重组的C140受体及其活化剂和颉颃剂 【技术领域】
本发明涉及一种归属于G-蛋白-偶联受体总类的新发现的受体。该受体在血管的内皮细胞中表达。避免对该受体的作用是限制用于激活该类其它受体的药物的副作用的重要因素。
技术背景
动物对许多治疗性药物和预防性药物的反应是通过位于细胞表面的受体介导的。这样的受体中的一类是G-蛋白-偶联受体，它们的生理作用是通过一种被称为G-蛋白的三亚基蛋白复合物介导的，它与此类型受体结合后释放一个亚基并由此引发附加的细胞内反应。这一亚类的受体还有肾上腺素能的受体，神经肽受体，凝血酶受体和作为本发明主题的C140受体。此类受体地特征在于具有七个将受体固定在细胞表面内的跨膜区。
治疗性药物设计者容易忽略的一个设计目的是在无副作用的情况下引起主体中的需要的反应。所以，被设计成针对例如凝血酶这样的特异受体的药物应该只与凝血酶受体特异地反应而不作用于相关受体。本发明的C140受体可能与调节血管压有关，而该受体的意外地激活或封闭则会产生不可预言的因而是不希望的后果。所以需要预先测定设计成针对例如凝血酶受体的药物会否产生与C140受体反应的副作用。本发明通过提供在简便检测系统中用于产生C140受体的重组材料和用于此检测的活化剂和颉颃剂使预先测定候选药物中是否具有与C140受体反应的副作用成为可能。通常不希望产生该副作用，因为据信，C140受体会对如与外伤和免疫失调有关的丝氨酸蛋白酶之类的酶产生反应。发明内容
本发明提供了用于确定候选药物产生副作用的倾向性的检测系统的方法和材料。C140受体的分离、重组子产生和鉴定使以该受体为底物并以该受体的活化剂和颉颃剂为检测中的对照剂的检测系统的设计成为可能。
所以，一方面，本发明着重于与C140受体的产生有关的重组材料。它们包括，例如，可被培养以在其表面显示C140受体的转染的细胞，并由此提供一种检测系统检测与天然C140受体能相互作用的物质。通常，可用于此类检测系统的宿主细胞限于那些其表面有合适的受体表达机制并含有作为细胞内反应介体的G-蛋白的细胞。(但是，只测定结合率的系统不需要G-蛋白)。大多数动物细胞合乎这些要求。
另一方面，本发明着重于C140受体的活化剂，它们类似于被活化形式的受体蛋白胞外部分。这些活化剂在上述检测中用作对照剂以检验检测系统的工作能力。另外，C140受体活化剂可在体内表现出降血压作用。所以，活化剂本身可能还可用作抗高血压药物。
再一方面，本发明着重于C140受体的颉颃剂。该颉颃剂由缺乏活化受体所需的必要特性的修饰后的C140受体活化肽构成。这些颉颃剂与受体结合，但不将其活化，由此防止受体被活化剂和天然受体结合配体所激活。
另一组颉颃剂包括被设计成与受体蛋白的特定部分结合的抗体。通常，这是一些对C140受体的任意所希望的区域具有高度特异性的单克隆抗体制剂。本发明的抗体还可用于对受体蛋白的免疫检测，例如，评价基因在重组系统中的成功表达。
还有一方面，本发明涉及使用C140受体来筛选候选药物的活化剂和颉颃剂活性的检测系统。这种检测在确保治疗药剂无C140受体的激活或抑制引起的副作用方面特别有用。在某些情况下，本受体系统中的活化剂活性可能具有治疗用途。在有些这类检测系统中，活化肽被用作正对照。该检测还可用于筛选抑制活化剂作用的颉颃剂。
本发明的另一方面涉及通过在血液或尿液等液体中检测当受体被激活时从C140受体上被切除的肽来进行的对以C140受体被激活为特征的情况的诊断。本发明的另一种诊断方法是利用对激活的受体具有特异性的抗体将一种影印剂定位于激活的受体的原位来目测出被激活的受体。
本发明的其它方面着重于含有本发明的活化剂和颉颃剂的药物复方。本发明的活化剂是抗高血压药；相反的，颉颃剂可在需要时提高血压。
附图简述
图1显示的是小鼠类C140受体的DNA和推导的氨基酸序列。
图2显示的是人C140受体的DNA和推导的氨基酸序列。
图3显示的是人C140受体和鼠C140受体的氨基酸序列之间的比较。
图4显示的是根据推导的氨基酸序列提出的C140受体活化模式。
图5显示的是小鼠C140受体和人凝血酶受体的氨基酸序列之间的比较。
图6显示的是检测小鼠类各种组织中编码C140受体的mRNA的存在的Northern Blot结果。
图7显示的是表明一种C140受体活化剂肽的体内降压作用的血压示踪图。
图8显示的是由C140受体活化剂肽诱导的大鼠股静脉内的血管扩张。图8a显示的是固定化静脉中的结果；图8b显示的是剥除了内皮细胞的固定化静脉中的结果。
图9显示的是表达于蛙卵母细胞中的C140受体被血纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、或胰蛋白酶激活的测定结果；图9a显示的是血纤维蛋白溶酶的激活结果；图9b显示的是激肽释放酶激活结果；图9c显示的是胰蛋白酶的激活结果。
图10显示的是编码小鼠类C140受体的cDNA克隆的核苷酸和推导的氨基酸序列。
图11显示的是编码人C140受体的cDNA克隆的核苷酸和推导的氨基酸序列。
图12显示的是用小鼠类C140受体探针与新生小鼠切片原位杂交的结果。
图13显示的是抽提自人细胞系的总RNA与人C140受体探针杂交的Northern Blot结果。
本发明实施方式
