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1、(10)授权公告号 CN 102264373 B (45)授权公告日 2014.05.14 CN 102264373 B (21)申请号 200980151731.3 (22)申请日 2009.12.22 08172775.2 2008.12.23 EP A61K 31/704(2006.01) A61K 31/7088(2006.01) A61K 39/39(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 英特威国际有限公司 地址 荷兰博克斯梅尔 专利权人 天主教大学基金会 , 圣拉宝医学 中心大学 (72)发明人 CC斯彻厄 S尼尔肯斯 G阿德玛 DM布洛克 T。
2、JM鲁尔斯 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 刘晓东 US 7049302 B1,2006.05.23, 摘要， 附图， 第 24-46 行， 实施例， 权利要求 . US 2005175623 A1,2005.08.11, 权利要求 1-11. LENARCZYK A ET AL.ISCOMR) based vaccines for cancer immunotherapy. VACCINE .2004, 第 22 卷 ( 第 8 期 ),963-974. (54) 发明名称 用于原位肿瘤破坏疗法的免疫刺激性皂苷类 (57) 摘要 本发明涉及用。
3、于原位肿瘤破坏疗法的药物组 合物， 所述疗法包括肿瘤破坏和施用免疫刺激量 的免疫增强剂的步骤， 以及涉及此类药物组合物 在药剂制造中的用途。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2011.06.22 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/EP2009/067721 2009.12.22 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2010/072743 EN 2010.07.01 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 盛倩 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图2。
4、页 (10)授权公告号 CN 102264373 B CN 102264373 B 1/1 页 2 1. 皂苷作为免疫增强剂在制备用于原位肿瘤破坏疗法的药物中的用途， 所述疗法包 括肿瘤破坏和施用免疫刺激量的皂苷的步骤， 其中所述皂苷包含至少一种下列成分 ： QS-7、 QS-17、 QS-18、 QS-21、 QuilA、 Vax Sap、 SuperSap、 GPI-0100 或 QP UF 1000。 2. 权利要求 1 的用途， 其特征在于皂苷以空免疫刺激复合物的形式存在。 3. 权利要求 1 或 2 的用途， 其特征在于其还包含 CpG ODN。 4. 权利要求 1 或 2 的用途，。
5、 其中所述疗法中所述步骤以下列顺序进行 ： a. 肿瘤的破坏 ； b. 免疫增强剂的施用。 5.权利要求4的用途， 其特征在于在肿瘤破坏后24小时内进行免疫增强剂的所述施用 步骤。 6.权利要求4的用途， 其特征在于在肿瘤破坏后12小时内进行免疫增强剂的所述施用 步骤。 7. 权利要求 4 的用途， 其特征在于在肿瘤破坏后 6 小时内进行免疫增强剂的所述施用 步骤。 8. 权利要求 1 或 2 的用途， 其中所述疗法中所述步骤为 ： a. 免疫增强剂的围手术期施用 ； b. 肿瘤的破坏。 9.权利要求1或2的用途， 其中免疫增强剂的施用的位置按递增的优先次序为静脉内、 赘生肿块的引流区中的皮下。
