）。
实施例2的结果证明了CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病“LPS所引起的内毒素性休克”的药物的应用。
实施例3：CTRP4抑制急、慢性结肠炎
为了研究CTRP4在体内炎症中的作用和机制，我们制备了在饮水中加入葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠急性结肠炎的模型。通过模型观察到CTRP4转基因鼠与野生型小鼠相比，生存率有明显的提高，从体重，结肠缩短，血便，腹泻等大体评分标准都证明在此模型中CTRP4对急性结肠炎的病情具有明显的保护作用，组织学评分也显示CTRP4转基因鼠的肠道病变部位炎症细胞浸润减少，肠上皮破坏减轻。
我们还检测了病变结肠组织培养上清中细胞因子的变化，发现在炎症性肠病中最重要的细胞因子TNF-alpha的表达明显降低降低，但是IL-6变化不明显。
以上结果表明，CTRP4转基因转基因鼠在急性肠炎模型的发病中具有明显的保护作用，具体的作用机制还需要进一步研究。
实施例3中所用到的实验方法
1.全结肠培养
在超净台外把小鼠处死后，将小鼠泡在75%的酒精中，在超净台进行小鼠全结肠的操作。在PBS中加入2%的双抗（链霉素和青霉素）用于清洗取出的结肠，在PBS中清洗两次致肉眼不可见明显污物后，把结肠放入12孔板。在12孔板中加入 1ml无血清的培养基（含2%的PS）,然后用无菌器械把结肠剪成小块状大约1mm3，放入37℃，5%CO2的孵箱中，培养24小时后，吸取上清放入EP管中，12000rpm，15分钟离心，吸出上清转入新的EP管中，存-80℃的冰箱中，为后续Elisa实验用。
2.酶联免疫吸附反应（ELISA）
严格按照eBioscience公司的说明书操作进行：
在实验的前一天把捕获抗体包被到Elisa板子上，4℃过夜；用PBST洗板5次。加入封闭液室温封闭1小时；用PBST洗板5次,加入检测样品，室温孵育2小时；用PBST洗板5次；加入检测抗体室温孵育1小时；用PBST洗板5次；加入代HRP标记的亲和素，室温孵育30分钟；用PBST洗板7次；加入底物室温孵育15分钟，加入终止液；各样品反应孔的显色强度通过ELISA读数器在570nm和450nm处获取其光密度值，通过事先绘制好的标准曲线查询出各样品组相对应的实际浓度。
3.组织RNA的提取
把取出的结肠组织立即转移到匀浆机特制的匀浆管中，连续3次匀浆，之后12000rpm离心，4℃，15分钟，吸出上清转至另一无RNA酶的洁净管中。加入200μl氯仿，振荡混匀15秒，室温静置3分钟，12000rpm离心，4℃，15分钟收集上层水相，加入500μl异丙醇沉淀RNA，室温静置10分钟，12000rpm离心，4℃，15分钟，弃尽上清，加入1ml75％乙醇（DEPC水配置）7500rpm离心5分钟，弃尽上清，室温干燥至RNA片半透明，溶于DEPC处理的H2O中，58-60℃温育10分钟，混匀后取小样，分光光度计定量后用于逆转录。
4.RT-PCR
1)逆转录反应合成cDNA第一链。
2)取提纯总RNA1-5ug，加入Oligo(dT)引物1μl，DEPC处理的水补至总体积12μl进行逆转录。
3)合成的cDNA文库短期冻存于-20℃，长期保存于-70℃。
4)聚合酶链式反应：取制备好的cDNA文库，进行PCR反应，1%琼脂糖凝胶电泳。
5.结肠组织蛋白的提取
取前述处理的结肠组织0.1g溶于500μl加入磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液中，用提取蛋白专用的匀浆管进行匀浆2次，匀浆后离心12000rpm，15分钟，吸取上清进行后续实验。
6.Western Blotting检测结肠炎模型小鼠结肠组织中相关蛋白的表达