由本发明阐明的C140受体的特征被概括于图1-4中。图1显示了编码小鼠类受体的克隆的完整的DNA序列以及推导的氨基酸序列。本文中，“C140受体”指任意种类动物内的与含于本文实施例1所述的C140克隆中的小鼠类受体相应的受体。使用编码小鼠类形式的这种受体的天然DNA，如本文所述，可获得包括人在内的其它种的相应受体。图2显示了相应的人类受体的DNA和推导的氨基酸序列。
小鼠类受体的完整氨基酸序列含有包括一条27个氨基酸的信号肽在内的395个氨基酸，切除该信号肽后形成含368个氨基酸的成熟受体蛋白。同样，人类该受体由对应于包括一条29个氨基酸的信号肽在内(切除后可形成一个369个氨基酸的成熟受体蛋白)的398个氨基酸的的开放式阅读框架所编码，如图2所示。
图3显示了人和小鼠的氨基酸序列的比较；如图所示，这些序列表现出了高度的同源性。
图1和图2所示序列中的亲水/疏水区表明，成熟的C140受体归属于由G-蛋白来介导对细胞的作用的7-跨膜区受体类的一个成员。成熟的C140受体具有较长的胞外氨基酸延伸部分，其中含有几个天冬酰胺连接的糖基化作用的保守位置。它还含有一个位于第一个跨膜区的保守的天冬酰胺，位于第二跨膜区的Leu-Ala-X-X-Asp残基，位于第4跨膜区的一个Trp和一个含有多个丝氨酸和苏氨酸残基并以羧基为终端的尾巴。图4中显示了被提出的原位受体的模型。
根据图5，很容易发现与凝血酶受体的相似性。图5对小鼠类C140受体和人类凝血酶受体的氨基酸序列进行了比较。已知，凝血酶是通过蛋白酶解切开位于41和42位的Arg-Ser连键而被激活的，这种切开作用释放出一条活化肽，可使受体重新折叠并通过新产生的氨基端活化。以相似的方式，C140受体通过切开位于34和35位的Arg-Ser连键而被激活，这种切开也产生一条由推导的成熟蛋白的1位至切断点的活化肽。据信，Arg-28是成熟蛋白氨基端的氨基酸残基，所以，活化肽的序列为RNNSKGR。该肽可由此被用作C140受体活化作用的标记。无论如何，成熟受体的N-端的准确定位对设计活化剂或颉颃剂都不重要。活化肽很可能易于被肾滤过并在尿液中被浓缩，所以可被用作C140受体活化作用的标记。
活化肽的释放允许进行受体蛋白的重新折叠以激活受体。这一点以图解方式显示于图4，该图还显示了活化肽释放而引起的构相改变和受体的细胞内构相改变中发生的重新折叠的结果。这一假说由于发现C140受体可被一类似于由活化产生的新的氨基终端的肽所激活而被确证。所以，活化的受体的新氨基终端的N-终端的类似物可起到受体的活化剂的作用。受体中新产生的氨基端的头5个氨基酸对受体活化的重要性还可在下文中得以确证。
在这些资料的基础上，以及和胰蛋白酶原被激活成胰蛋白酶作用机制和凝血酶受体的激活机制所作的类比，在配体切割受体时新暴露的丝氨酸上带正电的氨基似乎在受体的活化中起着重要作用。以活化肽的序列为基础的并与C140受体结合的，但通过修饰而缺失了游离的α-氨基的肽可起到此类受体的颉颃剂的作用。所以，缺乏特异性激活反应能力的活化肽的修饰产物可作为C140受体的颉颃剂。本发明的化合物
用于描述本发明中肽类化合物的命名遵循常规方法，即设定肽链中每个氨基酸残基的N-端的氨基在左，羧基在右。在表示被选定的本发明具体实施例的结构式中，虽未具体表示，氨基和羧基端的基团应被理解为其生理pH值下的形式，除非另有说明。所以，虽然没有必要特别说明和表示，但无论在具体实施例或是通用结构式中，都应将其理解为生理pH条件下的N-端H2+和C-端O-的形式。氨基酸残基侧链上的游离官能团还可以通过酰胺化作用、酰化作用或其它取代作用而被修饰，从而，例如，可在不影响其活性的条件下改变化合物的溶解度。
在所示的肽链中，根据以下常规列表，每一个由基因编码的合适氨基酸由单个字母表示，对应于该氨基酸的三字命名：氨基酸
单字母标志 三字母标志
丙氨酸 A Ala
精氨酸 R Arg天冬酰胺 N Asn天冬氨酸 D Asp半胱氨酸 C Cys谷氨酰胺 Q Gln谷氨酸 E Glu甘氨酸 G Gly组氨酸 H His异亮氨酸 I Ile亮氨酸 L Leu赖氨酸 K Lys甲硫氨酸 M Met苯丙氨酸 F Phe脯氨酸 P Pro丝氨酸 S Ser苏氨酸 T Thr色氨酸 W Trp酪氨酸 Y Tyr缬氨酸 V Val
不由基因编码的氨基酸的缩写可见后文论述。
在本申请中所示的具体肽链中，所指的都是具有旋光异构体的氨基酸残基的L-型，除非特别标以一个箭头上标(个)来表示其为D-型。
本发明中的化合物是部分地根据既定分类的氨基酸残基来定义的肽。氨基酸残基通常可被分为以下4大亚类：
酸性：该残基在生理pH条件下因失去一个H离子而带负电荷，而且当肽链处于生理pH值的水性介质中时，该残基会被水性溶液所吸引所以在包含它的肽链的构相中找到表面位置。
碱性：该残基由于在生理pH条件下结合了一个H离子而带正电，而且当肽链处于生理pH值的水性介质中时，该残基会被水性溶液所吸引所以在包含它的肽链的构相中找到表面位置。
中性/非极性：此类残基在生理pH条件下不带电荷，而且当肽链处于生理pH值的水性介质中时，该残基会被水性溶液所排斥以致在包含它的肽链的构相中找到内部位置。本文中，也将此类残基命名为“疏水”残基。
中性/极性：此类残基在生理pH条件下不带电荷，但当肽链处于生理pH值的水性介质中时，该残基会被水性溶液所吸引所以在含有它的肽链的构相中找到外部位置。
