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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810854620.X (22)申请日 2018.07.30 (71)申请人 云南农业大学 地址 650201 云南省昆明市北郊黑龙潭 申请人 昆明伟牧得生物科技有限公司 (72)发明人 宋春莲 舒相华 刘永波 凌万旭 朱福春 白华毅 李文贵 张雪 高云梅 (74)专利代理机构 昆明正原专利商标代理有限 公司 53100 代理人 陈左 (51)Int.Cl. A61K 31/715(2006.01) A61P 37/04(2006.01) C08B 37/00(2006.0。
2、1) (54)发明名称 黄芩多糖在制备兽药中的应用 (57)摘要 本发明公开一种黄芩多糖在制备兽药中的 应用， 黄芩多糖用于制备增强动物机体免疫功能 的兽药中的添加剂， 所述黄芩多糖从黄芩植物中 提取制备得到， 所述黄芩多糖在兽药中的药物浓 度为31.25g/mL-4mg/mL； 所得黄芩多糖在猪淋 巴细胞转化实验中显示对淋巴细胞的转化有促 进作用， 对致免疫力低下大鼠血清中总蛋白 （TP） 、 血清白蛋白 （ALB） 、 血清球蛋白 （GLOB） 、 淋 巴细胞、 单核细胞含量有提高效果， 使大鼠身体 状况得到恢复， 表明黄芩多糖具有显著增强动物 机体免疫功能的效果， 可用作增强动物机体免疫。
3、 功能的兽药中。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 108619165 A 2018.10.09 CN 108619165 A 1.一种黄芩多糖在制备兽药中的应用， 其特征在于， 黄芩多糖用于制备增强动物机体 免疫功能的兽药中的药物添加剂， 所述黄芩多糖从黄芩植物中提取得到， 所述黄芩多糖在 兽药中的药物浓度为31.25 g/mL -4mg/mL。 2.如权利要求1所述的黄芩多糖在制备兽药中的应用， 其特征在于， 所述的黄芩多糖通 过如下步骤提取得到： （1） 取植物黄芩的干燥根粉碎后过20目筛， 得到黄芩粉； （2） 取黄芩粉， 按料液质量比1: （35-45） 加入蒸馏水， 在5。
4、5-65水浴及超声波功率280- 320W条件下提取10-20min； （3） 上一步骤得到的药液在75-85热水中浸提1h， 冷却后抽滤得到浓缩液， 在浓缩液 中加入浓度为95%的乙醇， 使浓缩液中乙醇含量达到80%， 于4低温环境条件下静置过夜； （4） 1500r/min离心机中分离沉淀和上清液， 收集沉淀于60条件下烘干， 得到纯度含 量为36-38%的黄芩多糖。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108619165 A 2 黄芩多糖在制备兽药中的应用 技术领域 0001 本发明属于动物医学中兽药制备技术领域， 具体来说是一种黄芩多糖在制备兽药 中的应用。 背景技术 0002 。
5、进入2l世纪， 我国畜牧养殖行业逐渐集约化和规模化， 人们对于动物源食品安全 的要求越来越大， 中兽药有望成为保障动物源食品安全和防治动物疾病的重要物质， 从传 统中兽药里提取有效成分制备兽药， 已经成为近年来研究的热点问题。 现代分子生物学、 物 理学和植物化学在最近几十年取得了飞速的发展， 对中兽药有效成分的分析和提取技术和 方法都有了长足的进步， 高效液相色谱仪、 质谱仪、 紫外分光光度计、 液质联用、 核磁共振和 DNA分子标记等技术已被广泛应用于中兽药的研究， 为现代中兽药的发展发挥了重要的作 用。 以多糖类、 多酚类、 黄酮类、 皂苷类、 生物碱类等提取物中的一种或多种为主要有效成。