将提取的结肠组织蛋白进行BCA定量，并加入5*上样缓冲液之后用于Western blotting.。实验步骤同实施例1。
7.组织固定及石蜡切片
1)固定
结肠标本放入10%中性福尔马林缓冲液中，室温固定12-24h。注意将烧杯口用保鲜膜封严，避免福尔马林挥发。
2）取材
①根据需要确定取材部位、块数。同时在包埋盒上标明组织、组别、日期及相关实验信息（用铅笔标注）。
②包埋盒中的组织块不宜超过四块。
③标本大小：1.5X1.5X0.2～0.3cm。
④防止人为因素的影响切取时用锋利的刀、剪，刀刃要薄，长。避免前后拉动或用力挤压组织，用无齿镊轻轻挟组织，避免用有齿镊。
⑤尽量去除坏死组织、血凝块、污物。
⑥取材完毕后，如组织有剩余，可将剩余组织用福尔马林固定，在指定的位置有序存放，以备补材。
3）脱水、透明、浸蜡
脱水前用自来水冲洗组织块，然后用配液水冲洗（均不需长时间冲洗）。将组织块上残余的水尽量甩尽，梯度酒精脱水，二甲苯透明后，侵入石蜡。
4）包埋
①提前30min-1h打开包埋机开关及手动加热开关，确定包埋机内有足够的石蜡。
②包埋前10-20min打开冷冻台开关。
③将脱水篮内的包埋盒倒入包埋机两侧的盒内。
④先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲镊子轻轻夹取已经经
⑤将包埋盒平整的放在模具顶部，置于冷冻台上。
⑥待石蜡完全凝固后，从包埋模具中取出蜡块。不能将蜡块从模具中强行扣出，如不易分离，可在桌面上将蜡块轻轻磕出，或者延长冷冻时间。
⑦如石蜡与包埋盒分离，可将组织及包埋盒放入包埋机一侧的石蜡内熔化，重复包埋步骤。
5）切片
风干后商业付费委托北京大学第三医院病理科进行切片并且HE染色。
8.免疫组织化学
脱蜡：把切片在70℃的烤箱中2小时，石蜡切片置于二甲苯中浸泡30分钟，换新鲜二甲苯重复一次；
再水化：将脱腊后的组织切片于100％乙醇中浸泡5分钟×2次，95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、蒸馏水各浸泡5分钟×1次；
去除内源性过氧化物酶：新鲜配置3%H2O2，滴片覆盖，室温避光孵育10分钟；
抗原修复：抗原修复液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，将抗原修复液微波高火加热至沸腾，将切片放入，再用微波高火加热5分钟，补加蒸馏水恢复体积后再用微波高火加热5分钟，自然冷却至室温。
封闭：用10%正常山羊血清，室温封闭30分钟；
一抗反应：滴片，分别加一抗抗体、用等量兔IgG作为实验同型对照(以PBS稀释)，4℃过夜反应(12-16h)；
PBS洗5分钟，共3次，不时晃动；
二抗反应和显色：按照cytomation EnvisionTM System HRP试剂盒的说明书进行；
最后苏木紫复染细胞核，中性树胶封片后，光学显微镜下观察并记录结果。
9.葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎模型
在雌性纯合子小鼠和雌性对照小鼠的正常饮用水中加入3%的DSS，加入饮 用水的时间记为第0天，给小鼠编号后，分别记录每一只小鼠的体重，保证各组小鼠体重的均一性和小鼠精神状况的一致，剔除体重和状态有明显差异的小鼠。在此后每天观测小鼠的体重、腹泻和血便情况，血便和腹泻的判断根据下表量化。
表1葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎模型血便和腹泻评分标准
0分 2分 4分 血便 无隐血 有隐血 有肉眼血便 腹泻 成形便 不成形便 不成形便，且粘肛门