当然，可以理解，在各个残基分子的统计学集和中，有些分子带电而有些分子不带电，所以对水性介质的吸引作用或来自水性介质的排斥作用或大或小。为了符合“带电”这一定义，必须有相当百比(至少约25％)的各种分子在生理pH条件下带有电荷。符合极性或非极性分类的吸引作用或排斥作用的程度是任意的，所以，经本发明具体考虑的氨基酸被分为这一类或那类。大多数没有被特别命名的氨基酸可根据其已知性能进行分类。
氨基酸残基还可以进一步进行亚分类，如环形或非环形、芳香族或非芳香族、根据残基的侧链基团的自定义分类、和大型或小型。如果残基总共含有包括羧基碳在内的4个碳原子，可将其认为是小型的。当然，小型残基总是非芳香族的。
对于天然存在的蛋白质氨基酸，根据前文所述的亚分类如下：
酸性：天冬氨酸和谷氨酸；
碱性/非环形：精氨酸，赖氨酸；
碱性/环形：组氨酸；
中性/极性/小型：甘氨酸，丝氨酸，半胱氨酸；
中性/非极性/小型：丙氨酸；
中性/极性/大型/非芳香族：苏氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；
中性/极性/大型/芳香族：酪氨酸；
中性/非极性/大型/非芳香族：缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸；
中性/非极性/大型/芳香族：苯丙氨酸，色氨酸。
虽然，由基因编码的次级氨基酸脯氨酸在技术上可归入中性/非极性/环形和非芳香这一族，但因为其已知的对肽链的二级构相的作用而成为特例，所以不归入这一类。
某些常见的不由基因编码的氨基酸，包括，例如，β-丙氨酸(β-Ala)，或其它如3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸(2，3-diaP)、4-氨基丁酸等ω-氨基酸，α-氨基异丁酸(Aib)，肌氨酸(Sar)，鸟氨酸(Orn)，瓜氨酸(Cit)，叔丁胺(t-BuA)，叔丁基甘氨酸(t-BuG)，N-甲基异亮氨酸(N-MeIle)，苯基甘氨酸(Phg)，和环己基丙氨酸(Cha)，正亮氨酸(Nle)，磺基丙氨酸(Cya)，2-萘基丙氨酸(2-Nal)；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；和甲硫氨酸亚砜(MSO)。这些也可被方便地归入特定的类别。
根据前文的定义，
Sar，β-Ala，2，3-diaP，和Aib属于中性/非极性/小型类；
t-BuA，t-BuG，N-MeIle，Nle，Mvl，和Cha属于中性/非极性/大型/非芳香族类；
Orn属于碱性/非环形类；
Cya属于酸性类；
Cit，乙酰基赖氨酸，和MSO属于中性/极性/大型/非芳香族类；
Phg，Nal，Thi和Tic属于中性/非极性/大型/芳香族类；
各种ω-氨基酸被根据大小分为中性/非极性/小型(β-Ala，即，3-氨基丙酸，4-氨基丁酸)或中性/非极性/大型(其它全部)。
编码在基因中其它的氨基酸的取代物也可以被包含在本发明范围内的肽类化合物中并根据它们的结构在此一般的计划中分类。
本发明所有化合物，当C-端由一个氨基酸构成时，可能是药用盐或酯的形式。盐可能是，例如，Na+，K+，Ca+2，Mg+2等；酯通常是与1-6碳醇形成的酯。
在所有本发明的肽中，一个或多个酰胺键(-CO-NH-)可任选地被另一种键诸如-CH2NH-，-CH2S-，-CH2CH2-，-CH＝CH-(顺式或反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-和-CH2SO-之类的其电子等排物替代。这种替换可利用本领域的已知方法来进行。以下参考文献描述了含有这些替换连接部分的肽类似物的制备：Spatola，A.F.，VegaData(三月，1983)，Vol.1，第3期，“肽骨架的修饰作用”(综述)；Spatola，A.F.，“氨基酸肽和蛋白质的化学和生物化学”中，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)(综述)；Morley，J.S.，Trends Pharm Sci(1980)pp.463-468(综述)；Hudson，D.等，Int J Pept Prot Res(1979)14：177-185(-CH2NH-，-CH2CH2-)；Spatola，A.F.等，Life Sci(1986)38：1243-1249(-CH2S-)；Hann，M.M.，J Chem Soc Perkin Trans I(1982)307-314(-CH＝CH-，顺式或反式)；Almquist，R.G.等，J Med Chem(1980)23：1392-1398(-COCH2-)；Jennings-White，C.等，TetrahedronLett(1982)23：2533(-COCH2-)；Szelke，M.等，欧洲专利申请EP45665(1982)CA：97：39405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay，M.W.等，Tetrahedron Lett(1983)24：4401-4404(-CH(OH)CH2-)；和Hruby，V.J.，Life Sci(1982)31：189-199(-CH2S-)。A.活化剂
