CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物的应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310213305.6 (22)申请日 2013.05.31 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104208658 A (43)申请公布日 2014.12.17 (73)专利权人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号北 京大学 (72)发明人 王露 马大龙 马壮 那达翔 王兰兰 罗阳 张颖妹 (74)专利代理机构 中国商标专利事务所有限公 司 11234 代理人 桑丽茹 (51)Int.Cl. A61K 38/17(2006.01) A61P

2、 29/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 1/00(2006.01) A61P 11/00(2006.01) A61P 3/04(2006.01) A61P 3/10(2006.01) 审查员 宋梦 (54)发明名称 CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病或自 身免疫性疾病的药物的应用 (57)摘要 本发明公开了一种CTRP4蛋白质作为制备治 疗炎症性疾病或自身免疫性疾病的药物的应用。 本发明的上述应用可以制备有效地治疗炎症性 疾病或自身免疫性疾病的药物。 权利要求书1页 说明书18页 序列表1页 附图12页 CN

3、 104208658 B 2017.06.06 CN 104208658 B 1.CTRP4蛋白质在制备治疗炎症性疾病的药物中的应用， 所述炎症性疾病选自下列的 一种或多种： LPS所引起的内毒素性休克； 结肠炎； 细菌性肺炎； 肥胖和高血糖。 2.CTRP4蛋白质在制备用于治疗促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞的相关疾病的药物中的应 用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104208658 B 2 CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病或自身免疫性疾病的 药物的应用 技术领域 0001 本发明涉及人类CTRP4蛋白质的新应用， 具体地本发明涉及CTRP4蛋白质作为制备 治疗炎症性疾病或自身免

4、疫性疾病的药物的应用。 背景技术 0002 本案申请人于2010年7月16日向中国专利局提交了发明名称为 “人类CTRP4基因、 其编码的蛋白质及它们的应用” 的发明专利申请， 该申请于2012年2月1日公开， 公开号为 CN102337268A。 该专利申请公开了人类CTRP4基因、 其编码的蛋白质及它们的一部分应用。 0003 本案发明人基于此， 对CTRP4蛋白质的应用进行进一步研究。 尤其深入研究其作为 制备治疗炎症性疾病和自身免疫性疾病的药物的应用。 0004 LPS是革兰氏阴性细菌外壁层特有的化学成分， 主要有类脂A、 核心多糖和O-抗原 三部分组成。 机体固有免疫系统对LPS的识

5、别具有两套不同的反应体系， 细胞膜表面模式识 别受体TLR4/MD2复合物可特异性识别被LPS结合蛋白 （LPS binding protein， LBP） 和CD14 转运至细胞膜表面的LPS， 并向胞内传递跨膜信号， 通过依赖MyD88和非依赖MyD88途径活化 下游NF B、 MAPK和JNK等信号通路， 产生固有免疫应答； 体液固有免疫分支中具有糖识别结 构域的可溶性模式识别分子， 如补体C1q、 collectins （MBL、 SP-A、 SP-D） 、 pentraxins(CRP、 SAP、 PTX3)和ficlins等， 也可以有效识别并结合LPS， 防止LPS继续扩散诱发L

6、PS毒性并介导 LPS的清除。 0005 内毒素休克 （endotoxic shock） 是由短时间大量LPS诱发严重的内毒素血症所致， 给予足量的液体复苏仍无法纠正持续性低血压， 并伴有器官低灌流状态和血管微循环障碍 （DIC） ， 最终大多死于多器官功能衰竭 （multiple organ failure， MOF） 。 尽管现在的抗生素 治疗和生命体征支持疗法都得到长足的发展， 但是内毒素血症一旦发展为内毒素性休克， 死亡率还是高达20%80%。 大量文献报道， 固有免疫应答过强和后继的适应性免疫应答下 降分别是内毒素性休克早期和晚期死亡的主要原因。 而早期固有免疫应答过程开始于机体 模

7、式识别受体与病原体的识别后诱发的级 联炎症反应。 0006 补体成分在固有免疫系统中发挥着举足轻重的作用。 现已知有三条不同的补体活 化途径： 经典活化途径、 旁路活化途径和凝集素活化途径， 涉及30多种蛋白质分子。 C1q是补 体经典活化途径中的第一个成员， 是由A、 B和C三个亚基组成的异源18聚体。 每个亚基都是 由N-端信号肽、 可变区、 胶原样结构域 （活化补体成分C1r等） 和C-端C1Q球状结构域 （识别免 疫复合体等） 组成。 研究发现， 除了免疫复合物之外， C1Q球状结构域还可以识别许多其他性 质的配体， 如聚集的IgG、 IgM、 HIV-1中gp21多肽、 -淀粉样蛋白