6、、 肿瘤旁或肿瘤内。 10. 权利要求 1 或 2 的用途， 其中所述药物用于治疗患癌症的哺乳动物， 其中所述哺乳 动物已经历肿瘤破坏。 11. 权利要求 1 或 2 的用途， 其中所述药物用于围手术期施用， 以治疗患癌症的哺乳动 物， 其中所述哺乳动物将要或已经经历肿瘤破坏。 权 利 要 求 书 CN 102264373 B 2 1/6 页 3 用于原位肿瘤破坏疗法的免疫刺激性皂苷类 0001 本发明涉及用于原位肿瘤破坏疗法的药物组合物， 所述疗法包括肿瘤破坏和施用 免疫刺激量的免疫增强剂的步骤， 以及涉及此类药物组合物在药剂制造中的用途。 0002 癌症是用于描述赘生性生长 (neopla。
7、stic growth) 的一般术语。赘生物被认为是 通常以高于正常的速度增殖的组织的异常的、 通常为去分化的形式。 在大多数情况下， 赘生 性细胞侵入周围组织并且它们还转移至身体的其他地方并且继续生长。 0003 赘生性肿块(neoplastic mass)即肿瘤的局部和区域治疗例如手术不影响可能的 转移。因此， 需要另外的疗法例如利用细胞毒性药物的治疗。此类治疗通常称为化学疗法。 0004 局部治疗当然是实体瘤的治疗的第一步骤。这通常通过肿瘤切除术来进行。 0005 另一种方法是原位肿瘤破坏。原位肿瘤破坏的的特征是不移除肿瘤而是使其坏 死。原则上， 辐照是原位肿瘤破坏的一种形式， 但已开发。
8、了许多其他的肿瘤破坏方式。常用 方法是例如光动力疗法 ( 该疗法组合使用光敏化合物和随后通过激光活化 ( 利用激光、 微 波、 电流、 超声波、 高强度的聚焦超声波或利用射频波原位加热 ) 或冷冻疗法 ： 通过冷冻使 组织坏死。 0006 原位肿瘤破坏使被破坏的肿瘤块存在于体内。 这为尝试和建立针对肿瘤特异性抗 原的免疫应答 ( 癌症免疫疗法 ) 提供了可能性。对肿瘤特异性抗原的此类免疫应答的成功 诱导的有利方面是其将持续一段时间并且最终消除机体内由局部肿瘤破坏不易到达的其 他部位的肿瘤。 0007 然而， 与从基于非自身抗原的疫苗开发所知的相反， 针对肿瘤抗原的免疫应答的 诱导非常困难。 0。
9、008 总的说来， 肿瘤抗原大部分是身体的正常成分 ： 自身抗原。 因此免疫系统就这一点 来说将下调自我导向的免疫应答， 从而导致对自身抗原的耐受状态。 0009 因此， 基于肿瘤破坏的癌症免疫疗法的开发需要非常特殊的方法。 0010 实 际 上，非 甲 基 化 的 胞 苷 基 鸟 苷 基 寡 脱 氧 核 苷 酸 (cytidyl guanosyloligodeoxynucleotide， CpG ODN) 目前被认为是迄今为止最优选的能够诱导针对 肿瘤特异性自身抗原的免疫应答的免疫增强化合物的特定组。此类胞苷鸟苷基寡脱氧核 苷酸作为 toll 样受体 9(TLR9) 激动剂起作用。CpG 基。
10、序因它们对 Th1 应答和肿瘤特异性 CD8+T 淋巴细胞的优先诱导而显突出。TLR9 主要由内化并且直接对 CpG 基序起反应的 B 细 胞和树突细胞 (DC) 表达。在触发 TLR9 后， DC 成熟并且迁移至引流淋巴结， 在引流淋巴结 中它们将抗原递呈给 T 和 B 淋巴细胞。重要地是， 此类 DC 获得将捕获的抗原呈递给 MHC I 类分子的独特能力， 一种称为交叉呈递的过程， 该过程对于高效地引发肿瘤特异性 CTL 是 至关重要的。就这一点而论， CpG 施用已被报导可防止预防性情形下肿瘤的向外生长， 并且 还可根除小鼠中已建立的肿瘤。Nierkens， S. 等人 (Cancer 。
11、Res.68 ： 5390-5396(2008) 和 由 Roux， S. 等人 (Cancer Immunol.Immunoth.57 ： 1291-1300(2008)。 0011 然而存在关于使用 CpG ODN 的一些潜在安全性考虑， 即包括抗 DNA 抗体和自身免 疫力的诱导。此外， 当以更大量和在更长的时期中提供时它们的毒性以及其使用中涉及的 花费也是需要考虑的。 说 明 书 CN 102264373 B 3 2/6 页 4 0012 因此， 存在对其他免疫增强化合物的需要。 0013 本发明提供了减少或克服上面提及的问题。 0014 鉴于 TLR9 和其激动剂在原位肿瘤破坏后对肿。