本发明的活化剂包含了具有以下结构式的一系列肽：
(1)
AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Z
其中，AA1是一个小型氨基酸或苏氨酸；
AA2和AA3各自分别为中性/非极性/大型/非芳香族氨基酸；
AA4是小型氨基酸；
AA5是碱性氨基酸；
AA6可有可无，如果存在时，它是一个中性/非极性/大型/非芳香族氨基酸；
当AA6缺失时AA7也缺失，当AA6存在时则可有可无，它是一个酸性氨基酸；
Z是一个不干扰活化活性的取代基。
结构式1所示的肽可在C-端(而非N-端)被构成一个无干扰取代基的附加氨基酸序列延伸(被表示为包含在Z内)。
在结构式1所示的肽的C-端，羧基可以是非衍生型的或是被酰胺化的或是一个酯；在非衍生型中，羧基可以是游离酸或某种盐，最好是某种药用盐。
如果C-端被酰胺化了，与C-端的羰基碳共价结合的酰胺基团的N原子将是NR′R′形式的，其中的每个R′各自分别为氢原子或一个1-6C的直链或分支链烷基，这类烷基是1-6C的直链或分支链饱合烃基残基，诸如甲基，乙基，异戊基，正己基等。此类酰胺基的代表为：-NH2，-NHCH3，-N(CH3)2，-NHCH2CH3，-NHCH2(CH3)2，和-NHCH2CH(CH3)CH2CH3等等。而且，两个R′之一或全部可再次被一个或多个例如-OR′，-NR′R′，卤原子，-NR′CNR′NR′R′等取代基所取代，其中的R′的定义分别如前文所述。由此，Z可能是-OH，或其酯(OR′)或盐形式，或-NR′R′，其中R′的定义如前文所述。
AA1的优选具体例是Ser或2，3-二氨基丙酸(2，3-diaP)。AA2和AA3的优选具体例是Val、Ile、Cha和Leu。结构式1所示化合物的其余残基的优选具体例为：AA4是Gly，AA5是lys、Arg或Har，AA6，如果存在的话，是Val、Ile、Cha或Leu，而AA7，如果存在的话，是Asp或Glu。特别优选的结构式1所示的化合物选自：SLIGR-LETQPPIT，SLIGRLETQPPI，SLIGRLETQPP，SLIGRLETQP，SLIGRLETQ，SLIGRLET，SLIGRLE，SLIGRL，SLIGR，SLL-GKVDGTSHVT，SLLGKVDGTSHV，SLLGKVDGTSH，SLL-GKVDGTS，SLLGKVDGT，SLLGKVDG，SLLGKVD，SLLGKV，SLLGK，S(Cha)IGR，S(Cha)LGK，(2，3-diaP)-IGR，(2，3-diaP)LLGK，SLLGKR-NH2，SLIGRR-NH2，S(Cha)LGKK-NH2，S(Cha)IGRK-NH2，(2，3-diaP)-LIGRK-NH2，(2，3-diaP)-LLGKK-NH2和它们的酰胺化形式。B.颉颃剂
本发明的干扰由C140受体介导的活性的颉颃剂包括缺少N-端丝氨酸残基的被修饰的活化肽；和能与C140受体上的各种关键位置起免疫反应的抗体。
肽类颉颃剂
活化剂的第一个基团被修饰而形成的颉颃剂可有以下结构式表示：
X-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-Z
其中，X是一个除ser，ala，thr，cys，2，3-diaP或gly以外的氨基酸残基或是一个经脱氨基或烷化或酰化的氨基酸，
AA2和AA3各自分别为中性/非极性/大型/非芳香族氨基酸；
AA4是小型氨基酸；
AA5是碱性氨基酸；
AA6可有可无，如果存在时，它是一个中性/非极性/大型/非芳香族氨基酸；
当AA6缺失时AA7也缺失，当AA6存在时则可有可无，它是一个酸性氨基酸；
Z是一个不干扰活化剂活性的取代基。
优选的酰基基团如结构式RCO-所示，其中R代表一个1-6C的直链或支链烷基。特别优选的是乙酰基。
X的优选具体例包括以下氨基酸的残基：3-巯基丙酸(Mpr)，3-巯基戊酸(Mvl)，2-巯基苯甲酸(Mba)和S-甲基-3-巯基丙酸(SMeMpr)。AA2至AA7的优选具体例如前文活化剂中所述；Z也如前文所述。
特别优选的此类颉颃剂选自Mpr-LLGK，Mpr-LIGR，Mpr-(Cha)LKG，Mpr-(Cha)IGR，Mpr-LLGKK-NH2，Mpr-LIGRK-NH2，Mpr-LIGRKETQP-NH2，Mpr-LLGKKDGTS-NH2，(正戊基)2-N-Leu-Ile-Gly-Arg-Lys-NH2和(甲基-N-(正戊基)-Leu-Ile-Gly-Arg-Lys-NH2。
抗体
可与C140受体的关键位置发生免疫反应的抗体颉颃剂可通过用含有作为抗原区的C140受体的计划用做抗体的靶位置的肽对合适的哺乳动物进行免疫来获得。关键区包括蛋白水解切割区，对活化作用非常关键的胞外片段(该片段包括了切割位点)和构成胞外环的那部分序列，尤其是与被激活的受体胞外区域的N-端相互反应的区域。本发明的活化剂肽可在此处用作免疫原。
