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新多肽及编码该多肽的DNA
    【技术领域】

    本发明涉及来自鲎的(1→3)-β-D-葡聚糖敏感性因子(以下称G因子)的以氨基酸顺序表示的多肽及编码该多肽的DNA。特别是G因子的a亚基以氨基酸顺序表示的多肽及编码该多肽的DNA。背景技术

    人们历来知道使用鲎的溶解液测定内毒素的方法。该方法以用鲎的溶解液凝固10-9g的数量级的微量内毒素为基础，后来从生物化学上阐明了这一反应是由几个凝固因子分阶段的激活机制构成的(也称作级联反应)(中村隆范他，日本细菌学杂志38，781-803(1983))。图1所示为用日本产的鲎(Tachypleus tridentatus)所进行的凝固级联反应。关于图1所示的三种丝氨酸蛋白酶前体(C因子、B因子、凝固酶前体)和凝胶化的蛋白质(称作凝固素原)，通过cDNA克隆化，阐明了它们的结构(T.Muta et al(1991)J.Biol.Chem.，266，6554-6561、T.Muta et al(1991)J.Biol.Chem.，265，22426-22433、T.Miyata et al(1986)J.Biochem.，100，213-220)。

    另一方面，也已知用这种溶解物与真菌及酵母菌备胞壁中存在的(1→3)-β-D-葡聚糖反应，灵敏度达10-8～10-9数量级，引起凝胶化(参见图1)。作为这种与(1→3)-β-D-葡聚糖相互作用启动凝胶化反应的因子，即为G因子。G因子和其它的因子同样为丝氨酸蛋白酶的前体，已经知道是72kDa地a亚基和37kDa的b亚基以非共价键结合的糖蛋白(1991年第64回日本生化学会上发表)。

    此外，目前认为G因子的a亚基上具有(1→3)β-D-葡聚糖的特异结合部位，而且b亚基上具有丝氨酸蛋白酶区域，(1→3)-β-D-葡聚糖在a亚基上的结合使G因子激活从而显示出丝氨酸蛋白酶的功能。但是，G因子的全构造尚不清楚。发明的公开

    本发明考虑到上述的状况，把来自鲎的G因子，特别是具有(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的a亚基分离纯化，并弄清了它的全构造。

    本发明的目的是提供含有G因子的(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的多肽及编码该多肽的cDNA。

    本发明的另一个目的是提供G因子的a亚基的多肽及编码该多肽的DNA。

    本发明还有一个目的是提供含有a亚基的G因子的多肽及编码该多肽的DNA。

    因此，本发明涉及含有至少一个以Gln-Gln-Trp-Ser氨基酸顺序表示的结构单元的多肽，编码这种多肽的单链DNA或由该DNA与互补DNA所构成的双链DNA以及以该氨基酸顺序表示的多肽。

    此外，本发明涉及编码下面的氨基酸顺序或与之有同源性的顺序所表示的多肽的单链DNA或由该DNA与互补DNA构成的双链DNA以及该氨基酸顺序所表示的多肽。

       SerHisGluProLysTrpGlnLeuValTrpSerAspGluPheThrAsnGly

       IleSerSerAspTrpGluPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGly

       AsnAsnGluLeuGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGly

       LysLeuValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThr

       SerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGlyLysIle

       GluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrp

       MetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIle

       AspPheIleGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrIle

       HisTrpSerThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsn

       ThrAsnGlyIleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIle

       ValLysTrpPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGly

       GlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeuAsn

       MetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAspGluAlaPhe

       ProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyrGlnAspAlaSerThr

       SerSerProValGlyAspThrSerLeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsn

       ArgHisSerGluLeuTyrLeuAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGly

       AlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAsp

       PheGluHisLeuGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGly

       LysSerLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGln

       GlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerVal

       GlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGlyLysIleValGlu

       ValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysIleGlnGlnTrpSerAsp

       AsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLysLeuIleLysSerLysSerTyrSer

       LysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGlu

       AspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGly

       AlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArg

       IleGluTyrArsValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAsp

       LeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThrGly

       GlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSerGly

       ThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsnTrp

       IleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArg

       AsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGln

       LeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLys

       GluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySer

       TyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSer

       LeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIleProSer

       ThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnValAsp

       LeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsnIle

       AsnTrpIleArgIleThrLysVal

    至今已知有四种鲎，就这四种来说，对于发挥变形细胞(アメボサイト)成分的凝固素原的功能所必要的结构部分彼此非常相似(73～99％)。据此，推测本发明的多肽在4种鲎之间，氨基酸顺序和凝固素原的情况有同样程度的类似。

    于是，多肽之间有相同性的场合，尽管氨基酸顺序不全同，但由于这种类似的氨基酸顺序，而发挥相同或类似的功能，所以本发明不仅包括上述氨基酸顺序而且还包括与之有相同性的氨基酸顺序，对此，从事本行业的人是容易理解的。

    下面对本发明作详细说明。

    首先G因子的纯化可从鲎的血球抽提液，经各种柱层析操作，例如葡聚糖硫酸琼脂糖CL-6B(Dextran sulfate-Sapharose CL-6B)和伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B(Con A-Sepharose-4B)亲和层析，然后用Sephacryl S-200HR进行凝胶过滤层析加以精制(T.Morita et al 1981 FEBS Lett.，129(2)，318-321，特公平3-399号公报)。进一步，可以用G因子的变性剂(表面活性剂等)使构成G因子的a亚基和b亚基变性，用分子筛高速液相色谱法(HPLC)分部分离得到a和b亚基。将各亚基还原、烷化后用酶消化，用肽顺序测定仪等测定，得到肽片断的氨基酸顺序，从而可测得各亚基的部分氨基酸顺序。然后，从鲎血球分离出的poly(A)+RNA制作的cDNA库，根据上述各亚基的部分氨基酸顺序合成的寡核苷酸或用各亚基的抗体将编码各亚基的cDNA分离出来，用双脱氧核苷酸终止法等可测定其碱基顺序(proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.74，5463-5467(1977)Sanger，F.et al.)。然后，根据如此测定的碱基顺序和上述的部分氨基酸顺序就可确定各亚基的氨基酸顺序。