8、、 细菌细胞壁成分LPS、 凋亡 细胞和急性时相反应蛋白等。 由于C1Q球状结构域的广谱的配体识别域， 补体C1q分子表现 出广泛而多样化的免疫调节功能， 除了结合免疫复合体活化补体经典途径之外， 还具有调 节凋亡细胞清除诱导免疫耐受、 中和病毒、 局限并清除细菌、 介导吞噬和细胞之间的粘附等 30-32。 现有研究证实， 补体C1q分子可直接与LPS结合， 并可在多种细胞中调节LPS诱导的细 说 明 书 1/18 页 3 CN 104208658 B 3 胞因子分泌。 CTRPs超家族成员分子均具有C1Q球状结构域， 目前虽没有具体数据证明该家 族中C1Q球状结构域与LPS之间的相互作用，

9、但是作为该家族分子的种内同源分子脂联素可 通过其C1Q球状结构域与LPS发生明显的相互作用， 并可体外抑制LPS诱导的NF- B活化及细 胞因子分泌， 另外， CTRP3虽然不能直接和LPS结合， 但可能与LPS特异性受体复合物TLR4/ MD2发生相互作用， 阻断LPS与TLR4/MD2的有效结合， 发挥抵抗LPS的生物学活性。 0007 现有技术已经公开的CTRP4是具有两个C1Q球状结构域CTRPs超家族成员， 其C1Q球 状结构域与补体C1q分子高度同源。 因此， 为了深入探讨CTRP4在固有免疫系统中的生物学 功能， 我们将CTRP4与LPS之间的关系作为研究重点， 以期发现CTRP

10、4在固有免疫应答中可能 发挥的作用。 0008 炎症是机体对损伤因子、 因素产生的应激和防御反应。 任何对机体有害的因素都 可以诱发炎症反应， 如生物及理化因素引起的感染， 组织与细胞损伤等。 炎症反应是把双刃 剑， 适度的炎症反应对机体清除病原感染， 组织修复以及稳态的维持具有积极意义， 但是过 度的或者持续不可控的慢性炎症反应会对机体造成严重的损害甚至危及生命， 例如炎症性 肠病和SARS。 炎症反应是多细胞和多因子共同参与的反应， 其中， 吞噬细胞是启动炎症反应 的重要细胞。 吞噬细胞表面表达多种模式识别受体 （甘露糖受体， 葡聚糖受体， Toll样受 体） ， 能迅速识别入侵的外源性生

11、物及内源性损伤信号， 产生和释放大量促炎细胞因子， 例 如IL-6， TNF- ,IL-1 ， IL-8等， 这些炎症性细胞因子发挥多种功能， 包括致炎， 致热， 趋化 炎性细胞， 激活适应性免疫细胞等作用。 单核巨噬细胞、 中性粒细胞、 NK细胞、 T细胞、 B细胞， 上皮细胞等都参与炎症反应。 因此， 炎症是多细胞多因素参与的复杂过程， 在研究炎症的过 程中利用动物模型能够更好的模拟炎症的真实性。 0009 转基因小鼠是指通过实验方法将特定外源基因导入早期胚胎细胞并整合至染色 体上,通过生殖细胞传递到子代， 从而得到的小鼠。 1980年Goden博士在实验室通过把重组 基因注射到小鼠的受精

12、卵中， 获得了第一只转基因小鼠， 这一技术为研究哺乳动物基因在 体内的表达调空功能创造了一个非常有力的手段。 1982年， Palmiter,R.D等人把金属硫蛋 白I的基因和大鼠的生长激素基因融合后， 同样应用显微注射的方式注入到小鼠的受精卵 原核中， 发现21只存活的小鼠中有6只体重大于同窝的小鼠， 而这些转基因动物的血清中生 长激素和肝脏中的融合基因的表达水平都是升高的， 这一研究结果又使转基因技术前进了 一步， 提供了融合基因的转基因方法， 为研究遗传性疾病的治疗提供了良好的开端。 1988年 之后， 这种把外源性基因转入到受精卵并且在机体内成功表达的模型已经达到了空前的规 模， 应用

13、范围扩展到了各种基因的功能研究， 免疫系统， 哺乳系统的发育等各个环节。 例如， 使用肺脏组织特异性的启动子高表达IL-9时,IL-9转基因小鼠出现了自发性肺部炎症反 应； 应用转基因技术研究人类慢性乙型肝炎已相当普遍。 0010 近些年来， 我们国家对于炎症性肠病 （IBD=inflammatory bowel disease） 的重视 程度在上升， 而从世界范围来看， 我们对于炎症性肠病的认识也因为免疫学的发展和对肠 道内菌群研究的深入得到了很大的发展。 现在关于炎症性肠病的病因学研究认为， 是因为 多种因素导致的， 包括遗传因素， 环境因素， 免疫系统的紊乱， 还有肠道菌群的问题。 00