所以，含有蛋白水解区，即，例如SKGRSLIGRLET，胞外环，例如 ISYHLHGNNWVYGEALC； QTIYIPAL-NITTCHDVLPEEVLVGDMFNYFL；和HYFLIK-TQRQSHVYA。下文描述的活化剂肽也可用作免疫原。
抗体是通过单独利用足够长的肽类半抗原，或在希望或要求增强免疫原性时将其与合适的载体结合后用适当的免疫程序对合适的哺乳类宿主进行免疫来制备的。利用BSA，KLH或其它载体蛋白等载体来制备免疫原性结合物的方法是本行业所熟知的。在有些情况下，可利用例如碳化二亚胺试剂进行直接结合；在另一些情况下，则需要使用如Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，提供的那些连接剂以获得对半抗原的易接近性。半抗原肽可以通过，例如，在氨基或羧基端延伸一个Cys残基或在内部间以半胱氨酸残基以帮助其与载体的连接。正如本行业所周知的，免疫原的注入通常是通过使用合适助剂的在一段合适的时间内的注射。在免疫过程中，对抗体的效价进行确定足够的抗体产生。
虽然如此生产的多克隆抗血清可能满足了某些应用，但对药物组合物来说优选的是单克隆制剂。正如普遍已知的，可利用Kohler和Mistein标准法或对淋巴细胞或脾脏细胞进行无限繁殖化作用的改进法来制备分泌所需的单克隆抗体的无限繁殖细胞系。可通过免疫分析来筛选分泌所需抗体的无限繁殖细胞系，其中的抗原是表达于重组宿主细胞上的肽类半抗原或C140受体本身。在分泌所需抗体的合适的无限繁殖细胞株被鉴定出来后，或将这些细胞体外培养或用腹水培养。
然后从培养物上清液或腹水上清液中回收所需抗体。含有免疫活性区的单克隆片段或多克隆抗血清可以和完整抗体一样用作颉颃剂。常常优选使用诸如F(ab′)2的Fab、Fab′片段的免疫活性片段，特别是在治疗过程中，因为这些片段的免疫原性通常小于完整的免疫球蛋白。
还可以通过重组方法利用现有技术来制备抗体或片段。用多种来源的嵌合体也可以产生与所希望的受体的区域特异性结合的区域。
这样产生的抗体不仅可用作受体的潜在颉颃剂，在本发明的测试中起着颉颃剂的作用，而且可用于免疫分析法检测激活的受体。因此，这些抗体可与显影剂偶联后用于某主体以检测定位抗体，从而确定活化的或非活化的C140受体的位置。另外，这些反应剂可用于体外检测，例如，分布在重组宿主细胞表面的C140受体的成功产生。肽类活化剂和颉颃剂的制备
可以利用本专业所已知的标准固相(或溶液相)肽合成法来制备本发明的肽类活化剂和颉颃剂，另外，还可以利用市售的寡核苷酸合成仪来合成及利用标准重组体生产系统来重组产生编码这些肽的DNA。如果欲将非基因编码蛋白包括在内，则必须使用固相肽合成法生产。用于检测的C140受体的重组体产生法
本发明提供了用于产生在重组细胞表面显示的C140受体的重组材料。使用这些重组体方法生产受体提供了一种检测待检药物与C140受体结合，将其激活或对其产生颉颃作用的能力的有用试剂。对这些特性的检测在评价欲使之与其它相关受体结合的药物的特异性方面十分重要。
为了进行这一重组体生产，需通过如下文将述的回收天然序列，或利用已知的天然序列的主要部分作为探针制备或利用标准法全合成一段前文图1和2中所示的编码该C140受体的DNA序列，或它们的基本对等物或它们的简并类似物。将这段DNA与所需宿主相适的载体连接并转化入相容性细胞。在有利于C140受体基因表达的条件下进行细胞的培养，并收集在其表面表达了受体的细胞用于检测。
宿主细胞通常是动物细胞，最常用的是哺乳动物细胞。为了可用于检测，这些细胞必须具有可使受体以大致如图4所示的构型显示于细胞表面的胞内机制。如果检测使用对激活的受体起细胞反应作为检测方法，细胞还必须包含一个对受体的激活产生反应的连接了G-蛋白的机制。大多数哺乳动物和其它动物细胞具备了这些条件。
对本发明方法而言特别有用的细胞是Xenopus lavis蛙卵母细胞，它们通常使用cRNA，而不是由编码所需蛋白的DNA开始的标准重组体表达系统。通常由含有编码受体的DNA序列的线性化了的载体来产生加帽RNA。使用RNA聚合酶和标准试剂来进行该反应。通常利用使用乙醇的苯酚/氯仿沉淀法来回收cRNA并将其注射入卵母细胞。
然后对表达编码C140受体的DNA的动物宿主细胞或注射了cRNA的卵母细胞进行培养使之进行编码核酸的表达以产生以类似于图4所示的方式显示于其表面的C140受体。然后将这些细胞直接用于估计待检药物与受体的结合，颉颃作用或激活能力的检测。检测
在一种易行检测中，可试验待检药物与活化剂或已知结合性颉颃剂对与受体结合的竞争。在一种方法中，竞争性活化剂或颉颃剂可以是被标记过的；已知与受体结合的标记过的物质当然可以是某种合成肽。在一种典型的方法中，提供不同浓度的待检药物，同时，活化剂和颉颃剂的浓度保持不变，并用已知方法来测定标记物与受体结合的抑制。
在一种较复杂的方法中，可如下在重组体表达C140受体的细胞内测定待检化合物对活化剂诱导的反应的影响。受体活化对这些细胞的影响的检测系统包括本文将进一步详细描述的钙动员和电压箝位法。这些检测可估计出待检药物对受体活性的影响而不单是与受体的结合能力。