    用以上方法，弄清了顺序号1的编码G因子的a亚基多肽的cDNA(AGC……GTG；碱基编号114～2075)和与其对应的氨基酸顺序(Ser……Val；氨基酸编号1～654)。

    接着，根据G因子a亚基氨基酸顺序确定其具有区域结构。

    即，在a亚基的氨基末端一侧(Pro……Ala；氨基酸编号4～236)存在具有与β-1，3-葡聚糖酶的羧基末端顺序相似顺序的葡聚糖酶区域(参见图2)。另一方面，在羧基末端一侧存在着由126个氨基酸构成的重复结构(Ser……Ile；氨基酸编号391～516和Ser……Val；氨基酸编号529～654)，并且该顺序和木聚糖酶Z的氨基末端顺序相似(参见图3)。然后，在葡聚糖酶区域和木聚糖酶区域之间具有一个QQWS(Gln-Gln-Trp-Ser)基本结构，并存在着重复了三次的与木聚糖酶A的顺序类似的顺序(Leu……Leu，氨基酸编号247～293、G1u……Val；氨基酸编号294～340.和Gly……Ser；氨基酸编号341～387)(参见图4)。

    图2至图4中用一个字母表示各氨基酸。

    本发明中，制备了含有编码这些肽的DNA的重组DNA载体，然后将其整合进缩主，培养或增殖，以所谓基因工程的方法生产出这些肽。

    图1表示鲎血球的内毒素敏感性和(1→3)-β-D-葡聚糖敏感性凝固级联反应的机制。

    图2表示G由子的a亚基的葡聚糖酶区域(氨基酸编号4～236)的氨基酸顺序。图中FGA表示G因子的a亚基的氨基酸编号4～236的氨基酸顺序，βG1Al表示β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸编号421～682的氨基酸顺序。

    图3表示G因子的a亚基的氨基酸编号391～654区域。图中FGA表示G因子的a亚基的氨基酸编号391～654的氨基酸顺序，XynZ表示木聚糖酶Z的氨基酸编号295～434的氨基酸顺序。

    图4表示G因子的a亚基的氨基酸编号247～387区域。图中FGA表示G因子的a亚基的氨基酸编号247～387的氨基酸顺序，XlnA表示木聚糖酶A的氨基编号351～477的氨基酸顺序。发明的最佳实施方案

    以下说明本发明的具体实施例，但是本发明不限于这些实施例。实施例1

    1.G因子的纯化

    (1)血球抽提液的制备

    在113g鲎(Tachypleus tridentatus)的血球中加入400ml0.02m Tris-盐酸缓冲液，pH8.0(含有50mm氯化钠)，在高速匀浆器(商品名，ヒスコトロン，日本精密工业(株)制造)中匀浆3分钟后，8000rpm离心30分钟，得到上清液。然后在离心生成的沉淀物中加入300ml同一缓冲液，采用同上的操作进行匀浆和离心再得到上清液。沉淀物中再加入同一缓冲液，离心回收上清液，再如此重复二次，收集离心操作所得的全部上清液，共得1250ml血球抽提液。

    (2)由血球抽提液纯化G因子的方法

    a.葡聚糖硫酸-琼脂糖-Cl-6B柱层析

    将上述1250ml抽提液加到预先以抽提用缓冲液平衡过的葡聚糖硫酸-琼脂糖-CL6B柱(5×17.8cm)(准备柱子的方法参照特公平3-399号公报的制备例2)上，用相同的缓冲液充分洗净后，用0.02M Tris-HCl缓冲流pH8.0(含有0.15M NaCl)将吸附在柱上后多余的蛋白质洗去。然后，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH8.0(含有0.25M NaCl)将吸附在柱上的蛋白质洗脱出来，得到G因子部分。

    b.伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B柱层析

    将上述G因子部分加到预先用0.02M Tris-Hcl缓冲液pH8.0(含有0.25M NaCl)平衡过的ConA-Sepharose 4B柱(Pharmacia Biotech(公司)生产)(2×16cm)上，用平衡化缓冲液充分洗净后，再用0.02M Tris-HCl缓冲液pH8.0(含有0.5M NaCl)把柱子充分洗净。洗净后用0.02M Tris-HCl缓冲液pH8.0(含0.5M NaCl，0.5M甲基-α-D-葡糖苷)将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来，得到G因子部分。

    C.Sephacryl S-200 HR柱层析

    将上述G因子部分用超滤法浓缩后加到预先用0.05M磷酸钠缓冲液pH6.5平衡过的Sephacryl S-200 HR柱(PharmaciaBiotech公司产品)(2.7×98cm)上，用相同缓冲液将蛋白质洗脱出来。用这一层析法最后洗脱出并收集，280nm波长处仅显示一点点吸收的蛋白质部分。这样得到的蛋白质，就作为G因子的最终精制标准品。从113g血球最后得到按牛血清白蛋白换算约300μgG因子。

    2.G因子的a亚基的部分顺序的测定

    (a)G因子的a亚基和b亚基的分离

    为了进行G因子的a亚基和b亚基的cDNA克隆化，须弄清楚必要的G因子的a、b亚基的部分氨基酸顺序，为此先分离G因子的a亚基和b亚基。将上述1所得的G因子脱盐并浓缩，用甲醇和氯仿沉淀(Methods in Enzymology vol.182，p78-79，(1990))后，溶解在2％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液中，100℃加热5分钟。将此加热过的试样，用二根连接起来的TSK凝胶G3000SW进行凝胶过滤，以0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0(含0.1％SDS)作为流动相，将G因子的a、b亚基分离开。

