一种转基因植物GUS报告基因组化检测的改进方法 【技术领域】
本发明涉及一种转基因植物的筛选鉴定方法，尤其是一种转基因植物GUS报告基因组化检测的改进方法，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
β-葡萄糖苷酸酶的组织化学检测法最初用在该酶作为内源性酶在哺乳动物体内的组织定位。高等植物体内不含有β-葡萄糖苷酸酶。Jefferson最早将编码该酶的基因(GUS)从大肠杆菌中克隆出来，构建进植物表达载体中用于转化高等植物，获得了转GUS基因的植物，并在植物组织中检测到该基因的表达产物-β-葡萄糖苷酸酶。从此以后，GUS被广泛地用作植物基因工程中的报告基因，用来筛选转基因阳性植株。其方法简单，且只要检测条件适当，几乎无背景干扰。
β-葡萄糖苷酸酶可将无色的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)水解生成一种稳定的5，5’-二溴-4，4’-二氯靛蓝染料，使具有GUS活性的部位呈现蓝色。目前普遍使用的GUS组化检测反应体系为：100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，0.5mM K4Fe(CN)6，0.5mM K3Fe(CN)6，10mM EDTA，0.1％Triton X-100，1.0mg/ml X-G1uc，反应温度为37℃，反应时间为24小时。长期以来，该反应体系一直为相关领域所采用。
本专利申请的发明人在多年的植物转基因研究中发现，这样的检测条件和反应体系对植物细胞有一定程度的损伤，在检测过程中经常出现有相当一部分被检测的组织块褐化，这表明这些组织细胞已死亡。由于GUS的表达受底物的诱导，因此在没有活性的细胞中，GUS的表达受到影响。这就可能造成漏检，影响了检测结果的准确性。
【发明内容】
本发明的目的在于：针对以上现有GUS组化检测方法存在的问题，提出一种可以避免对植物细胞活力伤害的转基因植物GUS报告基因组化检测的改进方法，从而提高检测地准确率。
经过反复试验，不断摸索，本专利申请发明人发现：现有GUS组化检测方法存在上述问题的原因主要有：
1、37℃温度过高。当然，如果检测温度过低(如室温)，则GUS酶活性降低，也不利于检测。反复选择试验证明，适当降低温度并适当延长时间，大多数植物细胞可保持一定的活力，且GUS酶活无明显降低。
2、检测液中100mM磷酸钠对植物细胞有一定程度的伤害，如将磷酸钠改为磷酸钾，同时适当降低其浓度，可提高植物细胞的存活力。但是，缓冲液中离子浓度过低(如20mM)会使缓冲液的缓冲能力降低，可能导致假阳性的产生。
3、氧化催化剂的浓度不够高，适当增加作为氧化催化剂的铁氰化钾和亚铁氰化钾浓度可提高检测的灵敏度。
在此认识基础上，形成了本发明的以下技术方案：一种转基因植物GUS报告基因组化检测的改进方法，包括以下步骤：
1、配制GUS组化检测液：75～85mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，1.5～2.5mMK4Fe(CN)6，1.5～2.5mM K3Fe(CN)6，8～12mM EDTA，0.08～0.012％Triton X-100，0.8～1.2mg/ml X-Gluc；
2、无菌条件下，切取待检植物组织块，浸在上述检测液中；
3、反应体系置于29～31℃环境(如水浴、恒温箱)中，保温40～60小时；
4、观察反应体系中的组织块颜色，如组织块呈现蓝色，则说明该样品为GUS转基因阳性。如果检测的组织为叶片，可用乙醇脱去叶绿素后再观察。
实践证明，采用本发明的技术方案后，可以有效避免对植物细胞的损伤，几乎不再出现有被检测组织块褐化的现象，从而大大降低了了漏检率，明显提高了了检测结果的准确性。
由于本发明突破了成规的禁锢，经周密的综合分析，采取了优化检测液配方、和检测反应条件等一系列改进技术措施，因此与现有技术相比，可以明显提高筛选鉴定转基因阳性植株的准确率。
【具体实施方式】
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例一
本实施例的转基因植物GUS报告基因组化检测用于棉花转基因研究中，可以快速筛选鉴定转基因阳性株，具体过程如下：
1、优化配制GUS组化检测液：80mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，2mMK4Fe(CN)6，2mM K3Fe(CN)6，10mM EDTA，0.1％Triton X-100，1.0mg/mlX-Gluc。用0.45μm过滤器过滤灭菌。分装保存于20℃冰箱中，有效期为6个月。
2、将收获的种子剥壳后浸于H2O230％溶液中灭菌20分钟，用无菌水清洗2-3遍，然后播种于MS培养基上。当胚根长到3cm左右时，在超净工作台中于根尖顶端分生组织部位切取1mm厚的组织块5-7块，将组织块转到0.5ml无菌管中，加20μl GUS组化检测液。
3、在30℃中保温48小时。
4、对来自转基因阳性植株的样品，均可观察到典型的蓝色反应。在显微镜下观察这些呈蓝色反应的根尖分生区切片，可以看到其基本分生组织细胞中都有染色点。
实施例二
当前，转基因抗虫棉在农业生产上得到推广应用。由于抗虫棉中含有杀虫的Bt基因和GUS报告基因，因此可用本发明的方法来进行抗虫棉种子纯度鉴定和棉田植株真伪鉴定。
种子纯度鉴定步骤与实施例一基本相同。棉田植株真伪鉴定步骤有所不同之处是：步骤2对于从棉田中取来的植物组织如叶片，应先用自来水冲洗干净，再用75％酒精消毒30秒钟，然后用2.5％次氯酸钙溶液处理15分钟，取出后用无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸去表面水分，切成2mm2左右大小的组织块，转到无菌管中，再加入GUS组化检测液，进行GUS转基因真伪鉴定。
以上实施例经多次试验，反复验证，未发现被检测组织块褐化的现象，说明有效避免了对植物细胞的损伤，检测结果准确、可靠。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。