用霉实假单胞菌胆甾醇酯酶水解胆甾醇酯的方法 本发明涉及水解胆甾醇酯的方法。更具体地说，本发明涉及可从霉实假单胞菌菌株获得的胆甾醇酯酶的应用。
已经了解属于假单胞菌属的一些菌株具有产生胆甾醇酯酶的性能，另一些菌株具有产生脂肪酶的性能，还有一些菌株可以产生这两种酶。
美国专利4,283,494描述了从产碱假单胞菌获得的脂肪酶可被胆汁盐激活，并具有胆甾醇酯酶活性。
在Smirnov等人的研究中[Smirnov，V.V；Kornyushenko，O.N.；Bioko，O.I.；Kolesiva，E.A.；Govseeva，N.N.；Endt，V.P.；和Kiprianova，E.A.；Mikrobiologicheskii Zhurnal(Kiev)；42(5)，1980，566-570]，对属于假单胞菌属的25种细菌中的共591个菌株合成胞外胆甾醇酯酶的能力进行了研究。仅有铜绿假单胞菌、类产碱假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌和嗜麦牙假单胞菌(占所研究培养物的3.4％)的个体菌株具有胆甾醇酯酶活性。发现致金色假单胞菌(占所研究菌株的100％)、洋葱假单胞菌(占75％)、嗜麦牙假单胞菌(占60％)、荧光假单胞菌(占13.3％)和铜绿假单胞菌具有脂解活性。
从这些研究中可注意到所检测的霉实假单胞菌培养物均不能产生胆甾醇酯酶。
根据本发明现已发现霉实假单胞菌菌株能产生胞外胆甾醇酯酶。另外，令人惊奇地发现具有胆甾醇酯酶活性的酶组分也是具有脂肪酶活性的组分。
从而，本发明涉及可从霉实假单胞菌菌株获得地胆甾醇酯酶的使用，即通过用该种胆甾醇酯酶处理酯来水解胆甾醇酯的方法。本发明的方法特别适用于蛋类的处理、纸浆中树脂的水解工艺、以及水解或合成甾醇或羊毛脂的工艺中。
另外，本发明提供了一种含有可从霉实假单胞菌菌株获得的胆甾醇酯酶的清洁剂组合物。
通过参照附图可进一步说明本发明，其中：
图1显示了用分光光度测定法获得的各种酶的动力学曲线(吸收度对时间)，参见实施例2。
令人惊奇的是，现已发现霉实假单胞菌菌株能够产生具有胆甾醇酯酶活力的酶，并且，具有胆甾醇酯酶活性的酶与具有脂肪酶活性的酶是同一物质，即同一种蛋白质既具有脂肪酶活性又具有胆甾醇酯酶活性。
从而，本发明涉及水解胆甾醇酯的方法，该方法包括用可从霉实假单假菌菌株获得的胆甾醇酯酶处得胆甾醇酯。
在优选的实施方案中，胆甾醇酯酶来自霉实假单胞菌的脂肪酶B(得自日本WAKO Pure Chemical Industries，Ltd.，定货号126—02931，是从霉实假单胞菌菌株22.39B，FERM BP—1051，或其突变菌株或变种获得的)。
在更为优选的实施方案中，胆甾醇酯酶具有本说明书所附序列表SEQ ID No.1表示的N—末端氨基酸序列。
从而应注意到用于本发明方法中的酶既具有胆甾醇酯酶活性又具有脂肪酶活性，该酶可被描述为例如：有胆甾醇酯酶作用的脂肪酶或有脂肪酶作用的胆甾醇酯酶。
用于本发明方法中的胆甾醇酯酶可通过下列步骤获得：在含有碳及氮源和无机盐的适宜的营养培养其中培养霉实假单胞菌胆甾醇酯酶产生菌株，优选霉实假单胞菌22.39B，FERM BP—1051，或其突变菌株或变种，然后回收所需要的酶。
按本说明书中实施例1所述的方法，从上述日本WAKO PureChemicalIndustries Ltd.提供的脂肪酶制剂脂肪酶B126—02931中获得了高度纯化的脂肪酶。通过氨基酸降解，发现这种酶的N—末端氨基酸序列为本说明书所附序列表ID No.1表示的序列。按本说明书实施例2中所述的方法可见这种酶还具有胆甾醇酯酶活性。
也可用重组DNA技术获得本发明方法中所用的胆甾醇酯酶。通过表达具有脂肪酶和胆甾醇酯酶双重活性的蛋白，可达到特殊优越性。可用例如以WO92/05249公开的国际专利申请(作为参考文献并入本发明)中所述的方法获得重组胆甾醇酯酶。