14、11 另外， 肺炎也是一种危害很大的炎症性疾病， 包括细菌性肺炎和病毒感染引起的 肺炎或者急性严重肺损伤。 因此期待本发明的CTRP4蛋白质能够在肺炎的治疗中发挥有效 的作用。 说 明 书 2/18 页 4 CN 104208658 B 4 0012 葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠急性结肠炎模型， 是通过在饮用水中加入DSS几 天， 诱导出以血便， 溃疡， 炎症细胞浸润， 体重减轻， 腹泻等为特点的急性结肠炎， 这种化学 药物是以其对基底隐窝的肠上皮细胞的直接毒害发挥作用的， 因此影响了黏膜屏障的完整 性。 由于其症状、 病理变化与人类溃疡性结肠炎的临床症状和病理变化类似， 常被用于研究 此

15、病的发病机理， 并且可以通过连续几个循环摄入DSS 诱导慢性肠炎的发生。 另外， 与致癌 剂偶氮甲烷联用， 可以制备慢性炎症到肿瘤的模型， 对于临床炎症性肠病相关的结直肠癌 的机制研究也是非常重要的工具。 0013 此外， 肥胖是21世纪人类面临的最严峻的公共卫生问题之一， 随着都市化生活方 式普及， 肥胖人群日益增多， 而我国快速的城镇化建设则会加重这一现状。 卫生部调查显 示， 我国肥胖超重者近3亿， 糖耐量受损者约1.5亿， 糖尿病患者超过9000万。 糖尿病已成为 威胁我国人民健康的突出问题， 同时对医疗保障体系和社会福利制度提出了严峻挑战。 0014 20世纪90年代初已有人发现一些

16、促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子TNF- 、 白细胞 介素、 干扰素等在多种组织中影响葡萄糖浓度的稳定性。 近年来炎症反应在糖尿病发生发 展中的作用及与其他糖尿病危险因素关系问题的研究受到越来越广泛关注。 2010年以来， Cell、 Nature、 Science期刊连续发表十余篇专题报道， 从遗传因素、 环境因素、 基因信号转 导、 机体肠道菌群等多方面阐述了肥胖与糖尿病发生发展机制及调控现状， 并提出一系列 解决思路。 肥胖和糖尿病常常同时存在， 肥胖与糖尿病不仅是一个高血糖的疾病， 也是一种 炎症性疾病， 而炎症反应是连接它们之间的纽带。 肥胖患者体内存在慢性、 低度炎性反应， 其脂肪组织

17、中的T细胞和巨噬细胞明显增加， 二者通过影响前脂肪细胞和脂肪细胞的功能 导致炎性因子的上调。 但是这与典型的炎性反应不同， 肥胖患者体内虽然有许多炎性介质 升高， 但没有典型的红、 肿、 热、 痛炎性反应。 因此， 有学者把这种反应称为 “代谢性炎性反 应” 。 促炎因子IL-1、 IL-6和TNF 等细胞因子不仅由免疫活性细胞产生， 也可由脂肪和肌肉 细胞产生。 不仅参与机体的炎症反应过程， 还是能量代谢平衡的重要调节因子。 它们能够阻 断体内胰岛素的生物学功能， 使胰岛素敏感性下降， 导致胰岛素抵抗的发生。 人体总IL-6的 30来自脂肪组织， 所以肥胖者脂肪组织分泌的IL-6可明显增加。

18、 长期过度分泌IL-6可导 致胰岛 细胞分泌功能受损及产生胰岛素抵抗。 而高血糖又可促进胰岛细胞分泌IL-6， 大量 的IL-6可促进B淋巴细胞分化， 产生过量的IgG， 该作用和其他细胞因子产生的细胞毒作用 结合， 可引起胰岛 细胞凋亡。 TNF- 在胰岛素抵抗的病理过程中起了重要的作用， 肥胖者脂 肪细胞产生的过量的TNF- 抑制肌肉组织胰岛素受体酪氨酸激酶活性， 降低胰岛素作用。 TNF- 还能降低PPAR mRNA的表达而减少PPAR的产生， PPAR在免疫细胞和血管壁细胞中表达 具有抗炎和促凋亡作用； TNF- 又可引起胰岛内巨噬细胞活化释放IL-1、 IL-6等， 因此， 长期 高