    (2)G因子的a亚基的酶消化

    在上述2(a)中得到的G因子的a亚基的部分中加入最终浓度为17.4％(w/v)的三氯乙酸(TCA)，沉淀G因子的a亚基。按照Paul Matsu-daira的方法(A Practical Guide to Protein and Pep-tide Purification for Microsequencing，p42-43，1989，AcademicPress，Inc.出版)将沉淀的G因子的a亚基溶解在0.4M碳酸氢铵(含8M尿素)中、用碘乙酰胺进行还原烷化，然后加水将尿素浓度稀释到4M之后，以酶-底物1∶60重量比加入赖氨酰肽链内切酶((ly-syl endopeptidase，和光纯药工业(株))37℃下酶解20小时。将此消化产物加到预先用0.06％v/v三氟乙酸平衡过的μBondasphere 5μC8-300(2.1×150mm)(ウオ-タ-ズ社)上，将柱子充分洗净后，用乙腈浓度连续上升的直线浓度梯度法，5分钟后0％(v/v)，65分钟后24％(v/v)，125分钟后56％(v/v)、135分钟后达到80％(v/v)，以0.2ml/min的流速将吸附的蛋白质洗脱下来。这时洗脱出的各肽，用210nm紫外吸收进行监测，全部分别收集。

    (3)部分氨基酸顺序的测定

    用气相顺序仪47 7A(Applied Biosystems Japan公司)测定所得到的各肽的氨基酸顺序。此结果表示于表1。

    但是Xaa表示自然界存在的一个氨基酸。

                         表1

            肽   1

                Ser-Xaa-Glu-Pro-Lys-Xaa-Gln-Leu-Val-

            肽   2

                Arg-Glu-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe-Lys

            肽   3

                Tyr-Thr-Ser-Ala-Arg-Leu-Lys

            肽   4

                Thr-Gln-Phe-Asp-Lys

            肽   5

                Ser-Trp-Lys

            肽   6

                Tyr-Gly-Lys

            肽   7

                Met-Ala-Ile-Pro-Ser-Phe-Arg-Gly-Val-Trp-Val-Met-

                Phe-Trp-Met-Ser-Gly-Xaa-Asn-Thr-Asn-Tyr-Val-Xaa-

                Xaa-Pro-

            肽   8

                Ser-Ala-Phe-Arg-Asn-Lys

            肽   9

                Val-Phe-Val-Ile-Leu-Asn-Met-Ala-Ile-Gly-Gly-Asn-

                Xaa-Pro-Gly-Phe-Xaa-Val-Ala-

            肽  10

                Ile-Ile-Pro-Arg-Gly-Ser-Gly-Lys

            肽  11

                Val-Gln-Leu-Glu-Asp-Thr-Ser-Asp-Val-Gly-Gly-Gly-

                Lys

            肽  12

                Cys-Asp-Asn-Glu-Gly-Ala-Trp-Met-Ala-Tyr-Lys

            肽  13

                Asp-Ile-Asp-Phe-Pro-Ser-Ser-Gly-Asn-Tyr-Xaa-Ile-

                Glu-Tyr-Xaa-Val-Ala-

            肽  14

                Leu-Ile-Gln-Ala-Glu-Xaa-Tyr-Phe-Xaa-Tyr-Xaa-Glu-

                Val-Gln-Leu-Glu-

            肽  15

                Glu-Gly-Ala-Trp-Met-Ala-Tyr-Lys

            肽  16

                Val-Arg-Gly-Thr-Ile-His-Trp-Ser-Thr-Pro-Asp-Gly-

                Ala-His-Ala-His-His-Asn-Arg-

    3.寡核苷酸的合成

    由表1中的测定的氨基酸顺序，利用2种氨基酸顺序A：-Glu-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe-，B：-Trp-Val-Met-Phe-Trp-Met-将A逆翻译为意义链，B逆翻译成反义链，然后在5′末端加上限制酶识别顺序和保护DNA的2个碱基，用DNA合成仪-380A(AppliedBiosystems Japan公司)合成了如下面所示的25个碱基与26个碱基的寡核苷酸的混合物。

        A′：5′-CGGAGCTCGAAGATTATGATGGTTT-3′      25个核苷酸

                           G  C  C  C  C

                                       A

                                       G

        B′：3′-ACCCATTACAAAACCTACCTTAAGGC-5′     26个核苷酸

                       C    G

                       A

                       G

                                〔式1〕

    这里所示的寡核苷酸A′和B′分别包括相当于A和B的顺序或互补的顺序的全部可能性(但是，A的phe密码z(TT(C/T))中的第3个核苷酸(T，C)例外)。

    4.含有编码G因子的mRNA的poly(A)+RNA的制备

    从鲎的血球纯化了G因子，从而从鲎的血球分离出poly(A)+RNA。

    (1)总RNA的制备

    用AGPC法(参见实验医学Vol.9，p1937～1940)从11.8g鲎的血球中分离出约11mg总RNA。

    (2)poly(A)+RNA的制备

    取2mg分离出的总RNA用Oligotex-dT 30 Super试剂盒(日本ロシユ(株)生产)分离poly(A)+RNA。然后，为了提高一次分离的poly(A)+RNA的纯度，再重复一次同样的操作。由如此进行的二次Oligotex-dT30 Super试剂盒操作，从2mg总RNA获得了34.5μg高纯度的poly(A)+RNA。