从而，本发明进一步涉及一种水解胆甾醇酯的方法，该方法包括用胆甾醇酯酶处理胆甾醇酯，该酶具有与从霉实假单胞菌FERMBP—1051获得的胆甾醇酯酶相同的免疫化学性质，并具有相当高的胆甾醇酯酶活性。
胆甾醇酯酶和脂肪酶均具有广泛的工业用途。
本发明进一步涉及用可从霉实假单胞菌脂肪酶产生菌株获得的胆甾醇酯酶水解蛋类的方法，即用胆甾醇酯酶处理蛋类的方法。
本发明还进一步涉及在水解纸浆中树脂的过程中使用可从霉实假单胞菌脂肪酶产生菌株获得的胆甾醇酯酶，即，一种处理含树脂的造纸纸浆的方法。在纸浆生产中广泛使用单独的或与温和化学处理相结合的机械制浆法。这些加工方法在PH为4—9的范围内进行，木质成份的化学变化较小。因此，纸浆中含有大量的树脂中的甘油三酯、酯和蜡。
在随后的流程中和/或使用纸浆时残留的树脂会引起一些问题。典型的，结块的树脂在造纸过程中或印刷过程中会引起纸的撕裂并降低纸的质量。已知树脂的疏水部分含有大量的甘油三酯及其它酯。由于水解产物在水溶液系统中更容易除去，因此，最好水解这些酯。
水解纸浆中树脂的方法已公开于例如：国际专利申请号PCT/DK92/00115和PCT/DK92/00137，或国际专利申请号WO92/07138和WO92/13130，并且可基本按照其中所述方法进行水解。
本发明的方法还进一步涉及用可从霉实假单胞菌脂肪酶产生菌株获得的胆甾醇酯酶处理胆甾醇酯来水解或合成甾醇或羊毛脂。这种胆甾醇酯酶还可有利地在皮革生产中用于生皮的脱脂、在羊毛工业中用于羊毛脂的水解，以及用于甾醇/羊毛脂的水解/合成，例如，在妆品中所用的羊毛甾醇。
本发明还提供了一种含有可从霉实假单胞菌脂肪酶产生菌株获得的胆甾醇酯酶的清洁剂组合物，特别是配制成凝胶的清洁剂组合物，即胶体清洁剂，可用于工业上硬质表面的清洗，特别适用于屠宰场或其它食品厂。
具体的胶体清洁剂可按照如Research Disclosure[340，1992年8月，公开号34045(含酶的胶体清洁剂)]中所述的方法获得。
下列实施例将进一步说明本发明，但它们对本发明要求的范围没有任何限制。
实施例1
纯化
将霉实假单胞菌脂肪酶制剂——脂肪酶B 126—02931[由日本WAKO Pure Chemical Industries Ltd.提供，是从霉实假单胞菌菌株22.39B(保藏号FERM MP—1051)得到的，公开于EP—A—0204 284]按下面的方法纯化成均一物质。
用50mM醋酸钠缓冲液在pH6使脂肪酶通过S—葡聚糖阳离子交换剂。脂肪酶不与基质结合。
调节含脂肪酶活性的洗脱液使之适应0.8M醋酸钠，加样于Toyo pearl丁基柱，用0.8M醋酸钠平衡。用0.8M醋酸钠冲洗柱子，直至带包物质消失。用50％乙醇洗脱与基质结合的脂肪酶，透析浓缩并与乙醇分离。
然后在pH7以50mM Tris—醋酸缓冲液用高效Q—葡聚糖阴离子交换剂(Pharmacia)处理脂脂酶，并纯化成均一物质(如SDS—PAGE上所显示)。
用下面的脂肪酶活力测定法所测得的纯化脂肪酶的比活为8000LU/OD280：
用阿拉伯胶作乳化剂来乳化甘油三丁酸酯制备脂肪酶底物。
在pH7用恒定pH法测定脂肪酶活力。一单位脂肪酶活力(LU)被定义为每分钟释放一微摩尔脂肪酸所需的酶量。
N—末端氨基酸的分析
用获得及测定肽序列的标准方法[Findlay&Geisow(Eds)，Protein Sequencing—a practical approach，1989，IRL Press]测定上述脂肪酶/胆甾醇酯酶的N—末端氨基酸序列。
按上述方法纯化脂肪酶/胆甾醇酯酶。在pH6以50mM醋酸钠缓冲液用Superdex 200TM柱处理纯化的脂肪酶/胆甾醇酯酶，以除去Tris缓冲液。
发现N—末端氨基酸序列如下(所附序列表中SEQ ID No：1)：
Ala-Asp-Asn-Tyr-Ala-Ala-Thr-Arg-Tyr-Pro-Ile-Ile-Leu-Val-His-Gly-Leu-Thr-Gly-Thr-Asp-Lys-Tyr-Ala-Gly-Val-Leu-