19、浓度的炎症因子刺激可导致胰岛细胞分泌功能受损及产生胰岛素抵抗。 对炎症因子与 肥胖和糖尿病之间关系的研究或许可以提供新的更有效的诊断、 预防和治疗手段。 0015 TLR4是一种重要的模式识别受体， 在肥胖与高血糖的发生、 发展中也起了重要作 用。 它几乎在所有人体细胞表达， 并有实验证实在胰岛 细胞上也存在TLR4的表达， 而且 TLR4的配体种类多样， 可以是细菌胞壁， 内毒素， 也可以是非细菌的配体， 如饱和脂肪酸(棕 榈酸)。 细菌性炎症免疫应答需要TLR4参与和活化； 游离脂肪酸也能够活化TLR4引起炎症免 疫反应。 营养过剩， 肥胖， 导致胰岛素抵抗的发生需要TLR4的参与， TL

20、R4激活后， 其胞浆区通 过募集接头蛋白MyD88引起下游转录因子NFKB， IRF3和MAP激酶的激活。 通过MyD88依赖的通 说 明 书 3/18 页 5 CN 104208658 B 5 路引起的NFKB和MAPKs的激活促炎症因子释放。 0016 CTRP4是C1QTNF相关蛋白质家族成员。 C1QTNF （CTRP） 家族是一类新发现的主要来 自脂肪组织的脂肪细胞因子， 以其高度保守的C端补体C1Q球状结构域为特征而命名。 发明 人初期的体外研究表明CTRP4在肝癌细胞系可以活化NF B， 上调IL-6的表达以及促进STAT3 的磷酸化， 相关的文章发明人发表在CANCER LET

21、TER上。 继续的研究发现， 对髓系来源的细 胞CTRP4显示了明显的抗炎的作用； 而不同的动物模型研究在体内也均显示了抗炎作用。 根 据已有报道， 很多CTRP家族的成员均在脂代谢中发挥了很重要的作用， 那么CTRP4在脂代谢 中起了什么作用呢？ CTRP4会不会通过抑炎而抑制肥胖呢？ 之前的实验已经证明， CTRP4能够 抑制TLR4与LPS的结合， 从而可以抑制LPS引起的内毒素性休克。 因此， 我们的假设是： CTRP4 是通过抑制TLR4， 抑制STAT3而抑制炎症细胞因子的产生从而抑制肥胖和胰岛素抵抗， 进而 抑制了高血糖的发生。 我们希望通过实验验证我们的假设。 阐明CTRP4的

22、作用机制具有重要 的理论意义与实用价值， 理论上阐明它的作用机制对肥胖与糖尿病的发病机制的研究将是 一种重要贡献； 应用上， CTRP4是一种分泌蛋白， 已经证明其重组蛋白具有生物学活性， 因此 CTRP4具有潜在的临床应用价值。 肥胖与代谢综合征糖尿病不仅是一个高血糖的疾病， 也是 一种炎症性疾病， 肥胖患者体内存在慢性、 低度炎性反应。 其脂肪组织中的T细胞和巨噬细 胞明显增加， 二者通过影响前脂肪细胞和脂肪细胞的功能导致炎性反应因子的上调。 但是 这与典型的炎性反应不同， 肥胖患者体内虽然有许多炎性反应介质升高， 但没有典型的红、 肿、 热、 痛炎性反应。 因此， 有学者把这种慢性炎性反

23、应称为 “代谢性炎性反应” 。 IL-1、 IL-6 及TNF 可能均参与糖尿病发病， 长期过度分泌的IL-1及TNF 可导致胰岛B细胞分泌功能受 损及产生胰岛素抵抗。 0017 自身免疫病性疾病的病因之一在于机体无法清除自身所产生的凋亡细胞， 本发明 已经在体内外证明， CTRP4蛋白可以明确促进吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬和清除， 因此， CTRP4可以应用于治疗自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮的药物制备。 发明内容 0018 本发明的目的是提供CTRP4蛋白质在作为制备治疗炎症性疾病和自身免疫性疾病 的药物中的应用。 0019 为此， 本发明提供了一种CTRP4蛋白质作为制备治疗炎症性疾病的药

24、物的应用。 其 中所述炎症性疾病选自下列的一种或多种： LPS所引起的内毒素性休克； 急、 慢性结肠炎； 肺 炎； 肥胖和高血糖。 0020 本发明也提供了CTRP4蛋白质在作为制备促进巨噬细胞吞噬凋亡细胞的药物的应 用。 0021 本发明也提供了CTRP4蛋白质作为制备治疗自身免疫性疾病的药物的应用。 0022 本发明也提供了CTRP4蛋白质作为制备治疗系统性红斑狼疮的药物的应用。 0023 本发明的上述应用可以制备有效地治疗炎症性疾病和自身免疫性疾病的药物。 附图说明 0024 图1是CTRP4F1代转基因小鼠66号小鼠的PCR鉴定。 0025 图2是CTRP4F2代CTRP4转基因小鼠6