表达编码C140受体的cRNA的卵母细胞或其它产生C140受体的重组细胞对45Ca的释放中的活化剂诱导的增加可利用已公开的技术(Williams，J.A.等，Proc Natl Acad Sci USA(1988)85：4939-4943)来估计。简要地说，在含有50μCi45CaCl2(10-40mCi/mg-Ca；Amersham)的300μl不含钙的改进型Barth′s溶液(NBSH)中将30个卵母细胞一群的细胞群室温孵化4小时来标记胞内钙库。洗涤标记后的卵母细胞或其它细胞，然后将其在不含抗菌素的MBSHII中孵化90分钟。挑选5个一群的卵母细胞分别置于含有0.5ml/穴的不含抗菌素的MBSH II的24穴的组织培养板(Falcon 3047)的各穴中。每隔10分钟除去并换以新鲜的培养基；用闪烁计数法对收获的培养基进行分析以测定每10分钟的孵育中卵母细胞所释放的45Ca。继续进行10分钟培养，直至获得一单位时间内45Ca释放的稳定基线。获得附加两次的10分钟收集物后加入含有活化剂的测试培养基并测定活化剂诱导的45Ca释放。
使用上述检测法，可直接测定待检药物激活受体的能力。在这种情况中，活化剂被用作对照。另外，通过使用本发明活化剂来激活重组抗体可直接测定待检药物对这种激活作用的影响。在检测中，在含有活化剂和待检化合物和含有活化剂但无化合物的条件下孵育表达编码受体核酸的重组细胞。待检物存在条件下的激活作用的减小将表明某种颉颃作用。反过来，也可以测定待检药物的将本发明的颉颃剂的颉颃作用逆转的能力。
在一种测定钙动员作用的可替代方法中，可使用电压箝位法作为受体活化作用的测定方法。如现有技术所描述，在被电压箝位的编码cRNA的表达C140受体的卵母细胞或表达取自重组体表达系统的DNA的细胞中测定活化剂诱导的向内的氯化物电流，所不同的是，使用的是单电极电压箝位技术。激活的受体的检测
在一个实施例中，可利用重组的C140受体的蛋白生产对激活的受体具有免疫特异性的抗体，然后可将这种抗体用于激活的体的体内诊断性显影。可针对重组体产生的激活的受体或针对本文所述的代表了“新氨基端”肽的肽来生产这些抗体。然后，产生的抗体，或它们的具有免疫特异性的片段，如Fab，Fab′，Fab′2片段与可被已知方法检测的标记物结合，如包括本专业已知的锝99和铟111或其它放射性标记物在内的放射性标记物。体内注射时，这些抗体对激活的受体位点进行寻的，由此可进行含有被激活受体的区域的定位。
在另一个实施例中，可测定体液或培养基中的活化肽的存在。如前文所述制备针对活化肽的抗体，并用标准ELISA或RIA检测例如尿液中的过量活化肽。作为药剂的活化剂和颉颃剂的给药方式
起活化剂作用的本发明的肽以本专业所已知的常规剂型进行系统性给药。可在，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton PA，最新版中找到典型的这类剂型。
肽的系统性给药方式包括注射，通常是静脉内注射。也可以使用诸如皮下、肌内或腹膜内等其它注射途径。最近，发明了肽的系统性给药的替代方式，它包括使用以胆盐或梭链孢酸为例的渗透剂或其它去污剂的透粘膜和透皮给药。另外，如果以合适的方式配入肠道制剂或胶囊制剂中，还可能使用口服给药。这些化合物还可以以药膏、药贴、凝胶等形式局部和/或定位给药。
所需的剂量范围取决于对肽的选择、给药途径、制剂特性、病人情况的特点和护理医师的判断。但是，合适的剂量范围为0.1-100μg/kg病人。但是，由于可用的肽的多样性和各种给药途径的效率的不同，可以预计，在所需的剂量上会有很大不同。例如，可预计口服给药所需的剂量比静脉内注射大。可使用本专业所熟知的以优化为目的的标准经验惯例来对这些剂量水平方面的变化进行调整。
如下文所示，本发明的活化剂表现为抗低血压剂；颉颃剂则具有相反的作用。所以，服用合适的肽可对需要升高或降低血压的病人产生有利的作用。
另外，活化剂具有抗炎和愈伤性能。
现以以下实施例说明本发明但不是限定本发明。
实施例1
编码小鼠C140受体基因的分离
用分别对应于牛K受体的cDNA的bp190-249和742-801的两段以32P标记的寡聚核苷酸(Masu，Y.等，Nature(1987)329：836-838)对小鼠的考斯质粒基因组库(得自Dr.R.A.Wetsel，Washington University School of Mdeicine，St.Louis，Missouri，并被记述在Wetsel，R.A.等，J Biol Chem(1990)265：2435-2440)进行筛选。杂交条件为：5×SSC，5×Denhardt′s，0.1％SDS，0.1mg/ml精子DNA，106cpm/ml标记过的寡聚核苷酸，60℃，过夜，继而在60℃以1×SSC，0.1％SDS洗涤。
在一个分离的菌落(C140)中，杂交区被定位到一个3.7kb的PstI片段。该片段被次级克隆入购得的pBluescript载体。用Sanger链终止法对杂交区和相邻区进行双向测序。图1显示了核苷酸序列和推断的鼠C140受体的氨基酸序列。假定的信号序列(SP)和七个跨膜区被加以上划线，潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点被标以实心箭头，推断的Arg34-Ser35处的蛋白酶受体切割位点被标以空心箭头。
实施例2
编码人C140受体基因的分离
