一种酵母固定化载体和制造方法 一种涉及发酵工艺的酵母载体和制造方法。在酒精和啤酒生产发酵过程中，使用固定化酵母是本世纪七十年代由固定化酶技术发展起来的一项新兴的生物技术。由于固定化酵母可使发酵系统的细胞密度成倍甚至数十倍地增加，而且适于高稀释率下操作，因而可以大幅度提高发酵速度，缩短发酵周期，提高设备生产能力和生产效率，简化生产工序减轻劳动强度，使生产过程更稳定和易于控制，由于上述优点，固定化酵母技术已经成为酒精和啤酒行业发酵技术的重要发展方向，是目前国内外十分活跃的研究领域。固定化酵母技术大致可以分为吸附法和包埋法两大类，吸附法方法简单，对反应器要求不高，载体材料机械强度较高，寿命较长，因而成本较低，但缺点是吸附的细胞量很低，当醪液的环境变化时(如高流速，CO2释放激烈，翻滚剧烈，醪液PH改变时)被吸附的细胞容易脱落，造成活性下降，且易吸附杂菌难以清除，包埋法的优点在于细胞受载体保护不易流失，对恶劣环境抗御能力较强，可进行专业化生产，但其缺点是制作过程较复杂，载体寿命不长，价格较高，且载体易丧失机械强度，堵塞管路，且使成本提高。近十几年来，海藻酸钙包埋法由于具有制作方便固化条件温和，对反应器适应性较强，适于增殖培养等优点，而被重视使用，研究者们又根据它存在的弱点，发明了增殖细胞法和添加某种材料改善凝胶理化性质的方法，增殖细胞法是通过降低包埋细胞的初始浓度使CO2释放变得缓和，因而延缓凝胶崩裂现象，但由于包埋细胞的初始浓度受到限制，而且对凝胶的磷酸盐的稳定，没有明显改善，对于添加辅助材料改善凝胶理化性质的方法，可以使原有的海藻酸钙包埋法得到很大进步，但是，所有这些方法，无法从根本上解决海藻酸钙存在的主要问题。
本发明正是为了解决上述问题而提出来的，它并不是从凝胶本身理化性质方面出发，直接克服海藻酸钙的弱点，而是通过把吸附和包埋两种方法联合起来的办法进行解决，这种在同一过程使用两种方法形成统一的载体，联合固定醇母细胞地技术，给固定化细胞领域引入新的概念，解决长期以来的难题，使固定化细胞的工程得以广泛应用。
本发明提供的发酵过程(主要用于酒精和啤酒发酵过程)酵母固定化载体，是一种吸附了均匀分布的含酵母凝胶的海绵状或纤维状结构材料，其中的酵母细胞是由两种材料同时限制固定。即酵母细胞是被海藻酸钙凝胶和海绵状或纤维状结构材料联合固定而形成的，在发酵过程中这种联合固定化酵母既作为发酵活性主体，同时可用作游离酵母的种源。载体的固定材料之中海绵状或纤维状结构材料可以是开孔海绵橡胶和开孔胶乳海绵或化学纤维材料，如聚乙烯纤维，聚氯乙烯纤维，聚丙烯纤维，聚丙烯睛系纤维，乙烯醇系纤维，聚脂纤维，聚酰胺纤维，弹性纤维，含氟纤维，三乙烯基纤维，变性聚丙烯睛纤维等，上述固定化载体的制造方法是用海绵状或纤维状材料吸取含酵母的海藻酸钙溶液，将该材料浸泡在氯化钙溶液中至少24小时，海藻酸钠交换成为海藻酸钙凝胶，酵母细胞随着凝胶化过程被均匀地固定在氯化钙溶液中，即完成联合固定化过程。海藻酸钠溶液的浓度为1--3％(W/V)，最佳值为2％(W/V)酵母细胞含量为106-108个/毫升，最佳值为108个/毫升，氯化钙溶液的浓度为2-10％(W/V)，该载体用于发酵过程中的用量为酒精发酵为0.5-5％(V/V)，最高用量为30％(V/V)。啤酒发酵用量为5--15％(V/V)，最高为30％(V/V)。