25、5号的鉴定。 说 明 书 4/18 页 6 CN 104208658 B 6 0026 图3是F2代纯合子小鼠的鉴定。 0027 图4是Western Blotting检测纯合子小鼠中各个CTRP4的表达。 0028 图5是CTRP4-His融合蛋白与LPS之间的结合作用。 0029 其中1： PBS； 2： 1%BSA； 3： 煮沸15分钟的CTRP4(2ug/ml) （目的是为证明CTRP4的作用 不是由于残留的LPS所致） ； 4： VSTM-1-V2-HIS(1.4ug/ml)； 5： CTRP4(0.1ug/ml)； 6： CTRP4 (0.5ug/ml)； 7： CTRP4(2ug

26、/ml)； 8： LPS(20ug/ml)+CTRP4(2ug/ml)。 0030 图6是THP1细胞中TLR4的mRNA表达。 0031 图7A-D是FITC-LPS与THP1细胞的结合。 0032 其中(A） CTRP4-His融合蛋白与FITC-LPS同时处理THP1细胞， CTRP4-His融合蛋白 的高、 中、 低剂量浓度分别为100ng/ml， 1ug/ml， 10ug/ml；（B） CTRP4-His融合蛋白与FITC- LPS先37孵育30min再加入处理THP1细胞， CTRP4-His融合蛋白的高、 中、 低剂量浓度分别 为100ng/ml， 1ug/ml， 10ug/ml

27、；（C） 多粘菌素B与FITC-LPS同时处理THP1细胞， 多粘菌素B的 高、 中、 低剂量浓度分别1ug/ml， 10ug/ml， 100ug/ml；（D） 未标记的LPS与FITC-LPS同时处理 THP1细胞， 游离LPS的高、 中、 低剂量浓度分别1ug/ml， 10ug/ml， 100ug/ml。 灰底峰代表阴性 对照， 黑线白底代表FITC-LPS组， 彩色白底代表实验组。 0033 图8是CTRP4抑制LPS诱导的细胞因子表达。 0034 其中(A)1ug/mlLPS或者1ug/mlLPS与不同浓度CTRP4-His融合蛋白联合处理THP1 细胞6小时后， IL-6、 TNF-

28、 和IL-10的mRNA水平的变化;(B)1ug/mlLPS或者1ug/mlLPS与不同 浓度CTRP4-His融合蛋白联合处理THP1细胞6小时后， IL-6的蛋白水平的变化； (C)1ug/ mlLPS或者1ug/mlLPS与不同浓度CTRP4-His融合蛋白联合处理THP1细胞后细胞培养上清中 TNF- 含量的时间变化； *代表P0.01， *代表P0.001。 0035 图9是野生型小鼠和CTRP4转基因小鼠诱导内毒素休克后的生存曲线。 0036 其中野生型C57BL/6小鼠 （n=16） 和CTRP4转基因C57BL/6小鼠 （n=11） 腹腔注射 30mg/kg来自菌株E.coli

29、055:B5的LPS诱导内毒素休克后， 每2h观察1次。 数据来自2次独立 实验的联合数据， *代表P0.01。 0037 图10表示在急性结肠炎模型中CTRP4转基因小鼠的结肠长度比对照组长。 A图为模 型构建后牺牲小鼠的结肠长度情况。 B图为A图的统计图。 P=0.0021 0038 图11表示转基因CTRP4小鼠的腹泻情况减轻。 在DSS诱导的急性结肠炎模型中 CTRP4转基因小鼠和阴性对照组小鼠腹泻程度的比较， *代表P0.01。 0039 图12表示转基因CTRP4小鼠的血便情况减轻。 在DSS诱导的急性结肠炎模型中 CTRP4转基因小鼠和阴性对照组小鼠的血便评分情况。 *代表P0.

30、01。 0040 图13表示转基因CTRP4小鼠的体重变化情况。 在DSS诱导的急性结肠炎模型中转基 因CTRP4小鼠和阴性对照组小鼠体重的比较。 *代表P0.01. 0041 图14表示转基因CTRP4小鼠在结肠炎模型中结肠病理情况减轻。 图为代表性的显 微镜图片， 放大倍数为200倍。 0042 图15表示通过组织学评分CTRP4转基因小鼠在结肠炎模型中炎症程度减轻。 反应 肠炎严重程度的组织学评分显示转基因小鼠的评分比阴性对照组低。 0043 图16表示转基因CTRP4小鼠在急性结肠炎模型中的生存率明显提高。 在葡聚糖硫 酸钠诱导的急性结肠炎模型中转基因CTRP4小鼠和对照组小鼠的生存曲