    5.鲎血球cDNA库的制备

    (1)cDNA的合成

    由上述4中制备的poly(A)+RNA 34.5μg中取出5μg poly(A)+RNA，用Amecrsham公司的cDNA合成试剂盒合成了cDNA。

    (2)cDNA库的制备

    由(1)中合成的cDNA，用Amersham公司的cDNA克隆系统λgt10接头法制备了鲎的血球cDNA库。

    6.G因子a亚基的cDNA克隆

    以上述4(2)中获得到的poly(A)+RNA为模板，再用上述3合成的寡核苷酸，采用PCR法Saiki，R.K.et al，Science，239，487-491，1988)扩增了编码G因子a亚基一部分的cDNA片段。用多引物DNA标记试剂盒(日本基因株式会社生产)以[α-32P]dCTP标记此cDNA片段，将其用作探针，对上述5(2)中制备的cDNA库进行筛选，获得了含最长约为2,400dp的插入cDNA的二个阳性克隆。这二个克隆的插入cDNA除5′末端和3′末端的长度有数个碱基的差异之外全部相同。然后测定了这二者的碱基顺序，它们复合起来的碱基顺序含有起始密码子和poly(A)+尾巴。大小为2400bp。

    7.编码G因子的a亚基的cDNA碱基顺序的测定

    将上述6中得到的插入cDNA重组进了pUC118和pBlue-script II SK载体中。为了测定克隆在pUC118载体和pBluescript IISK载体中的cDNA全碱基顺序，利用cDNA片段上的限制酶识别位点以及长链缺失试剂盒(宝酒造公司产品)进行缺失和亚克隆。使用鲎光标记的核苷酸引物和DNA顺序分析仪-370A(AppliedBiosystems Japan公司产品)测定了以上述方法制备的克隆中的cDNA的碱基顺序。(Smith L.M.et al(1986)Nature 321，674-679)。

    顺序表的顺序号1表示这样测定的G因子a酸基的cDNA的碱基顺序，以及由此弄清楚的氨基酸顺序。在此氨基酸顺序中全部包含了2(3)中测定的部分氨基酸顺序(表1)，确定了该碱基顺序的插入cDNA确实是编码G因子的a亚基的密码子。

    8.G因子或其它基的表达及纯化

    由上述得到的克隆，用超声波处理、限制酶处理或这一技术领域已知的其它方法将编码G因子的a亚基的基因的全部或一部分分离出来并重组进适当的载体。载体是用能在宿主微生物体内或细胞内自主增殖的噬菌体或质粒经基因重组而构建的，即所谓含有装上适当的启动子、SD顺序、翻译起始密码子ATG或者再有适当的结构基因的载体都是适用的。这样构建的载体转移入适当的宿主生物体或细胞可得到转化子，各种大肠杆菌株、各种酵母菌株、鼷鼠、大鼠、中国仓鼠等动物的卵母细胞(CHO)之类的动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动植物昆虫宿主等都可作为宿主。将这样得到的转化子用营养培养基进行培养，或者用营养食物饲喂就可稳定地生产大量的G因子或其亚基(以下称作G因子等)。转化子的培养或饲育条件尽管在生产G因子等的范围内可作适当改变，而所用宿主的繁殖，可用该技术领域中一般公知的条件。培养物中的或喂养物中的G因子、含菌体或细胞的培养液或用适当的机械方法破碎了的个体的抽提液，也可以就这样采取使用。然而，一般按通常的方法，当G因子等存在于培养液中或抽提液中时，用过滤、离心分离等方法将含G因子等的溶液与菌体细胞或个体的破碎的碎片分离之后再使用。当G因子等存在于菌体内，细胞内或个体内脏膜内时，将获得的培养物或碎片先用过滤或离心分离等方法收集菌体，细胞或碎片，然后将其用机械的方法或超声波处理或溶菌酶等酶方法或添加EDTA等螯合剂和/或表面活性剂使G因子等溶解之后加以分离。从这样得到的含有G因子等的溶液分离G因子等可以使用通常人们知道的蛋白质纯化方法。

    这时若G因子等以嵌合的多肽表达的话，则可以利用其他蛋白质的性质容易地进行分离。比如利用其他的蛋白质对某种物质的亲和性，用亲和层析法就可以容易地分离出来。

    实际上G因子α亚基可以用下面的方法来表达。

    先合成具有5′-AGCCACGAACCAAAGTGGCA-3′顺序的寡核苷酸，然后将5′端磷酸化。再将此寡核苷酸与编码G因子α亚基的基因掺入的质粒制备的单链DNA进行杂交，用Klenow片段等DNA聚合酶进行延伸反应，用绿豆核酸酶等DNA酶切断这时生成的单链部分，得到双链DNA。用限制酶SphI将此双链DNA切断，这时产生的连接末端，用DNA聚合酶或Klenow片段或用削平试剂盒将其弄成平头。预先用NcoI限制酶切断此双链DNA，这时产生的连接末端用T4DNA聚合酶或Klenow片段或削平试剂盒弄成平头，重组进了pTV118N(含氨苄青霉素抗性基因)。将此质粒导入E.coli JM109或E.coli MV1184得到转化子。这时可以利用质粒的性质以一般的方法选择必要的转化子。即在含有氨苄青霉素的LB平板(预先涂布了(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)/异丙基硫半乳糖苷(IPTG))上培养，将导入了目标质粒的白色菌落挑选出来。然后用合成寡核苷酸5′AAACAGACCAT-GAGCCACGAACCA-3′做探针可以筛选得到具有正确顺序的质粒。然后用RV-N引物(宝酒造公司产品)作为顺序分析引物进行DNA顺序分析，就可以确认正确质粒的结构。将具有正确顺序的质粒导入E.Co1i JM 109或MV1184，用含有100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的3％营养肉汤(日水制药公司产品)30℃下培养此细菌24小时。使用一般的方法，从此培养物的上清液或菌体抽提液纯化出G因子的a亚基。这时使用抗体或与G因子的a亚基有亲和性的配基进行亲和层析，就可以比较简单地纯化出来。实施例2