6、分 的中兽药在近年来防治动物疾病中起到了越来越重要的作用。 对这些中药有效成分的提取 和药理试验是近年来中兽药研发的中心环节。 其中中药多糖类已被开发为很多种重要的免 疫调节药物。 0003 植物多糖是指自然界中普遍存在的由许多相同或者不同的单糖 -或者 -糖苷键 组成的化合物。 天然植物多糖广泛地存在于植物体内， 具有多种生物活性， 有调节机体免 疫、 抗肿瘤、 抗菌、 抗病毒、 促进动物生长等作用， 在临床上和畜牧业中具有广阔的应用前 景。 0004 黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根， 为常用中药， 含有多糖、 黄酮、 挥发油等多种成 分， 具有抗氧化、 清除自由基、 抗炎、 抗肿瘤、 阻止钙。
7、离子通道、 抗病毒、 抗过敏等多种药理作 用。 在中医临床上主要用于湿温、 暑温胸闷呕恶、 湿热痞满、 泻痢、 黄疸、 肺热咳嗽、 痈肿疮毒 等病症。 目前黄芩在动物治疗中的应用较少， 本申请提出之前， 黄芩多糖在制备兽药的药物 原料中作为添加剂的应用尚未见相关报道。 0005 免疫细胞产生的细胞因子和免疫球蛋白是免疫细胞相互作用的重要信号及物质 基础， 在机体细胞免疫和体液免疫调控中发挥重要作用。 免疫细胞种类多， 分布广泛。 血液 中的成熟免疫细胞俗称白细胞， 主要由单个核细胞构成， 包括单核细胞、 淋巴细胞和粒细 胞。 淋巴细胞包括T、 B淋巴细胞， 是最主要的免疫细胞， T淋巴细胞参与。
8、细胞免疫， B淋巴细胞 参与体液免疫。 0006 环磷酰胺常用于抗肿瘤的治疗， 其最大的副作用就是免疫抑制， 尤其是对体液免 疫的抑制， 所以， 环磷酰胺常用于免疫抑制模型的建立。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种黄芩多糖在制备兽药中增强动物机体免疫功能方面 的应用， 提高了黄芩的利用价值， 对促进中兽药的发展和动物源食品安全具有积极意义， 为 兽药开发提供新的原料资源。 说 明 书 1/4 页 3 CN 108619165 A 3 0008 本发明通过如下技术方案予以实现： 一种黄芩多糖在制备兽药中的应用， 黄芩多 糖用于制备增强动物机体免疫功能的兽药中的药物添加剂， 所述黄芩多。
9、糖从黄芩植物中提 取得到， 所述黄芩多糖在兽药中的药物浓度为31.25 g/mL -4mg/mL。 0009 所述的黄芩多糖通过如下步骤制备： （1） 取植物黄芩的干燥根粉碎后过20目筛， 得到黄芩粉； （2） 取黄芩粉， 按料液质量比1: （35-45） 加入蒸馏水， 在55-65水浴及超声波功率280- 320W条件下提取10-20min； （3） 上一步骤得到的提取药液在75-85热水中浸提1h， 冷却后抽滤得到浓缩液， 在浓 缩液中加入浓度为95%的乙醇， 使浓缩液中乙醇含量达到80%， 于4低温环境条件下静置过 夜； （4） 1500r/min离心机中分离沉淀和上清液， 收集沉淀于6。
10、0条件下烘干， 得到纯度含 量为36-38%的黄芩多糖， 提取率为44.7%。 0010 上述方案中， 所得黄芩多糖在猪淋巴细胞转化试验中显示具有提高机体免疫功能 的效果。 0011 上述方案中， 所得黄芩多糖在提高大鼠免疫力检测实验中体现出具有显著增强动 物机体免疫功能的效果。 0012 上述方案中， 所得黄芩多糖用途之一是作为一种中兽药原料， 用于增强动物机体 免疫功能， 抵抗细菌和病毒的侵害。 0013 本发明的有益效果是： 1.黄芩多糖提取工艺简单， 所得多糖活性好， 材料易得， 开发成兽药使用安全方便。 0014 2.猪淋巴细胞转化实验和提高大鼠免疫力检测实验显示所述的黄芩多糖具有显。
11、 著增强动物机体免疫功能的效果， 拓展中药黄芩的用途。 0015 3.为增强动物机体免疫功能提供新的药物原料资源， 具有原料来源广、 提高免疫 力显著、 使用安全等优点。 附图说明 0016 图1为黄芩多糖对大鼠血清总蛋白含量的影响示意图。 0017 图2为黄芩多糖对大鼠血清白蛋白含量的影响示意图。 0018 图3为黄芩多糖对大鼠血清球蛋白含量的影响示意图。 0019 图4为黄芩多糖对大鼠淋巴细胞数量的影响示意图。 0020 图5为黄芩多糖对大鼠单核细胞数量的影响示意图。 具体实施方式 0021 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。 0022 本领域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说。