31、线横坐标为DSS诱 说 明 书 5/18 页 7 CN 104208658 B 7 导的天数， 纵坐标为小鼠的死亡百分比， CTRP4组n=8， WT组n=8.WT小鼠在第7、 8、 9、 10天每天 死亡一只小鼠， 而CTRP4小鼠在11天未见死亡。 0044 图17表示CTRP4转基因小鼠结肠中细胞因子TNF- 的表达量明显降低。 急性结肠炎 模型中结肠匀浆上清检测TNF- 的数值， P=0.0026。 0045 图18表示CTRP4转基因小鼠的糖耐量实验。 CTRP4转基因鼠糖耐量比野生型鼠有明 显差异， 转基因鼠的血糖水平较野生鼠明显降低。 0046 图19和图20表示高脂喂养的结果。

32、 0047 图21表示高脂喂养16周后， CTRP4基因鼠体重较野生鼠的体重明显减低， 具有统计 学意义。 0048 图22表示CTRP4与凋亡细胞的识别。 0049 其中 （A） Jurkat细胞凋亡状态。 Jurkat细胞UV照射1.2min （早期凋亡） 和5min （晚期 凋亡） ， 用AV-PI双染方法流式细胞术分析凋亡状态；（B） 、（C） 活细胞、 早期凋亡和晚期凋亡 Jurkat细胞与FITC-BSA、 FITC-CTRP4室温孵育30min后流式细胞术分析FITC荧光强度。 0050 图23A-B表示CTRP4可以与小鼠腹腔巨噬细胞结合。 0051 图24A-B表示THP1细

33、胞用PMA(10ng/ml)处理2天使其分化成巨噬细胞， 用(5ug/ml) FITC-CTRP4孵育60分钟进行检测。 0052 图25A-D表示CTRP4促进体内凋亡细胞的清除。 具体实施方式 0053 实施例1： 制备:CTRP4转基因小鼠 0054 真核细胞表达质粒pcDNA3.1-Myc/HisB(-) （本论文中简称PCDB） 购自Invitrogen 公司， 制备pCAGGS-CTRP4转基因质粒。 具体过程如下： 真核细胞表达质粒pcDNA3.1-Myc/ HisB(-) （本论文中简称PCDB） 购自Invitrogen公司， pCAGGS-CTRP4质粒的构建方案如图所 示

34、。 其基本过程如下： 设计包含Xho1酶切序列的CTRP4基因特异性引物， 以pcDNA3.1-Myc/ HisB(-)质粒为模板， 克隆方案中， 上下游引物具体序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2： 0055 PCR扩增得到的片段连同真核表达载体pcDNA3.1-myc/his(-)B采用同样的限制性 内切酶进行酶切。 酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离， 切胶回收目的条带。 回收的载体 和PCR片段用T4DNA连接酶进行连接， 16， 12小时。 将连接产物进行转化。 0056 以下为转化过程： 缓慢抽吸50 l感受态大肠杆菌XL1-BLUE到连接产物中， 在冰上 放置

35、30分钟， 在42水浴中热激90秒钟， 迅速放到冰上， 经过5分钟的恢复后， 加入LB的培养 基400 l， 后37培养45分钟让细菌恢复状态并表达抗性， 离心8000rpm， 2分钟， 弃上清， 留 400 l重悬， 涂布于LA平皿上， 30倒置培养过夜。 挑取克隆扩增培养， 提取质粒进行鉴定。 鉴定是否有插入片段、 插入片段的大小、 片段插入的方向。 对符合目的要求的阳性克隆进行 质粒测序， 测序结果与NCBI标准数据库中的CTRP4ORF序列进行比对， 准确无误后进行质粒 大量提取， 质粒线性化， 定量除菌后通过商业付费委托给中国医学科学院医学实验动物研 究所 （地址： 北京市朝阳区潘家

36、园南里5号院， 邮编： 100021） 制作转基因小鼠。 由其提供合格 的CTRP4转基因小鼠。 0057 1.提取鼠尾基因组DNA 说 明 书 6/18 页 8 CN 104208658 B 8 0058 1)在剪取鼠尾的前一天配制鼠尾裂解液 （商购） ； 0059 2)编号并剪去小鼠的尾巴0.5cm左右， 放入EP管中； 0060 3)在每个EP管中加入上述的裂解液500ul并加入0.1mg/ml的蛋白酶K(Proteinase K)放入55水浴锅里过夜； 0061 4)第二天， 加入300 l饱和的NaCl(35.2g NaCl定容至100ml)， 颠倒混匀6-8次， 冰 浴15分钟；

37、0062 5)12000rpm， ， 室温离心15分钟； 0063 6)转移400 l上清液至另一新的离心管， 加入700 l的异丙醇， 颠倒直至形成絮状 沉淀； 0064 7)12000rpm室温离心15分钟； 0065 8)弃掉上清， 加入1ml70%乙醇洗涤沉淀， 弃掉乙醇并晾干； 0066 9)根据得到的沉淀 （即DNA)的量加入50ul， 65的双蒸水溶解。 0067 2.PCR鉴定CTRP4转基因小鼠 0068 （1） 引物： 根据pCAGGS载体的启动子序列小鸡 -肌动蛋白， 使用中国医学科学院医 学实验动物研究所设计的引物序列和扩增条件如下： 0069 0070 PCR反应体系