通过摘眼球取血的方式处死，血液在室温静置两小时，2000rpm离心15分钟，取上清，再13000rpm离心15分钟，取上清，用于细胞因子的检测。将小鼠开腹，取出结肠，测量小鼠结肠的长度；然后结肠放入Ringer氏液（其中加入PMSF）中进行洗涤，以避免肠道中细菌产生的酶类对常组织中蛋白的影响。在洗涤过程中，沿纵轴把肠道剪开，除尽肠道中的粪便，取离肛门同样距离的一段结肠用于RT-PCR。取同样长度、同样部位的结肠用于Western Blotting，同样部位的一段结肠甲醛固定，用于组织病理学检测与评分。
在不同批次的实验中还利用了小鼠的全结肠培养，用于检测培养上清中的细胞因子。
10.实验结果
10.1CTRP4可以保护DSS诱导的肠炎
DSS诱导急性结肠炎的模型共进行了5次，得到的结果是完全一致的，具体每次试验用小鼠只数和实验见表2。
表2DSS肠炎模型中实验次数和实验结果。
在时间上，除一次为了观察转基因鼠和对照鼠死亡率的差异，时间持续到11天，其余4次实验都是在第7天把小鼠牺牲掉。阴性对照鼠在饮用了3%DSS水几天后，出现了典型的急性结肠炎症状，由于DSS引起肠粘膜通透性的改变和肠粘膜的破坏，发生一系列病理变化，如大量炎症细胞的浸润，结肠的溃疡糜烂，以及可以肉眼观察到的血样便，CTRP4转基因鼠在DSS诱导的急性结肠炎模型中肠粘膜的损伤明显减轻，实验结果表明CTRP4转基因鼠对DSS诱导的急性结肠损伤具有明显的保护作用。
10.2CTRP4转基因小鼠的结肠水肿程度轻
DSS诱导的急性结肠炎模型中一个非常重要的指标是结肠长短的变化，这个参数反应的是由于DSS导致结肠粘膜渗透压的改变，从而导致水肿的发生，进而引起结肠的缩短，长度越短，说明炎症越严重。图10展示的是转基因小鼠和对照小鼠的结肠长短的对比，可以看出转基因小鼠的结肠要比阴性对照组小鼠长，说明其损伤较轻，统计学分析两组小鼠的结肠长度有统计学意义，P=0.0021。见图10。
10.3CTRP4转基因小鼠腹泻症状减轻
DSS药物的作用是利用其毒性作用造成结肠损伤及通透性改变，从而导致小鼠肠道的吸收功能紊乱，在饮用DSS3天便出现腹泻的状况，可以根据大便的性状反应腹泻的严重程度，（具体请参照表1），进而反应急性结肠炎的轻重。经过每天的观察，发现CTRP4转基因小鼠的腹泻症状明显比阴性对照组小鼠轻，如图11所示，并且大约是在第五天的时候出现巨大的变化。
10.4CTRP4转基因小鼠结肠出血情况减轻
DSS模型的另一个重要指标是便血情况，出血量的多少反应结肠溃疡破坏的程度，表明结肠炎的轻重，从图12我们可以看出，CTRP4转基因小鼠比阴性对照组小鼠的便血出现的晚，在第四天的时候开始出现差异，到第六天差异逐渐不明显。
10.5CTRP4转基因小鼠的体重变化
小鼠体重的减轻反应的是急性结肠炎的一个综合情况。由于肠道的急性炎症使肠道吸收功能的降低，腺体分泌增加导致腹泻，而严重的腹泻造成脱水使体重急剧减轻，由于血便引起的出血，进而导致营养不良也更加剧了体重的减轻。阴性对照组小鼠的体重从第五天有一个急剧的下降，而CTRP4转基因小鼠的体重变化不大，体重一直比较平稳。见图13。
10.5急性结膜炎模型中结肠组织的病理学评分
取牺牲的小鼠结肠做了石蜡包埋，委托北医三院病理科进行切片和HE染色。从图14我们可以看出转基因CTRP4小鼠炎症细胞浸润比野生型小鼠少，上皮细胞的完整性和水肿程度都有明显减轻，也反应了DSS诱导的急性结肠炎的减轻。按照严格的病理学评分标准进行评分，标准见表3和图15。
表3急性结肠炎模型组织学评分。
10.6不同小鼠DSS诱导的急性结肠炎模型中的生存率
我们对由DSS诱导的急性结肠炎模型CTRP4转基因小鼠和对照组小鼠进行了生存率的实验，结果如下。我们发现第七天野生型小鼠开始有1只死亡，并以每天1只 的死亡速度死亡，在我们观察的11天中，对照组小鼠死亡了4只，占整个实验小数数量的50%，而CTRP4转基因小鼠在我们的观察期内（11天）没有死亡。结果表明CTRP4转基因鼠对DSS诱导的急性结肠炎模型具有很好地保护作用。见图16。