12、瘤特异性抗原的免疫应答的诱导中 的重要作用， 本领域技术人员认为此类其他免疫增强化合物也充当 TLR9 激动剂是一个前 提。 0015 令人惊讶地， 现发现与 TLR9- 机制毫不相关的皂苷类却非常适合于在肿瘤破坏后 诱导针对肿瘤特异性自身抗原的免疫应答。甚至更出人意料地， 它们的有效性 ( 虽然通过 未知的机制 ) 似乎可与 CpG 的有效性相当或甚至更好。已发现在肿瘤内或其周围、 在肿瘤 破坏的时刻或其先后不久施用皂苷类在原位肿瘤破坏后诱导了非常显著的针对肿瘤特异 性抗原的免疫应答。 该免疫应答是长效的， 从而非常适合消除转移的细胞， 即使此类细胞已 潜伏地存在于身体中。 此外， 即使在治。
13、疗后数周以显著量有意施用相同类型的肿瘤细胞， 该 免疫应答似乎也足够强而能够预防这种肿瘤细胞的增殖。 0016 皂苷类到现在为止都只被描述为针对非自身抗原的佐剂 ； 例如用于细菌或病毒疫 苗中的佐剂。皂苷类作为用于杀伤肿瘤细胞的细胞毒素类的用途已由 Bachran， C. 等人 (Medicinal Chemistry 8 ： 575-584(2008) 描述。在 PCT 申请 WO 2008/063129 中描述了 含脂质颗粒中的皂苷类作为细胞毒素用于杀伤肿瘤细胞的用途。 0017 然而在本发明中， 它们的细胞毒性效应是无关的， 因为皂苷是与已在肿瘤破坏的 过程中被杀死的细胞组合使用。由于它。
14、们的细胞毒性效应不起作用， 因此预期无论如何不 存在对已破坏的肿瘤的效应。 此外皂苷类在化学疗法中的细胞毒性效应只在施用的时刻才 起作用。它们不建立免疫应答， 从而它们对暂时具有低代谢活性的转移细胞 ( 潜伏细胞 ) 不起作用。 0018 皂苷类在原位肿瘤破坏后诱导对肿瘤特异性自身抗原的免疫应答的作用迄今未 知并且可能因上述原因而未曾预料到。 0019 因此， 本发明的第一实施方案涉及用于原位肿瘤破坏疗法的药物组合物， 所述疗 法包括肿瘤破坏和施用免疫刺激量的免疫增强剂的步骤， 其中所述免疫增强剂是皂苷。 0020 皂苷基本上是一组植物糖苷类 (glycosides) 的通用名称， 其中皂树 。
15、(Quillaja saponaria) 皂苷是最早和最频繁使用的。 0021 粗制皂苷实际上是皂苷类的混合物， 它们共有相同的基本结构但具有不同侧链。 不同的皂苷成分主要在于它们的亲水性 / 疏水性程度有差别。 0022 HPLC是检测和从粗制皂苷混合物分离不同皂苷成分的优选方法。 几种纯化的提取 物例如 QS-7、 -17、 -18、 -21、 GPI-0100、 QuilA、 Qvac 和 BioQ 可从不同来源商购获得。 0023 优选地， 皂苷包含下列成分的至少一种 ： QS-7、 QS-17、 QS-18 或 QS-21。 0024 也优选的皂苷类是QuilA和其成分Vax Sap。
16、、 SuperSap、 GPI-0100、 QP UF 1000等。 0025 因此， 该实施方案的优选形式涉及根据本发明的药物组合物， 其中皂苷包含至少 一种下列成分 ： QS-7、 QS-17、 QS-18、 QS-21、 QuilA、 VaxSap、 SuperSap、 GPI-0100 或 QP UF 1000。 0026 皂苷的另一种有吸引力的免疫刺激形式是所谓的空免疫刺激复合物 (empty immune stimulating complex， 空ISCOMS)。 空免疫刺激复合物制剂与皂苷的不同在于它们 由皂苷、 脂质和胆固醇的混合物制成。 在其制备过程中， 形成甚至比皂苷本身。
17、更具有免疫增 说 明 书 CN 102264373 B 4 3/6 页 5 强作用的小胶束样颗粒。 0027 因此， 本实施方案的另一个优选形式涉及根据本发明的药物组合物， 在所述药物 组合物中皂苷以空免疫刺激复合物的形式存在。 0028 不用说本发明同样适用于人和兽医学领域。 0029 鉴于皂苷类和CpG ODNs的作用的不同模式， 人们会预期两者的组合施用无任何增 强作用。 0030 然而， 令人惊讶地发现皂苷和 CpG ODN 的组合使用存在强协同作用。 0031 这种预料之外的协同作用是有利的， 因为这使得当与皂苷组合施用时， 有可能使 用亚标准量的 CpG ODN。这反过来将明显地减。