38、： 5 l2*TAQ-Mix， 4 l H2O， 0.2 l前向引物， 0.2 l反向引物， 0.6ul模 板， 反应结束后取5 l进行1%琼脂糖电泳。 0071 3.转基因小鼠各个组织蛋白的提取 0072 1） 分离小鼠各器官， 称重， 每100mg组织中加入500 l的RIPA裂解液(商购) （其中加 入1mM的PMSF （苯甲基磺酰氟） ） 至匀浆管中， 匀浆20S后， 将匀浆管从匀浆机上取回迅速插入 冰上30s以防止蛋白降解， 然后再匀浆20s。 0073 2） 把组织匀浆液放入离心机12000rpm， 4， 20分钟， 小心吸取上清液至另一离心 管中。 0074 3） 蛋白定量： 按

39、BCA定量试剂盒说明书提供的方法进行蛋白定量。 0075 4.检测CTRP4转基因小鼠各个组织的蛋白水平的表达 （Western Blotting） 0076 收集上一步的组织匀浆液上清， 加入SDS加样缓冲液 （ 巯基乙醇， 甘油， 20SDS， 0.1溴酚蓝） ， 99保温10分钟， 离心后取上清， 12.5的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳， 电泳 分离蛋白样品后， 用100v， 1.5小时， 湿法电转印至硝酸纤维素膜上， 以TBST （Tris-HCl, NaCl， 0.1%Tween-20） 配制5脱脂牛奶， 4封闭2小时后， 与一抗结合4过夜， 之后用TBST 震荡洗膜三次， 每次10分钟

40、， 再加入相应的IRDyeTM800/700conjugated二抗避光反应一小 时， TBST重复洗膜三次， 然后用Odyssey Imaging System仪器扫描成像分析。 0077 5.CTRP4转基因动物繁殖及纯合子筛选 0078 5.1转基因小鼠F1代的繁殖 说 明 书 7/18 页 9 CN 104208658 B 9 0079 我们将CTRP4转基因鼠首建鼠 （founder） （CTRP4 1、 7、 17、 23、 66， 5、 14、 22、 3、 65、 29、 54、 18） 分别与育龄期的野生型C57BL/6J小鼠交配， 小鼠一般在受精后19-21天分娩， 据 此

41、， 我们在大约两周之后观测小鼠腹部并用指揉法判断小鼠的胚胎情况， 如果证实确已受 孕， 即把雌鼠分笼。 小鼠一代生育的子鼠在6-12只左右， 在F1代小鼠出生12天左右对小鼠编 号并鉴定小鼠的基因型， 得到CTRP4杂合子转基因小鼠， 在4周时将新生小鼠离乳。 0080 5.2F2代转基因小鼠的繁育 0081 用F1代鉴定阳性的CTRP4杂合子小鼠进行近亲交配， 即同窝阳性小鼠的雌雄交 配， 根据最适的雌雄比例 （雄:雌=1:2） 进行， 编号及鉴定方法同F1代。 0082 5.3F2转基因纯合子小鼠的筛选 0083 根据孟德尔遗传定律， F2代小鼠中有一定概率纯合子小鼠出现 （约1/4） 。

42、 因此， 通 过测交的方法来筛选F2代中的纯合子小鼠， 即把得到的每一只CTRP4阳性F2代小鼠与野生 型的C57BL/6J小鼠进行交配， 通过子代小鼠判断F2代小鼠中的纯合子鼠， 如果子代小鼠经 过PCR鉴定100%为CTRP4阳性， 则表明亲代小鼠为纯合子小鼠， 否则为杂合子小鼠。 PCR鉴定 方法同上。 0084 阴性鼠的来源： 我们把F1代小鼠中的阴性小鼠进行交配， 并大量繁殖， 进而得到用 于实验对照的阴性小鼠。 0085 6.F1代小鼠的繁殖和基因型鉴定 0086 通过F0代转基因小鼠和野生型C57BL/6J小鼠交配， 得到F1代小鼠。 最终鉴定CTRP4 有30只阳性小鼠， 参见

43、图1， 为代表性的图片。 1-6号和7-12号小鼠分别是66号小鼠生产的两 窝小鼠， 共12只， 只有2只阳性， 分别为11、 12号， 两只都为雌性。 0087 7.F2代小鼠的繁殖和鉴定 0088 我们选择F1代小鼠同窝并且至少有1只雄性， 1只雌性的小鼠进行同窝交配， 最终 我们筛选出CTRP45号1 2， 7号和65号分别1 1， 即CTRP4一共有4窝进行繁殖。 结果见图 2， CTRP4小鼠65号生产的7只小鼠中第1只和第6只为阳性， 其中1号为雌性， 6号为雄性。 0089 8.F2代纯合子小鼠的筛选 0090 最终经过PCR的鉴定， 发现了CTRP4共8只纯合子， 分别为CTR