12、明本发明， 而不应视为限定本发 明的范围。 实施例中未注明具体技术或条件者， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件 或者按照产品说明书进行。 所用材料或设备未注明生产厂商者， 均为可以通过购买获得的 常规产品。 0023 实施例1、 黄芩多糖的提取步骤为： 说 明 书 2/4 页 4 CN 108619165 A 4 （1） 取植物黄芩的干燥根粉碎后过20目筛， 得到黄芩粉； （2） 取黄芩粉10g， 加入40mL蒸馏水， 60水浴及超声波功率300W条件下提取15min； （3） 80热水中浸提1h， 冷却后抽滤， 在浓缩液中加入浓度为95%的乙醇， 使浓缩液中乙 醇含量达到80%， 于4低。
13、温环境条件下静置12h； （4） 离心机中1500r/min分离沉淀和上清液， 收集沉淀于60条件下烘干， 得到4.75g纯 度为36.84%的黄芩多糖提取物。 0024 实施例2、 黄芩多糖体外猪淋巴细胞转化实验： （1） 无菌采集猪前腔静脉血20mL， 装进含有肝素钠的抗凝管中。 0025 （2） 将抗凝管中的抗凝血与稀释液按1:1质量比进行稀释， 将稀释液与淋巴细胞分 离液按1:2质量比分装到高压灭菌的离心管中， 控制水平离心机中转速1850r/min， 进行 30min离心。 0026 （3） 吸取中间白色絮状物的淋巴细胞层， 置于干净的高压灭菌离心管中， 加入清洗 液混匀后1500r。
14、/min， 10min离心； 弃掉液体， 加入1mL红细胞裂解液吹打均匀， 静置3min， 加 入清洗液配平后1500r/min， 10min离心； 弃掉液体。 0027 （4） 配置完全培养基： 1640培养基:胎牛血清:双抗比例为89%:10%:1%。 0028 （5） 取450 L淋巴细胞悬液到小离心管中， 加入50 L台盼蓝染色计数。 将细胞悬液 稀释至2105个， 置于二氧化碳培养箱进行培养。 0029 （6） 将实施例1所得黄芩多糖用完全培养基进行溶解， 用微孔滤膜进行过滤， 配制 不同浓度梯度的药物。 0030 （7） 取96孔板， 按不用药物梯度进行加样， 每一浓度梯度为4的重。
15、复， 对照孔设4个 重复， 每孔100 L。 0031 （8） 刀豆蛋白A （ConA） 实验： 分为无细胞组， 加含有20% ConA的完全培养基100 L； 有细胞组， 加含有20% ConA的细胞悬液100 L。 0032 （9） 无刀豆蛋白A （ConA） 实验： 分为无细胞组， 加入完全培养基100 L； 有细胞组， 加 淋巴细胞细胞悬液100 L。 0033 （10） 置于二氧化碳培养箱进行培养42-44h。 避光加5%的MTT溶液每孔20 L， 二氧化 碳培养箱培养4h， 避光加二甲亚砜每孔100 L。 紫外分光光度计570nm处测定OD值。 0034 （11） 计算： 转化率=。
16、 （OD实验组-OD对照组） /OD对照组100%； 结果大于1表示药物 有免疫增强效果。 0035 （12） 结果： 在药物浓度为4mg/mL、 2mg/mL、 1mg/mL、 500 g/mL、 250 g/mL、 125 g/ mL、 62.5 g/mL、 31.25 g/mL时， ConA黄芩多糖对应的转化率为： 1.439、 0.460、 1.941、 1.957、 1.316、 1.294、 1.465、 1.936。 结果表明实施例1所得黄芩多糖具有提高免疫力的效果。 0036 实施例3、 黄芩多糖提高大鼠免疫力检测实验： 将实验大白鼠分为5组， 分别是高剂量组 （200mg/k。