18、少上文提及的 CpG ODN 使用的不利方面。就 此而论， 只要将它们与皂苷组合提供， CpG ODN 的使用将再次变得引人注目。 0032 在 US 专利 US 7049302 中皂苷与 CpG 组合的使用已被描述为用于诱导针对非自身 抗原的免疫应答的佐剂， 但因上述原因， 并不可能预料到针对自身抗原的组合效应， 更不必 说协同效应。 0033 因此， 本实施方案的更优选形式涉及此外还包含 CpG ODN 的根据本发明的药物组 合物。 0034 自 1994 年 ( 美国专利 US6429199) 以来已描述了用于免疫刺激的 CpGODN。CpG 基序基本上具有结构 5 -X1-C-pG-X。
19、2-3。已知 CpG 基序 5 -Pu-Pu-CpG-Pyr-Pyr 是 最具免疫增强作用的基序之一 (Scheule， R.K.， Advanced Drug Delivery Reviews 44 ： 119-134(2000)。它们的长度基本为 8 至 80 个碱基， 并且它们包含至少一个非甲基化的 CpG 基序。 0035 经常在不同动物物种中看到小的效率差异。仅作为示例， 人 TLR9 最优地利用 CpG 基序 G-T-CpG-T-T 来触发， 然而小鼠 TLR9 最好利用 G-A-CpG-T-T 来触发 (Krieg， A.M.， Nature Medicine 9 ： 831-8。
20、35(2003)。 0036 7 个兽医和 3 个实验室物种的最佳 CpG 基序已由 Rankin， R. 等人在 Antisense and Nucleic Acid Drug Development 11 ： 333-340(2001) 中进行了描述。有效地刺激犬 科和猫科动物免疫细胞增殖的 CpG 基序由 Wernette， CM.， 等人在 Veterinary Immunol. And Immunopath.84 ： 223-236(2002)中进行了描述。 CpG基序在家禽中的应用已由Ameiss， K.A.， 等人在 Veterinary Immunol.And Immunopa。
21、th.110 ： 257-267(2006) 中进行了描述。 0037 具有不同CpG基序的CpG ODN可容易地商购获得， 并且必要时可容易地合成它们。 可在上述出版物和实施例部分中查找到 CpG ODN 的适当用量。 0038 再次地， 如上文中所提及的， 不用说本发明同样地适用于人和兽医学领域， 虽然最 好 ( 然而非强制性的 ) 还是将使用的 CpG 基序与本发明应用的动物物种匹配。这可基于上 文中概述的出版物容易地进行。 0039 原则上， 可在不同的时刻或同时进行肿瘤破坏和免疫增强剂的施用的步骤。然而 理论上， 预期在应用肿瘤破坏之前数天或更好地一周或甚至两周或更多周用所述免疫增强。
22、 剂条件化肿瘤 ( 目的在于 “引发” 免疫系统 ) 将是优选途径。 0040 然而令人惊讶地发现， 如果在肿瘤破坏后进行免疫增强剂的施用， 并且在肿瘤破 坏后数天内， 优选在肿瘤破坏后一天内， 更优选 12 小时内， 甚至更优选 6 小时内， 更优选 2 小时内进行施用， 则免疫刺激的水平好于以相反的的顺序进行各步骤时产生的水平。 说 明 书 CN 102264373 B 5 4/6 页 6 0041 当在肿瘤破坏之前约 2 小时至破坏时刻之间进行免疫增强剂的施用时， 也获得非 常好的结果。这是因为在破坏后， 赘生肿块可能因破坏诱导的其结构的改变而更难以接近 或进入。 0042 在肿瘤破坏前。
23、2小时至肿瘤破坏后2小时之间的间隔中施用疫增强剂被称为围手 术期施用 (peri-operative administration)。 0043 因此， 本实施方案的一个优选形式涉及用于原位肿瘤破坏疗法的药物组合物， 所 述疗法包括肿瘤破坏和施用根据本发明的肿瘤增强剂的步骤， 其中所述步骤按下列顺序进 行 ： 0044 a. 肿瘤的破坏 0045 b. 免疫增强剂的施用。 0046 本实施方案的更优选形式涉及按上述顺序进行的步骤， 其中按优先次序， 在肿瘤 破坏后 24 小时、 12 小时或甚至 6 小时内施用免疫增强剂。 0047 同样地， 本实施方案的另一个优选形式涉及用于原位肿瘤破坏疗法。