44、P4： 5-4-1； 5-4-2； 7-4- 1； 7-4-2； 7-4-4； 65-1-1； 65-1-9； 65-1-11。 见图3， 通过CTRP4F2代小鼠与野生型小鼠交配生 成的F3代小鼠的鼠尾DNA经过PCR鉴定的结果， 1-7号分别为F3代小鼠中的同窝小鼠。 0091 9.CTRP4转基因小鼠体内表达的鉴定 0092 我们取小鼠的各个器官进行匀浆处理得到的器官进行Western Blotting， 结果发 现纯合子转基因小鼠蛋白表达水平要比野生型小鼠明显升高， 证明纯合子小鼠确实高表达 人类CTRP4基因， 结果见图4， 通过Western检测了对照组小鼠和野生型小鼠心肝脑肾的

45、CTRP4表达情况。 WT代表对照组小鼠， C4代表CTRP4转基因小鼠。 阴性鼠为通过上述F1阴性 小鼠经过交配后大量繁殖的小鼠。 0093 实施例2： CTRP4体外和体内抑制LPS所引起的内毒素性休克 0094 1.ELISA检测CTRP4与LPS之间的直接相互作用 0095 检测方法具体步骤如下： 0096 包被： 购自Sigma公司的E.coli055:B5LPS以10ug/ml的终浓度溶解于蒸馏水， 超声 3次， 每次15s。 然后用50ul/孔 （500ng） LPS水溶液包被96孔ELISA板室温过夜， 让孔中蒸馏水 说 明 书 8/18 页 10 CN 104208658 B

46、 10 蒸发完全； 0097 封闭： 包被好的ELISA板60热激活30min， 200ul/孔的Tris缓冲液37封闭2h， Tris缓冲液的配方是50mmol/L Tris-HCI， 50mmol/L NaCI， 1mg/ml BSA， PH8.0； 0098 洗涤： 0.05%的PBST洗涤5遍； 0099 结合反应： 50ul/孔含有5mmol/L CaCI2和0.1mg/ml BSA的不同浓度的CTRP4-His 融合蛋白溶液室温反应3h， 50ul/孔PBS缓冲液和1%BSA作为阴性对照， 50ul/孔VSTM1-V2- His融合蛋白作为无关对照； 0100 洗涤： 0.05%的

47、PBST洗涤5遍； 0101 一抗反应： 50ul/孔的小鼠来源的抗His-标签抗体37反应1.5h； 0102 洗涤： 0.05%的PBST洗涤5遍； 0103 二抗反应： 50ul/孔HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗， 室温反应1h； 0104 洗涤： 0.05%的PBST洗涤5遍； 0105 显色： 50ul/孔TMB工作液室温反应20min； 0106 终止反应： 50ul/孔2M硫酸终止反应； 0107 读数： ELISA读板机测定OD450。 0108 CTRP4-His融合蛋白的制备方法如下： 采用PCR技术从pcDB-hCTRP4重组载体中， 扩 增或人工合成CTRP4基因OR

48、F中不含信号肽的目的基因片段， 在上下游引物的5 端分别插入 Nde I和Xho I限制性内切酶位点。 PCR产物长度964bp， 回收产物经Nde I和Xho I双酶切， 同 时也双酶切pET-32a质粒， 将hCTRP4片段和pET-32a载体片段连接构建质粒pET-32a-hCTRP4 经PCR和测序鉴定pET-32a-hCTRP4质粒。 缓慢抽吸50 l感受态大肠杆菌XL1-BLUE到连接产 物中， 在冰上放置30分钟， 在42水浴中热激90秒钟， 迅速放到冰上， 经过5分钟的恢复后， 加入LB的培养基400 l， 后37培养45分钟让细菌恢复状态并表达抗性， 离心8000rpm， 2分 钟， 弃上清， 留400 l重悬， 涂布于LA平皿上， 30倒置培养过夜。 挑取克隆扩增培养， 提取质 粒进行鉴定。 根据不同条件的小量诱导表达， 最后确定采用24、 10h、 IPTG终浓度为 0.4mmol/L的条件进行CTRP4-his重组融合蛋白的诱导表达。 用镍柱进行亲和层析纯化， 在 pH8.0、 咪唑浓度为500mmol/L的洗脱液洗脱得到目的蛋白。 超滤去除咪唑， 最后通过DEAE阴 离子交换柱去除内毒素， 200mL菌液最后能得到