由于可得到编码小鼠的蛋白酶C140受体的基因组DNA所以可对相应的人的基因进行回收。使用小鼠克隆的全编码区作为探针，以完全相同于实施例1的条件对克隆在EMBL3载体上的人基因组库进行筛选。包括DNA序列和推断的氨基酸序列在内的被回收的人基因被显示于图2中。后继试验表明，人的C140受体基因位于第5号染色体长臂上(5q12-5q13)，相同于曾被报道的人抗凝血酶受体基因的所在区域。
另外，由Genome Systems Inc.commercial screening service获得一段1.1kb的DNA片段，使用可产生横跨人C140受体蛋白编码区的350核苷酸的片段的一对引物试验时此1.1kb DNA呈PCR阳性。对一段1.1kb的BamH1片段进行次级克隆和测序，并发现它含有启动子序列的800核苷酸。该启动子缺失一个TATA盒和一个CAAT盒，但富含G和C；具有与许多看家(housekeeping)基因的启动子相同的特性。可鉴定到两个对SP1和AP2具特异性的结合片段。
实施例3
与相关G蛋白受体的比较
如图3所示，推断的人蛋白酶C140受体的氨基酸序列表现出与小鼠的序列的广泛相似性(＞90％)。
图5显示了一段鼠C140受体和相关的G蛋白受体人凝血酶受体之间的氨基酸序列(Coughlin，S.Cell)。假定的信号序列，跨膜区和蛋白酶切割位点被标以标记。
实施例4
小鼠C140的cDNA回收
在λgt10中建立一个取自小鼠胃的cDNA库并用一含有C140基因组DNA的探针进行筛选。分离出一个噬菌体克隆，用EcoRI酶切。将插入片段克隆入pBluescript和pSG5中，并进行测序。
分离出的cDNA长2773个核苷酸，包括16碱基的聚A延伸段；5′RACE只在5′端加上了27个碱基。编码区的表观5′端与基因组DNA的5′端不同；据信，cDNA的5′端是正确的。编码C140受体的小鼠cDNA的完整核苷酸序列和推断的氨基酸序列示于图10。
实施例5
编码人C140的cDNA的回收
使用由实施例2中的基因组克隆设计而得的引物对人的肠癌cDNA库进行PCR，将扩增得的片段克隆入pSG5中，并进行测序。核苷酸序列和推断的氨基酸序列示于图11。如图11所示，在cDNA编码和基因组DNA编码的氨基酸序列中有4个氨基酸的区别。
实施例6
卵母细胞内蛋白酶C140受体的激活
在卵母细胞内产生了天然的和诱变的C140受体，用具有摸拟“新氨基末端”的肽或蛋白水解酶，胰蛋白酶(切割胞外区)将它们激活。通过将由PCR得到的受体基因的编码区克隆入表达载体pSG5来生产天然的受体(Green，S.等，Nucleic Acid Res(1988)16：369)。用Sanger链终止法来测定被克隆的编码区的方向和完整性。在pSG5中利用定位诱变来构建突变受体。由此产生了三种突变受体，丝氨酸-35分别被脯氨酸、精氨酸和组氨酸代替。如前所述验证了这三种突变体的核苷酸序列。
为了生产位于卵母细胞表面的受体，如下生成编码受体的cD-NA。用XbaI酶消化将pSG5C140质粒DNA制成线状，并使用T7RNA聚合酶在体外生成加帽的cRNA(Krieg和Melton，Meth En-zymol(1987)155：397-415)。
利用已公开的技术(Coleman，A.，in Hames，B.D.，和Higgins，S.J.，eds，Transcription and Translation：A Practical Approach，IRL Press，pp.271-302；Williams，J.A.，等，P roc Natl Zcad SciUSA(1988)85：4939-4943)收获并制备取自Xenopus laevis的卵母细胞。为了去除泡状细胞，将卵母细胞在分别含有2mg/ml胶原酶1A和透明质酸酶1S的无钙Barth′s中振动培养1.5小时。然后用常规Barth′s洗涤卵母细胞5次并在含有100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和2.5mM丙酮酸钠的Barth′s培养基中于18℃培养。选取第5期的卵母细胞注射以30nl的cRNA(0.33μg/μl)或纯水，然后用0.25ml培养基，4群/穴在96穴的培养板上进行培养。36小时后，用45Ca(250μCi/ml)孵育卵母细胞。孵育12小时后，洗涤卵母细胞并加入0.2ml培养基，每5分钟更换一次。用闪烁计数法对收获的培养基进行分析。在替换了5次以测定45Ca的基线释放后，加入含活化剂，如SLIGRL的培养基并测定被激发的45Ca的释放。
卵母细胞被注射以编码野生型小鼠C140受体(WT)或三种突变受体35Pro，35Arg和35His的加帽cRNA(ca 10ng)中的任一种。36小时后，注射了cRNA的和作为对照的注射了水的卵母细胞被输入45Ca，12小时后，如前所述测定由肽或胰蛋白酶诱导的45Ca的释放。肽SLIGRL的加量为100μM，而胰蛋白酶的加量为300pM。相同的卵母细胞群在用胰蛋白酶刺激后再用肽刺激。表1所列的数据是三次重复测定得的平均值，表现出了与注以水的卵母细胞相比的增加。
表1
受体 活化剂 45Ca的增加倍数
WT 胰蛋白酶 6.6
35Pro 胰蛋白酶 0