10.7CTRP4转基因小鼠结肠中细胞因子TNF-alpha的表达量明显降低
为了检测细胞因子在DSS诱导的急性结肠炎组织中的表达丰度，我们利用ELISA方法对小鼠炎症结肠组织的匀浆上清中细胞因子进行了检测，结果发现在CTRP4转基因小鼠TNF-alpha的表达明显降低，IL-6的变化不明显。见图17。
实施例3的结果证明了CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病“急性肠炎和慢性肠炎”的药物的应用。
实施例4：CTRP4转基因鼠可以明显抑制细菌诱导的小鼠肺炎
我们使用LPS和克雷伯杆菌通过气管切开术注入LPS或者克雷伯杆菌诱导小鼠肺炎，发现CTRP41转基因鼠的肺部炎症明显减轻。结果表明CTRP4可以治疗细菌性肺炎或者病毒性肺炎。
统计了小鼠的死亡率，证明CTRP4转基因鼠具有明显的保护作用。
实施例4的结果证明了CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病“肺炎”的药物的应用。
实施例5：CTRP4转基因鼠可以明显抑制高脂喂养小鼠的肥胖和糖耐量变化
利用转基因鼠建立高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型，然后进行系统的检测。在高脂喂养期间每周称取体重，每周计算进食量和引水量，结束时各组小鼠留取血清，称取附睾脂肪重量和肝脏重量，计算内脏脂肪含量(附睾脂肪/体重)、肝脏含量(肝脏/体重)。血糖仪测定血糖，生化方法测定血糖、血脂，酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清胰岛素。通过糖耐量试验、胰岛素释放试验、胰岛素耐量试验判断胰岛素敏感性以及β细胞功能。分别取高脂喂养组和对照组小鼠肝脏病理HE染色，光镜下观察脂肪变性，并用TUNEL法检测肝脏凋亡变化。结果见图18至图21。
实施例5的结果证明了CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病“肥胖和高血糖”的药物的应用。
实施例6：
我们利用流式细胞术的方法检测了CTRP4与凋亡细胞之间的识别。现有研究证实，C1Q球状结构域与凋亡细胞的识别位点可能是磷脂酰丝氨酸（PS）、钙网织蛋白（CRT）和DNA，结合能力与凋亡细胞的凋亡状态相关。因此，我们首先通过预实验摸索出UV照射仪处理Jurkat细胞以诱导细胞发生早、晚期凋亡状态的最佳条件。Jurkat细胞在经过照射30s或者10min后，再继续培养6h，都可发生明显的凋亡。经过筛选，我们选定UV照射1.2min和5min作为后续试验诱导Jurkat细胞发生早、晚期凋亡的实验条件，凋亡率分别为73.48%和54.2%（AV单阳性细胞代表早期凋亡细胞，AV、PI双阳性细胞代表晚期凋亡细胞，图22）。流式细胞术分析结果表明，CTRP4-His融合蛋白与未处理的正常Jurkat细胞无明显的结合，但是与发生凋亡的Jurkat细胞有显著的结合。该实验重复了3次。具体结果参见图23至25，其中图23至25描述如下：
参考图23A，表示CTRP4可识别凋亡细胞：
1.Jurkat细胞加入Etoposide10μg/ml12h，诱导凋亡。
2.将诱导凋亡的jurkat细胞及对照组的活细胞，离心弃上清，并用KRPD缓冲液洗2遍。
3.弃上清，用200μl KRPD缓冲液重悬细胞，分别加入5μg/ml FITC标记的CTRP4及BSA。冰上避光孵育60min。
4.用KRPD缓冲液洗2遍，甩片，90%甘油封片。