    1.G因子的b亚基的部分氨基酸顺序的测定

    (1)G因子b亚基的分离

    实施例1的2(1)中由于把G因子分离成了a亚基的b亚基，因而同样也得到了b亚基。

    (2)G因子的b亚基的酶消化

    用和实施例1的2(2)相同的方法，由上述(1)中得到的G因子的b亚基得到了肽片段。

    (3)部分氨基的顺序的测定

    按和实施例1的2(3)相同的方法测定了所得的各肽的氨基酸顺序。此结果列于表2。

                               表2肽    l

      Gly-Ile-Asn-Glu-Lys肽    2

      Xaa-Xaa-Gly-Phe-Xaa-Pro-Val-Ile-Thr-肽    3

      Ile-Ile-Gly-Gly-Gly-Ile-Ala-Thr-Pro-His-Ser-Xaa-

      Pro-Xaa-Met-Val-Gly-Ile-Phe-肽    4

      Val-Asn-Pro-肽    5

      Val-Xaa-Val-Val-Thr-Ala-Ala-His-Cys-Leu-Val-Thr-

      Gln-Phe-Gly-Asn-Arg-Gln-Xaa-Tyr-Ser-Ile-Phe-Val-

      Arg-Val-Gly-Ala-His-Xaa-Ile-Xaa-Asn-Ser-Gly-Thr-

      Asn-肽    6

      Val-Val-Ile-Thr-Gly-Trp-Gly-Val-Thr-Gly-Lys肽    7

      Asn-Val-Leu-Arg-Glu-Leu-Glu-Leu-Pro-Val-Val-Thr-

      Asn-Glu-Gln-Cys-Xaa-Lys肽    8

      Ser-Tyr-Gln-Thr-Leu-Pro-Phe-Ser-Lys肽    9

      Leu-Asn-Arg-Gly-Ile-Thr-Asn-Asp-Met-Ile-Cys-Ala-

      Gly-Phe-Pro-Glu-Gly-Gly-Lys肽    10

      Asp-Ala-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Met-

      Tyr-Gln-Asn-Pro-Thr-Thr-Gly-Arg-Val-Lys2.寡核苷酸的合成

    根据测定的氨基酸顺序，利用2种氨基酸顺序C：-Asn-Glu-Gln-Gys-(Asn)-Lys，D：-Met-Tyr-Gln-Asn-Pro-Thr-顺序，逆翻译C成意义链，逆翻译D成反义链，用和实施例1的3相同的方法合成了如下所示的各25个寡核苷酸C′和D′的混合物。上述C中的-(Asn)-表示推测为Asn。

         C′：5′-CGGAGCTCAATGAACAATGTAATAA-3′      25个核苷酸

                            C  G  G  C  C

         D′：3′-TACATAGTTTTAGGTTGCTTAAGGC-5′      25个核苷酸

                       G  C  G  C

                                A

                                G

                             〔式2〕

    这里所示的寡核苷酸C′及D′，包括了和C及D相同的或互补的顺序的全部可能的(但是C和D的C末端氨基酸的Lys，以及D的Thr的各密码子(AA(A/G)和(AC(A/C/G/T))第三核苷酸(各A，G和T，C，A，G)除外)。

    4.G因子的b亚基的cDNA克隆。

    以实施例1的4(2)中得到的poly(A)+RNA做模板，再用上述2中合成的寡核苷酸，用和实施例1的6相同的方法进行实验，得到了含有1979bp的cDNA的阳性克隆。分析此克隆的插入cDNA的碱基顺序时，证实它含有与来自上述1(2)中所得的G因子b亚基的肽的氨基酸顺序相当的碱基顺序，并见存在添加poly A信号，根据其大小推想这个克隆是全长的cDNA。

    5.编码G因子的b亚基的cDNA碱基顺序的测定

    用和实施例1的7相同的方法测定了G因子的b亚基的cDNA碱基顺序。这样分析的结果，弄清楚了以G因子b亚基的cDNA的碱基顺序以及由此弄清楚的G因子的b亚基的氨基酸顺序，列于第2号顺序表中。

    由于在这一氨基酸顺序中完全含有实施例2的1(3)测定的部分氨基酸顺序(表2)，所以现在测定碱基顺序的插入cDNA确实是编码G因子b亚基的。

    含有编码实施例2中提取的多肽的cDNA的重组DNA载体，在转移进有可能复制的宿主微生物，适当的动物细胞、昆虫或昆虫细胞之后，以载体的标记和结合(1→3)-β-D-葡聚糖的能力作为指标，筛选得到了保持该重组DNA载体的微生物，动物细胞、昆虫或昆虫细胞，经过培养或饲养就可以提取本发明的多肽。工业上的应用性

    用本发明分离纯化了鲎的变形细胞溶解液的G因子的a亚基，测定了它的氨基酸顺序和编码它的cDNA碱基顺序。

    其结果，在此顺序中含有(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位，利用它们的cDNA，借助基因工程的方法可以得到相当于结合部位的多肽。得到的多肽显示出如下种种的效果。

    (1)近年来伴随着免疫不全患者的增加和高龄化，由于白色念珠菌属，曲霉菌属等类通常致病性弱的二次病原体引起的条件真菌感染明显增加。然而，特别是因真菌引起的内脏等的深部真菌病，除了一部分特殊的病型以外，不靠侵袭性手段的有限临床诊断是困难的，因此多是在解剖检查后做出初步诊断(参见微生物学辞典、1989年，技报堂)。