固化过程的具体操作步骤是：用经灭菌处理的海绵状或纤维状载体材料先吸取含酵母的海藻酸钠溶液，将载体材料一块块地不粘连地投入氯化钙溶液中，使海藻酸钠在载体内交换成海藻酸钙凝胶，酵母细胞随凝胶化过程被均匀地固定在统一的载体中，在氯化钙溶液中，载体材料至少浸泡24小时即可完成凝胶化过程浸泡完毕用无菌清水清洗3次，即可投入发酵罐内进行增殖培养，也可以直接投入发酵阶段运转，发酵过程的条件控制与常用的固定化酵母发酵技术基本一致。
本发明与现有技术相比的特点有三个方面：
首先在固定化方法操作过程中，现有技术是海藻酸钠溶解后与酵母细胞悬液混合均匀，然后投入某种辅助材料(如砂粒、聚氯乙烯碎片、硅粒等)使其均匀后一起滴入或注入氯化钙溶液中。换凝胶化，这些方法是以海藻酸钠溶液为操作主体，即操作以液相处理为主，其它材料是辅助性的混合进去，以改善凝胶理化性质，本发明操作过程与上述相反，是以海绵状或纤维状载体块为操作主体，即以固相操作为主，海藻酸钠溶液是被动的被吸取的，主要不是将海藻酸钠和载体一起倾入氯化钙溶液中，而是将吸有海藻酸钠溶液的载体一块块地投入氯化钙溶液中进行交换凝胶化，凝胶被限制在海绵状或纤维状载体结构中，酵母细胞则随凝胶化而被固定，凝胶固定细胞使之不能自由运动，而海绵状或纤维状载体结构把凝胶限制在其内不能散逸，酵母细胞实际上被一种包埋材料和一种吸附材料两种材料同时限制即为联合这两种材料组成为统一载体，即为联合载体固定化。其次，本发明固定化酵母使用形式和使用寿命的维持方式只与作为吸附材料的纤维状或海绵状材料质地性能有关，而与作为包埋材料的海藻酸钙关系不大，一般可以连续使用四年以上，效果不降，而现有技术中的单纯的海藻酸钙凝胶包埋，其载体使用寿命很难超过三个月。本发明的第三个特点是：现有的其它酵母固定化方法是单纯吸附形式或单纯的包埋形式，而本发明是采用联合载体的形式集合了吸附和包埋二者之长，有机结合，海藻酸钙凝胶作包埋材料的优点是固定条件温和，无毒，外部细胞难以进入凝胶内。在联合载体形式中，海藻酸钙凝胶只起菌体包埋固定作用而海绵状和纤维状物体承担外形支持，机械强度，和使用寿命的维持，在使用过程中，可以避免海藻酸钙凝胶的致命弱点，即因CO2释放激烈而崩解，和因磷酸盐不稳定性而丧失机械强度，海藻酸钙凝胶受到海绵块或纤维状材料的保护和支持，即使崩裂和丧失机械强度仍可有效地被吸附载留在海绵状或纤维状物体中继续发挥效用，可以避免单纯吸附法的吸附率不高抗杂菌能力弱的缺点，又可以避免单纯的凝胶包埋法载体寿命短的缺点，而表现出独有的优势。另外，本发明涉及的载体在发酵中迁到杂菌污染，机械故障，或水电受阻对载体清洗除杂菌及活化等工作比现有技术更方便。
本发明与现有技术相比的突出效果，在4×7.5M3规模的试验车间试验和日产24吨酒精的大生产车间试产，结果可以体现对比表示如下：
4×7.5M3试验车间试验结果： 载体固定化形式发酵缸总容积M3 联合固定化 凝胶珠包埋 4×7.5 4×7.5载体投放量％V/V 8 30发酵时间br 12 8乙醇生产，能力克乙醇/升缸小时克乙醇/升，载体小时 6.21 62.1 8.65 21.5成熟醪酒份％V/V 9.44 8.6转化率％ 93.7 90.2流加形式单浓，批次—连续单浓，批次—连续运转天数(天) 120 15固化醇母投入成本(元) 5690 24740
结果表明，单纯凝胶包埋使用15天后活性已开始下降，而联合固化使用120天后仍能保持活性不降。