17、g） 、 中剂量组 （100mg/kg） 、 低剂量组 （50mg/kg） 、 对照2组、 空白对照组， 每组6只。 分别对高剂量组、 中剂量组、 低剂量组和对照2 组的每只大白鼠用环磷酰胺 （70mg/kg） 给药， 空白对照组不给药， 连续给药3d， 3d后对老鼠 采血测定免疫指标。 采血后的大白鼠用黄芩多糖按照高、 中、 低不同剂量给药： 高剂量组 200mg/kg， 中剂量组100mg/kg， 低剂量组50mg/kg， 对照2组和空白对照组不给药。 在用药后 3d、 5d、 7d分别对大鼠进行采血测定免疫指标， 结果如图1-5所示， 分别示出大鼠血清总蛋白 说 明 书 3/4 页 5 。
18、CN 108619165 A 5 （TP） 、 大鼠血清白蛋白 （ALB） 、 大鼠血清球蛋白 （GLOB） 、 大鼠淋巴细胞 （LYM） 和大鼠单核细胞 的数量变化情况。 0037 如图1所示， 高剂量组在注射环磷酰胺后TP含量明显降低， 灌喂了黄芩多糖后含量 慢慢回升， 到灌喂了16d后， TP值仍然低于正常值， 中剂量组在灌喂了环磷酰胺后TP值也明 显降低， 且在灌喂了黄芩多糖后8d后TP 值明显提高， 但到灌喂了16d后， TP值仍然低于正常 值： 低剂量组在灌喂了环磷酰胺后TP值也明显降低， 在灌喂了3d的黄芩多糖后死亡： 对照2 组在注射环磷酰胺后TP值明显降低， 且死亡。 003。
19、8 如图2所示， 在注射了环磷酰胺后高剂量组、 中剂量组、 低剂量组、 对照2组的白蛋 白含量明显下降， 高剂量组在灌喂黄芩多糖前3d白蛋白含量仍在降低， 不明显， 在灌喂了黄 芩多糖3d后含量开始升高， 灌喂到16d的时含量仍然低于正常值； 中剂量组在灌喂环磷酰胺 第1d开始， 白蛋白的含量开始升高， 灌喂16d后含量低于正常值； 低剂量组在灌喂黄芩多糖 后无效果， 在灌喂3d后死亡； 对照组2在灌喂环磷酰胺后死亡。 0039 如图3所示， 在灌喂了环磷酰胺后对照组2,低剂量组的球蛋白含量升高， 高剂量 组、 中剂量组的球蛋白含量降低， 但是都不明显， 在灌喂黄芩多糖3d后， 高剂量组、 中。
20、剂量组 的球蛋白含量仍然在降低， 低剂量组含量升高， 在灌喂8d后， 高剂量组的含量仍在降低， 中 剂量组的含量明显升高， 在灌喂16d后， 高剂量组， 中剂量组含量都升高， 接近正常值。 0040 如图4所示， 在注射了环磷酰胺后， 高剂量组、 中剂量组、 低剂量组、 对照组2的淋巴 细胞的数量明显减少， 在灌喂了3d的黄芩多糖后， 数量无明显变化， 在灌喂了8d后， 高剂量 组、 中剂量组淋巴细胞数量明显增多， 高于正常值， 在灌喂了12d后， 淋巴细胞数量又减少， 接近正常值。 0041 如图5所示， 在注射了环磷酰胺后， 高剂量组、 中剂量组、 低剂量组、 对照组2单核细 胞的数量无明。
21、显变化， 在灌喂了3d的黄芩多糖后， 高剂量单核细胞数量减少， 但不明显， 在 灌喂了8d后单核细胞数量增多， 不明显， 在灌喂了16d后单核细胞数量明显减少； 在灌喂了 3d的黄芩多糖后， 中剂量单核细胞数量增多， 但不明显， 在灌喂了8d后单核细胞数量明显增 多， 在灌喂了16d后单核细胞数量无明显变化； 灌喂了黄芩多糖3d后， 低剂量组单核细胞数 量明显减少， 死亡； 对照组2在注射了环磷酰胺后死亡。 0042 结论： 上述结果表明黄芩多糖在灌胃免疫抑制大鼠后， 能快速激活体内的免疫系 统， 达到对机体的保护作用。 0043 以上显示和描述了本发明的基本原理、 主要特征和本发明的优点。 本行业的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由权利要求书及其等效物 界定。 说 明 书 4/4 页 6 CN 108619165 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 7 CN 108619165 A 7 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 8 CN 108619165 A 8 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 9 CN 108619165 A 9 。