24、的药物组合 物， 所述疗法包括肿瘤破坏和施用根据本发明的免疫增强剂的步骤， 其中所述步骤是 ： 0048 a. 免疫增强剂的围手术期施用 ； 0049 b. 肿瘤的破坏。 0050 关于免疫增强剂的施用部位， 应当进行下列考虑 ： 0051 优选， 将免疫增强剂直接施用入赘生性肿块。 虽然稍微次优选， 但其中在一个或多 个围绕赘生性肿块位置施用免疫增强剂的肿瘤旁施用也是可能的。另一个 ( 虽然次优选 的 ) 施用是在赘生性肿块的引流区域的皮下施用。最后， 静脉内施用 ( 优选靠近赘生性肿 块的位置 ) 是可能的。 0052 因此， 按递增的优先次序， 通过静脉内施用、 赘生性肿块的引流区中的皮。
25、下施用、 肿瘤旁施用或瘤内施用来进行免疫增强剂的所述施用。 0053 本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的药物组合物在制备用于治疗患癌症 的哺乳动物的药剂中的用途， 其中所述哺乳动物已经历肿瘤破坏。 0054 本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的药物组合物在制备用于围手术期施 用的药剂中的用途， 所述药剂用于治疗患癌症的哺乳动物， 其中所述哺乳动物将经历或已 经历肿瘤破坏。 实施例 0055 实施例 1 0056 小鼠和肿瘤细胞 0057 C57BL/6n小鼠(6至8周龄)购自Charles River Wiga(Sulzfeld， Germany)并且 将其在中心动物实验室 (Nijme。
26、gen， The Netherlands) 中在无特定病原体屏障 (barrier) 的条件下喂养。随意提供饮水和标准实验室食物丸剂， 使动物在随机分配至特定处理组之 前安置至少 1 周。根据 Nijmegen 动物实验委员会的动物饲养指南进行实验。 0058 将鼠黑色素瘤细胞系 B16F10(ATCC) 培养在完全培养基 (MEM， 5牛血清白蛋白 (Greiner Bio-one)， 100U/ml 青霉素 G 钠和 100g/ml 链霉素 (Pen/Strep)、 MEM 丙酮酸 钠 (1mM)、 NaHCO3、 MEM 维生素、 MEM 非必需氨基酸 ( 全部来自 Gibco)、 20。
27、M - 巯基乙醇 说 明 书 CN 102264373 B 6 5/6 页 7 (-ME) 中。 0059 肿瘤模型和冷冻手术 0060 将肿瘤细胞悬浮于 PBS 和基质胶 (2 1) 的混合物中， 在右股骨皮下注射 50l 总体积的 0.5*106个细胞。在肿瘤直径测量为 6 至 8mm( 通常在第 9 至 10 天 ) 时， 将其随 机分配至处理组。 在异氟烷/O2/N2O麻醉下， 使用其尖端通过持续的循环液氮流冷却的液氮 冷冻消融术系统 (CS76， Frigitronics， Shelton， CT) 进行冷冻消融术 (Cryo)。在 2 个冷冻 和消融处理循环中， 肉眼可见地冷冻肿瘤。
28、， 同时使周围健康组织保持完整。 为了监控长效肿 瘤保护的诱导， 在冷冻消融术后 40 天， 用 15*103个 B16OVA 或 B16F10 细胞再攻击小鼠。在 右肋腹于 100l PBS 中皮下注射再攻击剂。当肿瘤体积超过 1000mm3或当肿瘤突破皮肤 屏障时， 处死小鼠。 0061 佐剂注射 0062 具有完全硫代磷酸酯修饰主链的CpG 1668(5-TCCATGACGTTCCTGATGCT-S)购 自Sigma Genosys(Haverhill， UK)。 将CpG于PBS中在肿瘤旁(p.t.， 在消融的肿瘤侧， 30g 分成 2 次 10l 的注射 ) 注射。使用下列佐剂 ( 。