日产24吨酒精大生产车间试产结果如下表： 联合固定化酶 常规游离酵母发酵罐总容积(M3 500 500载体投放量％V/V 0.4 ---发酵时间(小时) 32--34 46--48流加形式 双浓连续 双浓连续平均日产量(吨酒精) 24.68 21.27全期产量(吨酒精) 3136 2702运转天数(天) 150 150原料单耗吨糖密/吨酒精 4.023 4.198
结果表明，虽然联合固定化酵母投放量仅为的0.4％但却能提高生产能力，16％缩短时间30％，同时降低了原料单耗据统计全期成熟醪酒份平均提高0.48％(V/V)，设备利用率提高30--35％，增加产值150万元，增加税利54万元，而联合固化酵母的成本投入仅为7万元，效益十分显著。
实施例1
联合固定化酵母发酵甘蔗稀糖密快速生产酒精。
一、材料：
1)菌种：
AS2.1190酵母菌株，由中科院微生物所供应。
海藻酸钠，福建厦门冷冻厂生产食用级。
2)海绵：30×30×30正方体
3)氯化钙：化学纯
4)油酸：化学纯
5)吐温80：化学纯
6)培养基：1)试管斜面固体培养基，常用米曲汁培养基
2)三角瓶液体培养基：酵母浸出汁0.3％，尿素0.3％
蔗糖10％，磷酸二氢钾0.2％，碳酸镁0.051％，PE：
4.5--5.0用硫酸调节，灭菌1公斤/cm330分钟。
3)增值液体培养基用三角瓶液体培养基
4)发酵稀糖密：55B力酸化6小时，稀释24--26B力含
糖17％左右(普通甘蔗糖厂付产品)磷酸二氢钾
0.5％，尿素0.025％，硫酸镁0.02％。
7)发酵反应器：120×450标本瓶，内装不锈钢阻隔网(用于把载体限制在发酵醪液面以下，确保其作用)
8)仪器设备常用微生物培养基和化学分析仪器设备有：电炉、恒温培养箱、摇床、显微镜等。
二、方法
(一)包埋固化母液的配制：
菌液培养：取试管斜面母种一支，转管一批试管斜面生产种30℃恒温培养24小时，取培养好试管生产种一支，接种入500毫升三角瓶(内含300ml液体培养)30℃旋转振荡培养(转速为60--80转/分)约24小时即成熟备用。并取样检查酵母生长情况，要求含酵母1.2--1.5亿个/毫升，出芽率20--30％，无杂菌污染即可使用。
母液配制：称取海藻酸钠20克，用无菌水500毫升溶解完全后，加入菌液250ml，10毫升，油酸和5毫升，吐温80，搅拌均匀后，加入无菌水至容积1000毫升，充分搅拌均匀即成包埋固化母液，各种材料的使用浓度为：海藻酸钠2％，酵母菌悬液25％
吐温80 0.5％
油酸 1.0％
(二)联合固定酵母
交换液的配制：称取氯化钙200克，用无菌水溶解，定容至2000毫升，配成10％浓度氯化钙溶液。
海绵块的准备：取30×30×30mm3/块规格的海绵块20块，用自来水清洗3次，脱水干燥后105℃下蒸汽灭菌30分钟，无菌条件下冷却至室温并脱去残留水分备用。
联合固定化：在无菌操作下，将处理好的海绵块，一块一块地吸取包埋母液至饱和状态，然后小心投入交换液中，必须使海绵块浸于液面之下，全部海绵块操作完毕后，在交换液中继续浸泡约24小时后，海绵中的海藻酸钙凝胶，酵母细胞受到凝胶和海绵块的双重固定，浸泡交换完毕后，取出海绵块，用无菌水清洗3次，即可用于发酵过程，亦可用2％氯化钙溶液，常温下保存一个月活性良好。活性载体按1∶1体积生理盐水浸泡常温下保存15天，4℃下保存二个月至半年。
联合固定化酵母适用于各种反应器和不同的工艺要求，进行发酵工艺。
实施例2
联合固定化酵母发酵12°麦芽汁快速生产啤酒。
一、材料
1)菌种：M1G2.101酵母菌株，广东省微生物研究所菌种保藏中心保存。
2)海藻酸钠：青岛市生产，食用级。