5.荧光显微镜下观察。如图：FITC-CTRP4与凋亡细胞结合的荧光明显比对照组增强，且成斑点状。
参考图23B，表示CTRP4可识别小鼠腹腔巨噬细胞
1.C57BL/6小鼠腹腔注射2ml4%的巯基乙酸盐肉汤（商购）。
2.72h后，拉颈处死小鼠，腹腔注射5mlPBS，轻揉腹部5min，剪开腹壁，收集灌洗液。
3.取细胞灌洗液1000rpm，离心10min。并用预冷PBS洗2遍。
4.DMEM混悬细胞，接种于培养皿内，孵箱内培养2h。
5.弃掉未贴壁的细胞，收集贴壁细胞。
6.KRPD缓冲液洗2遍，200μl缓冲液重悬，加入5μg/ml FITC-CTRP4及FITC-BSA，冰上避光孵育60min。
7.用KRPD缓冲液洗2遍，流式检测荧光强度。如图：CTRP4组与对照组比较 荧光峰明显右移。
参考图24，表示CTRP4识别PMA刺激分化后的THP1：
1.THP1细胞加入PMA(10ng/ml)刺激分化48h。
2.收集细胞，KRPD缓冲液洗2遍，200μl缓冲液重悬，加入5μg/ml FITC-CTRP4及FITC-BSA，冰上避光孵育60min。
3.用KRPD缓冲液洗2遍，部分细胞流式检测荧光强度。部分细胞甩片，荧光显微镜下观察。如图:A，CTRP4组与对照组比较荧光峰明显右移。B.荧光显微镜下CTRP4组较对照组荧光增强。
参考图25，表示CTRP4促进凋亡细胞的清除：
A、B、C．均表示的是CTRP4促进体外凋亡细胞清除。
1.C57BL/6小鼠腹腔注射2ml4%的巯基乙酸盐肉汤（商购）72h。
2.取小鼠腹腔巨噬细胞，同上。
3.计数，铺6孔板，5*105/孔，贴壁1h，去除为贴壁细胞。
4.PBS洗2遍，加入诱导凋亡的及live jurkat细胞1.5*106，并加入7μg/ml、0.7μg/ml CTRP4、30μg/ml C1q。37℃孵育60min。
5.弃掉上清，收集贴壁细胞，PBS洗2遍。
6.5%血清封闭30min，加入PE-F4/80抗体避光孵育60min。
7.PBS洗2遍，200μl PBS重悬，流式检测。如图：CTRP4可明显促进巨噬细胞对凋亡细胞的清除。
图25D表示CTRP4促进体内凋亡细胞的清除：
1.WT及CTRP4转基因C57BL/6小鼠腹腔注射2ml4%的Thioglycollate broth72h。
2.腹腔注射200μl CFSE标记的诱导凋亡的Jurkat细胞，1*107个细胞/只。
3.30min后，处死小鼠去腹腔巨噬细胞，方法同上。
4.用DMEM混悬细胞，接种于培养皿内，孵箱内培养2h。弃掉未贴壁的细胞，收集贴壁细胞。PBS洗2遍。
5.5%血清封闭30min，加入PE-F4/80抗体避光孵育60min。PBS洗2遍，200μl PBS重悬，流式检测。如图：CTRP4转基因小鼠体内凋亡细胞清除率较WT小鼠增强。
序列表
<110> 北京大学
<120> CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物的应用
<130> CNC1F130041043
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccgctcgaga tgctgccgct tctgct 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ccgctcgagt caatgatgat gatgatg 27
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cccatagtaa cgccaatagg 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gggagagtga agcagaacg 19