29、全部由 Intervet BV， Boxmeer 提供 ) ： 基于 矿物油(Marcol 52)的油包水乳剂(1)和基于非矿物油(Miglyol 840)的油包水乳剂(1) ； 使用矿物油的水包油乳剂， 使用角鲨烯的油包水乳剂 (2) ； 和使用醋酸维生素 E 的水包油 乳剂 (3) ； Matrix C 750g/ml(Isconova) ； Quil A 皂苷 (Brenntag)500g/ml ； 氢氧化铝 (Brenntag)0.75 (w/v) ； 或磷酸铝 (Brenntag)0.75 (w/v)。在本论文中， 将两种油包水 乳剂以 1 1 的比率混合， 将 3 种水包油乳剂以 。
30、1 1 1 的比率混合。将基于铝的佐剂以 1 1 的比率混合使用， 但也分开使用。肿瘤旁注射 (40l 分 2 次 20l 的注射， 空间上与 CpG-ODN注射分开)全部非微生物佐剂(或它们的混合物)。 在消融后30分钟内进行所有注 射。(1 ： Jansen 等人， Vaccine， 23， 1053-1060， 2005， 2 ： O Hagan Expert Re.Vaccines， 6， 669-710， 2007， 3 ： Rijke 等人， in Adv.Avian Immunol.Res.Eds.T.F.Davison， N.Bumstead 和 P.Kaiser 265-27。
31、1， 1995)。 0063 统计分析 0064 使用 log rank test 分析卡普兰 - 迈耶存活曲线。 0065 结果 ： 0066 如从图1的图表明确地得出的， 肿瘤破坏与作为免疫增强剂的CpGODN的施用的组 合导致在 80 天后不足 50的存活率。此外， 不存在存活曲线的显著变平 ( 图 1a)。 0067 联合肿瘤破坏与施用作为免疫增强剂的水包油、 油包水或 AlOH 佐剂都导致更小 的保护作用 ( 图 1b 和 1c)。 0068 然而， 联合肿瘤破坏与皂苷(无论其以QuilA的形式还是作为空免疫刺激复合物) 作为免疫增强剂的施用都导致在80天后超过75的令人印象深刻的存。
32、活率。 此外， 在该情 况下存在存活曲线的显著变平 ( 图 1c)。 0069 联合肿瘤破坏与 CpG 和皂苷 ( 无论其以 QuilA 的形式还是作为空免疫刺激复合 物 ) 作为免疫增强剂的组合施用都导致在 80 天后超过 90的甚至更高存活率和非常强的 存活曲线变平 ( 图 1d)。 0070 图例说明 0071 图 1. 消融术联合基于 CpG-ODN 和皂苷的佐剂后有效力的抗肿瘤免疫。单独地， 与 说 明 书 CN 102264373 B 7 6/6 页 8 CpG 组合地， 或与指定的非微生物佐剂组合地使用冷冻消融术处理右股上建立的 Bl6F10 肿 瘤。40 天后， 天然小鼠和无肿。
33、瘤小鼠在肋腹上接受利用肿瘤细胞 (15.000 个 Bl6F10 细胞 ) 的皮下再攻击。每 2 至 4 天一次监控肿瘤的大小。 0072 (A) 显示在单独的消融术， 或与 CpG-ODN 组合的消融术后阻止肿瘤向外生长的有 限保护作用的卡普兰 - 迈耶存活曲线。 0073 (B) 显示在单独的消融术， 或与混合的水包油、 油包水或铝佐剂组合的消融术后防 止肿瘤向外生长的有限保护作用或无该保护作用的存活曲线。 0074 (C)显示在单独地， 或与指定的(混合的)佐剂组合的消融术后免受肿瘤向外生长 的相对保护作用的存活曲线。基于皂苷的佐剂显示最有力的保护作用。 0075 (D) 显示当将消融术与基于皂苷的佐剂的联用与 CpG-ODN 共施用组合时额外的保 护作用的存活曲线。* p 0.05， 与冷冻消融术相比较， * p 0.001， 与 cryo/CpG 相 比较。在 3 个独立的实验中获得可比数据。 说 明 书 CN 102264373 B 8 1/2 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102264373 B 9 2/2 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102264373 B 10 。