3)聚丙烯化纤球：规格为25，1克/个专门制造。
4)氯化钙：广东台山市化工厂生产，化学纯。
5)培养基：斜面固体培养基：常用麦芽汁培养基
三角瓶液体培养基：麦汁培养基
发酵：含增殖培养基，12°麦汁加酒花由啤酒厂提供。
前酵反应器：
1)前酵反应器：3000ml三角瓶，内设不锈钢限制网用以限制载体于液面以下，以载体靠近瓶底为宜，用棉纱塞外包锡纸封口。
2)后酵反应器：2000ml抽滤瓶多个，内设不锈钢限制网，瓶口密封，抽滤管口用液柱保持瓶内正压。
二、方法：联合固定化酵母的制备
(一)包埋母液的配制：
菌体培养：取试管斜面母种一支转管一批试管斜面生产种，25℃下恒温培养24小时，取培养生产良好的试管生产种一支，接种入500毫升三角瓶(内含300毫升麦汁培养基)20℃旋转振荡培养(60--80转/分)约24小时，即成熟备用。
母液的配制：称取海藻酸钠20克，用50毫升无菌水溶解后，加入培养成熟的酵母菌液250毫升，充分搅拌，均匀即成包埋固化母液，其中海藻酸钠浓度为2％，酵母菌液为25％。
(二)联合固定酵母：
交换液的配制：称取氯化钙100克，用无菌水溶解定容至2000毫升，使之成为5％氯化钙溶液。
化纤球的准备：取50个化纤球，用自来水煮沸清洗，再用蒸馏水清洗一次，脱水后105℃灭菌60分钟，取出冷却至常温，脱去残留水份。
联合固定：
在严格无菌操作下，将处理好的化纤球一个一个地吸取母液，至饱和状态，小心投入交换液中，必须使化纤球整个浸于液面以下，全部化纤球操作完毕后，在交换液中继续浸泡24小时，使化纤球内的海藻酸钠全部交换成海藻酸钙凝胶，浸泡交换结束后，取出载体用无菌水清洗2次，再用无菌水浸泡30分钟，并重复两次，使残留Na+，Ca+等全部清除，整个固化过程要求环境温度不高于l5℃，联合固定化完成后，载体可直接投入发酵阶段亦可用稀麦汁在0--2℃下保存一至三个月再使用。
用这种特制的化纤球制成的联合固定化酵母载体，发酵，从各方面都优于海绵载体的性能。
实施例3
联合固定化酵母淀粉水解糖快速生产酒精
一、材料：
1)菌种：MIG2.44(南阳1308)酵母菌株．广东省微生物研究所供
2)海藻酸钠：福建省厦门冷冻厂生产食用级
3)聚氯乙烯纤维块：逢松状150×50×10mm3片长方体专门订造
4)氯化钙：广东省台山市化工厂生产，化学纯
5)油酸：吐温8O广州化学试剂厂生产化学纯
6)培养基：试管斜面固体培养基：米汁琼脂培养基，
三角瓶液体培养基：酵母膏，葡萄糖培养基，
增殖液体培养基：同实例2
发酵培养基：木茨淀粉糖化醪，酒精厂提供，糖化
1--2小时，冷却至28--30℃营养盐量同常规法。7)发酵反应器：7.51小型发酵缸，内设载体阻隔网8)仪器设备：常用微生物培养和化学分析仪器设备二、方法：1)包埋固化母液的制备(同实施例一)
2)联合固定酵母：
交换液的配制：(同例一)
纤维块的准备：取纤维块10块，用自来水清洗干净，脱水后，105℃下蒸汽灭菌30分钟，无菌条件下，冷却至室温并脱去残留水分，备用。
联合固定化：在无菌操作下，将准备好的纤维块一块一块地吸取包埋母液，然后小心投入交换液中，必须使纤维块全部浸于液面之下，全部纤维块操作完毕后，在交换液中继续浸泡24小时，纤维块中的海藻酸钠全部交换成海藻酸钙凝胶，其中酵母细胞受到凝胶和纤维块结构的双重固定，浸泡交换完毕后，取出海绵块用无菌水清洗3次，即可用于发酵过程亦可用2％氯化钙溶液常温下浸泡，保存一个月活性良好。
这种联合固定化酵母载体，可用于发酵工艺中。