    上述深部感染的真菌病口诊断，可以用含有该(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的多肽或将(1→3)-β-D-葡聚糖用放射性同位素、酶、萤光物质、发光物质等标记物质标记了的结合部位多肽，用配基-受体检测法测定(1→3)-β-D-葡聚糖。此外也可以使用将此多肽结合在微型平板，试管或小珠等固相上，特异地捕捉检出(1→3)-β-D-葡聚糖等的测定方法。用这样的测定方法能特异地测定体液中的来自真菌的可1→3)-β-D-葡聚糖，可以对深部真菌病进行简便迅速的诊断。

    (2)此外，含有(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的多肽上结合了抗真菌剂的药物对病灶具有很强的亲和性，就有可能制出对细胞壁上存在(1→3)-β-D-葡聚糖的病灶中的真菌有特异性杀菌作用的新的选择性抗真菌剂。

    (3)其次，伴随着近年来基因操作技术的发展，在表达目的蛋白质时，将酵母菌作为含有编码目的蛋白质的基因的载体的宿主，进行繁殖。这样，因为可与细菌同时大量培养，从而可生产糖蛋白。但是，问题在于，产物中大多含有酵母菌的残渣，残渣带有极微量的作为构成成分的(1→3)-β-D-葡聚糖，必须将它定量和清除。这时使用将含有(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的多肽结合在支持体上的亲和载体进行亲和层析，可以特异地除去酵母菌的残渣，或者进行定量，而且确认除去残渣后的产物中不含有酵母菌菌体成分，如(1)中所述的使用含有(1→3)-β-D-葡聚糖结合部位的多肽进行的定量法，比起使用鲎变形细胞溶解物，可以更简便地，高度特异性地确认。

                   顺序表

    顺序编号：1

    顺序长度：2408

    顺序类型：双链

    拓扑结构：直链

        起源：鲎血球

        顺序

        10        20        30        40GTGGGGGGTTTAGTTGAAACAGTAAATACGTTAACTGTTTAATCT   50        60        70        80        90TGTTAATTGCAATGTTGGTGTTGCTGTGTTGTGTTGTTTTGCATG

           MetLeuValLeuLeuCysCysValValLeuHisVal

                       -15            -10

       100       110       120       130TTGGTGTTGCAAGAATTTGCTGTAGCCACGAACCAAAGTGGCAGC  GlyValAlaArgIleCysCysSerHisGluProLysTrpGlnLeu

         -5          -1  1           5  140       150       160       170       180TCGTCTGGTCGGATGAATTTACCAATGGAATAAGTTCTGATTGGG  ValTrpSerAspGluPheThrAsnGlyIleSerSerAspTrpGlu

      10             15             20

       190       200       210       220AATTTGAAATGGGCAATGGCCTCAATGGTTGGGGTAATAACGAAC  PheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGlyAsnAsnGluLeu

       25            30             35  230       240       250       260       270TGCAATATTATCGTCGTGAAAATGCCCAAGTTGAGGGAGGGAAAC  GlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGlyLysLeu

      40             45             50

       280       290       300       310TGGTAATTACTGCTAAAAGAGAAGACTATGATGGCTTCAAATACA  ValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThr

      55             60             65  320       330       340       350       360CTTCTGCTAGGCTGAAAACCCAGTTTGATAAATCTTGGAAGTATG

    SerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGly

        70             75            80

       370       380       390       400GTAAAATTGAAGCCAAAATGGCGATTCCATCATTTCGGGGAGTCT

    LysIleGluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrp

        85             90             95  410       420       430       440       450GGGTGATGTTCTGGATGTCAGGAGACAACACTAATTATGTTAGAT

    ValMetPheTrpMetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrp

       100            105            110

         460      470         480     490GGCCATCTTCTGGTGAAATTGACTTTATTGAACATAGAAACACTA  ProSerSerGlyGluIleAspPheIleGluHisArgAsnThrAsn

     115            120            125  500       510       520       530       540ACAATGAAAAAGTCAGAGGAACTATTCACTGGTCCACTCCTGACG  AsnGluLysValArgGlyThrIleHisTrpSerThrProAspGly

     130            135            140

       550       560       570       580GTGCTCATGCGCATCATAACAGAGAAAGTAATACAAATGGGATTG  AlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsnThrAsnGlyIleAsp

     145            150            155  590       600       610       620       630ATTATCACATTTATTCTGTAGAGTGGAATTCTTCCATTGTTAAAT  TyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIleValLysTrp

     160            165            170

       640       650       660       670GGTTTGTTAATGGAAATCAATACTTTGAAGTGAAAATTCAGGGAG  PheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGlyGly

     175            180            185  680       690       700       710       720GAGTAAATGGGAAAAGTGCATTTCGTAACAAAGTTTTCGTTATTT  ValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeu

     190            195            200

       730       740       750       760TAAACATGGCGATTGGTGGAAACTGGCCAGGATTCGATGTTGCTG  AsnMetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAsp

     205            210            215  770       780       790       800       810ACGAGGCTTTCCCTGCTAAAATGTACATTGATTATGTCCGTGTAT  GluAlaPheProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyr

     220            225            230

       820       830       840       850ACCAGGATGCCAGTACATCTTCTCCTGTTGGGGATACCTCTTTAG  GlnAspAlaSerThrSerSerProValGlyAspThrSerLeuAsp

     235            240            245  860       870       880       890       900ATGGTTACTATTTTGTCCAAAACAGGCACAGTGAATTGTATCTTG  GlyTyrTyrPheValGlnAsnArgHisSerGluLeuTyrLeuAsp

     250            255            260

       910       920       930       940ATGTCACTGATGCCAGTAACGAAGATGGAGCATTTCTGCAACAAT  ValThrAspAlaSerAsnGluAspGlyAlaPheLeuGlnGlnTrp

     265            270            275  950       960       970       980     990GGTCTTATAGTGGTAATGAGAACCAACAGTTTGATTTTGAGCATC  SerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAspPheGluHisLeu

     280            285            290

      1000      1010      1020      1030TCGAAAATAATGTTTATAAAATTACTAATAAAAAAAGTGGAAAAT  GluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGlyLysSer

     295            300            305 1040      1050      1060      1070      1080CTTTGGATGTTTATAATTTTGGGACTGAGAATGGTGTTAGAATCC  LeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGln

     310            315            320

      1090      1100      1110      1120AACAGTGGTCATATGGAGGGGCTCGCAATCAGCAGTTTACTGTAC  GlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGln

     325            330            335 1130      1140      1150      1160      1170AAAGTGTTGGTGATGGTTATTATAAGATTATTCCACGCGGCAGTG  SerValGlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGly

     340            345            350

      1180      1190      1200      1210GAAAGATAGTGGAAGTAGCAGATTTTAGTAAAGATGCAGGAGGGA  LysIleValGluValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLys

     355            360            365 1220      1230      1240      1250      1260AGATACAACAATGGTCTGATAACAACCAATTATCTGGACAGTGGA  IleGlnGlnTrpSerAspAsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLys

     370            375            380

      1270      1280      1290      1300AACTTATTAAAAGTAAAAGTTATTCTAAATTAATTCAGGCAGAAA  LeuIleLysSerLysSerTyrSerLysLeuIleGlnAlaGluSer

     385            390            395 1310      1320      1330      1340      1350GTTATTTTGATTCCTCAAAAGTACAATTGGAAGATACCTCAGATG  TyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGluAspThrSerAspVal

     400            405            410

      1360      1370      1380      1390TAGGAGGTGGGAAGAATGTTAAATGTGATAATGAAGGAGCCTGGA  GlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGlyAlaTrpMet

     415            420            425 1400      1410      1420      1430      1440TGGCTTATAAGGATATTGATTTCCCCAGTTCAGGTAATTATCGAA  AlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArgIle

     430            435            440

      1450      1460      1470      1480TAGAATACAGAGTAGCAAGTGAACGTGCAGGAGGAAAGCTGTCTC GluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeu

    445            450            455

    1490    1500    1510    1520    1530TGGATTTGAATGCAGGCTCTATAGTTCTTGGCATGCTGGATGTTC  AspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValPro

     460            465            470

      1540      1550      1560      1570CTTCAACAGGAGGATGGCAGAAGTGGACCACCATTTCCCATACAG  SerThrGlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrVal

     475            480            485 1580      1590      1600      1610      1620TGAATGTGGATTCAGGTACATATAACTTGGGGATCTATGTTCAAC  AsnValAspSerGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArg

     490            495            500

      1630      1640      1650      1660GAGCCAGCTGGAATATCAACTGGATAAAGATTACAAAAATACCTG  AlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleLysIleThrLysIleProGlu

     505            510            515 1670      1680      1690      1700      1710AACAGTCAAATTTGAATCAAGGGCGTCGTAATTCTAAATTAATTC  GlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArgAsnSerLysLeuIleGln

     520            525            530

      1720      1730      1740      1750AGGCAGAAAGTTATTTTAGTTACTCAGAAGTACAACTGGAAGATA  AlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGlnLeuGluAspThr

     535            540            545 1760      1770      1780      1790      1800CCTTAGATGTAGGAGGTGGAAAGAATGTTAAATGTGATAAAGAAG  LeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLysGluGly

     550            555            560

      1810      1820      1830      1840GGGCCTGGATGGCTTACAAGGATATTGATTTCCCCAGTTCAGGAA  AlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySer

     565            570            575 1850      1860      1870      1880      1890GTTATCGAGTAGAATACAGAGTGGCAAGTGAACGTGCAGGAGGAA  TyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLys

     580            585            590

      1900      1910      1920      1930AGCTGTCCCTAGATTTGAATGCAGGCTCTATAGTGCTTGGCATGC  LeuSerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeu

     595            600            605 1940      1950      1960      1970      1980TGGATATTCCTTCAACAGGAGGATTGCAGAAGTGGACCACCATTT  AspIleProSerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSer

      610             615           620

      1990      2000      2010      2020CTCATATAGTGAATGTGGATTTAGGTACATATAACTTGGGAATTT

    HisIleValAsnValAspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyr

       625            630            635 2030      2040      2050      2060      2070ATGTTCAAAAAGCCAGTTGGAATATCAATTGGATTAGAATTACAA ValGlnLysAlaSerTrpAsnIleAsnTrpIleArgIleThrLys

    640            645            650

      2080      2090      2100      2110AAGTGTAGGATACAAGAGCAAACCAATTGTATTATTTTGAAGAAA  Val  654 2120      2130      2140      2150      2160CAACAGCTGTTGACCATAATCTTTGTTCATTGAGAATTTATCCAA

      2170      2180      2190      2200CTGTTATAGAATCTATCACCTTTCCAGATGTACGCATTGCTGATG 2210      2220      2230      2240      2250GTTTTGAACTAATAAATGAGGAGATTATAAGTGCTAATGTGTTTG

      2260      2270      2280      2290TTATATCTTTAATTTTTAAAAACAAATTATCAACTAACTTTTCAA 2300      2310      2320      2330      2340TTCAGGCATGGTGTTTCTCTTTTTAATCTGTATTTCTAATAAATT

      2350      2360      2370      2380AATGTCTTTAAGAGTTGTTTTGTTTACAATAAATAAAGTTTGATT 2390      2400GTGTGGGATAAAAAAAAAAAAAA

    顺序编号：2

    顺序长度：1979

    顺序类型：双链

    拓扑结构：直链

        起源：鲎血球

        顺序

        10        20        30        40GAAGACAAGAGAGTTGAAACAACCATAGCCTGTTTGCTTATGACT   50        60        70        80        90TTCAATAAGAGATACTCGGCTTAAAGGGAACTGACTTATTCGTAG