实施例2
胆甾醇酯酶活力的测定
进行了胆甾醇酯酶活性的酶法分析，测定了一些脂肪酶的胆甾醇酯酶活力。
该分析是基于下面三个连续反应：
1)
2)
3)
涉及的酶：
(1)胆甾醇酯酶(待测)
(2)胆甾醇氧化酶
(3)过氧化物酶
4—氨基安替比林的氧化还原反应会引起500nm处吸收度的变化[消光系数(E)为6.89]。
条件与试剂：
pH 7.0
温度(T)：37℃
缓冲液：0.4MKH2PO4；pH7.0；37℃(54.4mg/ml)，
底物：0.0086M胆甾醇油酸酯(5.6mg/ml)。
将56.0mg胆甾醇油酸酯溶于1.0ml聚氧乙烯—9—月桂基醚中。加入一个小搅拌子并轻轻搅拌。边搅拌边加入9.0ml热(＞50℃)盐溶液(0.9％W/W)。在室温放置该溶液。
其它：15％(W/W)牛磺胆酸Na盐(150mg/ml)；1.75(W/W)4—氨基安替比林(17.5mg/ml)；6％(W/W)苯酚(60mg/ml)
相关酶：胆甾醇氧化酶，SigmaC—1512(1mg蛋白/ml)。过氧化物酶，SigmaP—8250(39.5红棓酚单位/ml)。
酶：胆甾醇酯酶(0.02—0.4U/ml)
步骤：
吸取2.07ml缓冲液、0.10ml牛磺胆酸、0.10ml过氧化物酶和0.5ml底物于1cm标准石英比色杯中，倒置混匀。
然后加入苯酚0.10ml，并倒置混匀。
之后，加入0.05ml 4—氨基安替比林、0.03ml胆甾醇氧化酶，得到500nm处的基线。
最后加入0.05ml胆甾醇酯酶，得到500nm处的△OD值(dA/dt)。
胆甾醇酯酶单位的计算：
单位/mg固体＝(OD/分钟)/[6.89×(mg酶/ml反应混合物)]
一单位胆甾醇酯酶被定义为于pH7.0及37℃时每分钟水解1μmol胆甾醇油酸酯的酶量。
酶的测定：
酶的测定示于下面的表1中。为确证仅有一种酶蛋白存在，使用了高度纯化的酶制剂。参见实施例1中所述的纯化方法。
基于一OD值配制所测定的酶(参见表1)。用Sigma的胆甾醇酯酶作为对照，使用了50μl该酶的溶液，OD＝0.077，大约0.077mg/ml。
对所有酶扫描400—600秒，计算每30—120秒的上面提到的斜率dA/dt。由这些结果计算活力(示于表1)。分光光度法的测定示于图1。
表1
计算的活力
样品 胆甾醇酯酶
活力(单位/mg)
胆甾醇酯酶，SigmaC—1403 18.2±1.3
霉实假单胞菌胆甾醇酯酶/脂肪酶* 20.2±0.5
荧光假单胞菌脂肪酶 3.3
假丝酵母A脂肪酶 2.5
假丝酵母B脂肪酶 2.7
假丝酵母cyldracia脂肪酶 1.4
豚鼠脂肪酶 0
尖镰孢脂肪酶 1.7
*按实施例1获得
由表1可见仅有Sigma对照品和按实施例1获得的霉实假单胞菌胆甾醇酯酶/脂肪酶具有明显的胆甾醇酯酶活性。从荧光假单胞菌获得的脂肪酶不显示明显的胆甾醇酯酶活性。序列表
(2)SEQ ID No：1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：27个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)股数：一股
(D)拓朴结构：线性
(ii)分子构型：肽
(iii)假设：无
(v)片断类型：N—末端
(vi)来源：
(A)生物体：霉实假单胞菌
(xi)序列的描述：SEQ ID No：1：Ala Asp Ash Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr Pro Ile Ile Leu Val His Gly1 5 10 15Leu Thr Gly Thr Asp Lys Tyr Ala Gly Val Leu
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