35Arg 胰蛋白酶 0
35His 胰蛋白酶 0
WT SLIGRL 11
35Pro SLIGRL 23
35Arg SLIGRL 15
35His SLIGRL 23
如表1所示，活化肽SLIGRL既能激活野生型受体也能激活突变受体。另一方面，只能通过切除胞外区来起激活作用的胰蛋白酶只能激活野生型的受体。
实施例7
利用不同活化肽对C140受体的激活
在上述检测中，使用在卵母细胞中表达的野生型小鼠C140受体，对浓度为100μM的各种肽进行测定。结果列于表2。
表2
肽 45Ca的增加倍数
SLIGRL 15
SLIGRA 8.5
SLIGAL 0
SLIARL 4.3
SLAGRL 0
SALGRL 0
ALIGRL 1.3
SFFLRW 1.7
“天然”肽SLIGRL最有效；用丙氨酸代替6位的L使活性降低但不丧失。2位和3位较敏感。1位能够耐受以丙氨酸进行的替代但活性降低了10倍；该活化剂的活性与类似的凝血酶受体活化剂SF-FLRW具有大致相同的活性。
实施例8
C140受体在各种组织中的表达
由小鼠的组织制备聚A+RNA，将其溶解于含50％甲酰胺的1.2％琼脂糖凝胶并吸印到Hybond Cextra膜(Amersham)上。斑点与32P标记的与小鼠C140受体的全编码区的“随机引物探针”进行杂交。与探针的杂交在42℃进行48小时，然后顺次洗涤：在20℃的1×SSC、0.1％SDS中洗涤两次，每次5分钟，然后在65℃的1×SSC中洗涤两次，每次20分钟，再在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤两次，每次20分钟。将所得的膜用一增感屏在-80℃放射自显影5天。
图6中的结果表明，肾和小肠组织含有编码C140的mRNA，而脾脏组织中没有。在图6中，每一道含有10μg RNA，A道取自脾脏，B道取自肾，C道取自小肠。
实施例9
C140受体的转录本在小鼠中的表达
使用35S RNA探针原位杂交来对发生阶段的鼠胚胎和成年鼠组织中的C140受体转录本进行定位。在第11.5天，在肠胃道组织中发现了一个强信号；在第14天，探针与鼻咽、肠胃、皮肤中的上皮组织和大血管中的内皮细胞发生了强的杂交作用。在肝和骨瘤组织中也发生了一些杂交，但在肌肉组织和CNS中没有发现。在第17天，骨瘤中的信号消失但另外的上皮组织表现出了杂交作用，包括食管、肾小球、肺、毛囊和表皮。
在新生鼠中，信号被保留至第17天，其它信号被发现存在于胸腺髓质和肾髓质中。成年鼠的胃、肠和结肠粘膜和脾髓、胸腺和肾髓质中有转录本。同样，在CNS、肝、肺或肾上腺中没有信号。图12显示了一个新生小鼠切片中用这些探针进行的杂交结果。
实施例10
C140受体的转录本在人组织中的表达
图13显示了取自人细胞系的全部RNA与人C140受体探针杂交的Northern blot结果。使用了10g总RNA。在取自胃(1道〕，Ca-Co-2细胞(道2)；HT-29细胞(道3)，A198细胞(道5)，5637细胞(道8)；皮肤kdratinocytes(道12)，和HUVEC(道13和14)的RNA发生了杂交。在HuTu80细胞，J82细胞，MCF-7，HeLa或NCI12细胞(道4、6、9和10)中没有检测到杂交作用。
实施例11
C140受体的活化剂的降血压活性的测定
将C140受体SLIGRL以不同的浓度溶于0.2ml缓冲液中后注射入大鼠的股静脉，并测量其动脉压。各种浓度的结果列于图7。
图7中的踪迹显示，即使在浓度仅为0.1mM时，也会出现明显的血压降低；浓度为1mM时，可观察到更大的血压降低。
对用以上活化剂刺激大鼠的股静脉而引起的舒张作用的观察也显示同样的作用结果。二乙眯麻醉过程中用放血法宰杀成年的Sprague-Dawley大鼠，取出股静脉，切除脂肪和结缔组织。将环形的静脉制备物封固在两个L形金属夹具(直径0.2mm)上的器官浴(5ml)中。其中一个金属夹具旋入一台Grass FTO C力位移传感器的一臂。浴液为含有118mMNaCl，4.7mM的KCl，2.5mM的Ca-Cl2，1.2mM的MgSO4，24.8mM的NaHCO3，1.2mM的KH2PO4和5.6mM的葡萄糖的Kreb′s Ringer溶液。用88.5％的氧气和11.5％的CO2连续处理浴液；将温度维持于37℃。在血管中通以CO2来去除内皮。基础张力在7.5-12mN之间。在使用活化剂和对照物之前，制备物至少平衡1小时。
这些测试的结果列于图8a和8b。如图8a所示，通过加入10-5M的活化剂可松弛由3×10-5M的PGF2α诱导的收缩。图8a中的结果是使用仍带有内皮的静脉而获得的。
在图8b中，内皮被去除。在一类似的试验中，由3×10-5M的PGF2α诱导的收缩不能被10-5M的活化剂或10-5M的乙酰胆碱所抵销。
实施例12
血纤维蛋白溶酶和激肽释放酶对重组C140受体的激活作用
图9a和9b分别显示了血纤维蛋白溶酶和激肽释放酶激活注射了C140受体cRNA(空心圆)或作为对照的水(叉)的卵母细胞的能力。图9c显示了胰蛋白酶激活注射了C140受体cRNA(实心圆)或物质K受体cRNA(空心圆)的蛙卵母细胞的能力。胰蛋白酶显然具有对C140受体注射卵母细胞的差别作用。