       100       110       120       130AGGCTATACCATGGATATCAGTTTCCTGGTTTTTATCACACTGTC

          MetAspIleSerPheLeuValPheIleThrLeuSer

             -30            -25            -20  140       150       160       170       180TATGGCTCTCTTCTCGAGCAACGTGACAGGAACGTCAGTAACATC MetAlaLeuPheSerSerAsnValThrGlyThrSerValThrSer

             -15            -10             -5

       190       200       210       220AAGGGTACGACGTGGAATAAATGAAAAACATTGTGGGTTCCGACC ArgValArgArgGlyIleAsnGluLysHisCysGlyPheArgPro

           -1  1           5             10   230      240       250       260       270AGTAATTACAAGAATTATTGGTGGAGGAATAGCGACGCCTCATTC ValIleThrArgIleIleGlyGlyGlyIleAlaThrProHisSer

           15             20             25

       280       290       300       310ATGGCCGTGGATGGTTGGAATTTTCAAAGTAAATCCTCACCGTTT TrpProTrpMetValGlyIlePheLysValAsnProHisArgPhe

           30             35             40  320       330       340       350       360CCTTTGTGGTGGATCTATTATTAATAAAGTCTCTGTTGTTACTGC LeuCysGlyGlySerIleIleAsnLysValSerValValThrAla

           45             50             55

       370       380       390       400CGCCCATTGTCTTGTGACGCAGTTTGGAAACAGACAGAATTATTC AlaHisCysLeuValThrGlnPheGlyAsnArgGlnAsnTyrSer

           60             65             70  410       420       430       440       450TATCTTCGTAAGAGTTGGAGCCCATGACATAGACAATTCGGGTAC IlePheValArgValGlyAlaHisAspIleAspAsnSerGlyThr

           75             80             85

       460       470       480       490AAATTATCAAGTGGATAAAGTTATTGTTCACCAGGGCTACAAACA AsnTyrGlnValAspLysValIleValHisGlnGlyTyrLysHis

           90             95            100  500       510       520       530       540CCATTCACACTACTACGATATCGGTTTGATTTTACTCTCGAAACC HisSerHisTyrTyrAspIleGlyLeuIleLeuLeuSerLysPro

          105            110            115

       550       560       570       580AGTCGAATACAACGACAAAATACAGCCTGTCTGTATTCCTGAGTT ValGluTyrAsnAspLysIleGlnProValCysIleProGluPhe

          120            125            130  590       600       610       620       630CAACAAACCTCACGTGAACTTGAACAATATTAAGGTCGTCATTAC AsnLysProHisValAsnLeuAsnAsnIleLysValValIleThr

          135            140            145

       640       650       660       670TGGTTGGGGTGTTACTGGGAAAGCTACTGAGAAACGTAACGTTCT GlyTrpGlyValThrGlyLysAlaThrGluLysArgAsnValLeu

           150             155           160  680       690       700       710       720TCGTGAATTGGAGTTGCCCGTGGTTACAAACGAACAGTGCAACAA ArgGluLeuGluLeuProValValThrAsnGluGlnCysAsnLys

          165            170            175

       730       740       750       760ATCTTATCAGACACTCCCATTCTCAAAATTGAACCGAGGAATCAC SerTyrGlnThrLeuProPheSerLysLeuAsnArgGlyIleThr

          180            185            190  770       780       790       800       810TAACGACATGATTTGTGCGGGGTTTCCGGAAGGAGGGAAAGATGC AsnAspMetIleCysAlaGlyPheProGluGlyGlyLysAspAla

          195            200            205

       820       830       840       850TTGTCAGGGCGACTCTGGTGGTCCCCTGATGTATCAGAATCCAAC CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuMetTyrGlnAsnProThr

          210            215            220  860       870       880       890      900AACAGGAAGAGTGAAAATAGTTGGAGTTGTATCATTTGGGTTCGA ThrGlyArgValLysIleValGlyValValSerPheGlyPheGlu

          225            230            235

     910        920         930     940AATGTGCTCGTCCCAACTTCCCCGGTGTTTACACGCGCCTCTCGAG CysAlaArgProAsnPheProGlyValTyrThrArgLeuSerSer

          240            245            250  950       960       970       980       990CTACGTTAACTGGCTCCAGGAAATCACCTTCGGACAGTCACTCGC TyrValAsnTrpLeuGlnGluIleThrPheGlyGlnSerLeuAla

          255            260            265

      1000      1010      1020      1030TTCTTTATTTGAAGTTGTACCAATATTTATACCCGAGTGAGACTG SerLeuPheGluValValProIlePheIleProGlu

          270            275 1040      1050      1060      1070      1080AAGATAAATATTGAAGAGAAATCTAGAATAATGTACAATATAAGA

      1090      1100     1110       1120AGCCTGAAATTACTGAAATAGAAAGGCGCGTGATGAGAAATACGT 1130      1140      1150      1160      1170TTCAAATTTTATTTTTTATTAACTTTATTGTGTTTAACTATTCTT

      1180      1190      1200      1210TACGTGGGACATGAAATATAAATCTTTATTTCTTCTTTATATACT 1220      1230      1240      1250      1260TTAGATTTTCATTTCATCTATCTTTATCAGTTTTGTAATGTTACT

      1270      1280      1290      1300AATAATATTTCTTATGGCACGGATCGAGCCTCGTGAATCACAGTA 1310      1320      1330      1340      1350AATAATAATAATTATAAAATCACACATTATTAAAAGCAATAGCAT

      1360      1370      1380      1390TCAGAGTGAGTAACATATAAACTTCACTATGAGTGGACTTTTTTA 1400      1410      1420      1430      1440TTCACATTTTAAGTTCATTACTAACTGTTGGGAGGTCTTTATATT

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