酶制剂的制备工艺 【技术领域】
本发明涉及利用微生物技术制备工业用酶制剂，更具体指采用微生物的技术制备酶制剂。
背景技术
酶制剂工业是知识密集型的高科技产业，酶制剂的应用领域极为广泛，酶具有高效、专一反应条件温和的特点，由于它具有如此的特性可以有选择、有控制地通过特定的方式，例水解、氧化还原、裂解、化学基团转移等使被作用对象按预定设想发生化学反应，产生所需产品，酶是一种蛋白质，可完全生物降解，它是一种具有专一性和高效性的生物催化剂，酶法工艺可替代传统的化学、物理工艺，因此它具有污染少、简便、成本低的优点，例如取代化学试剂、减少工业用水、减少能源消耗、减少原材料消耗、提高生产效能。据美国化学协会统计，除医药用酶制剂外，全世界工业用酶制剂市场约20亿美元，世界酶制剂市场以平均15％的速度逐年增长，就酶制剂的应用来说，食品加工、淀粉工业、饲料工业、保健食品的用量最大，占45％，其次为洗涤剂占32％、纺织业占11％、造纸业占7％、化学工业占5％，而中国酶制剂市场以平均35％的速成度逐年增长，目前我国每年需要进口大量昂贵的工业用酶制剂，主要从丹麦、日本、美国等国家进口。酶制剂应用领域主要有纺织工业中淀粉酶应用于织物的退浆，纤维素酶用于织物的磨洗上光、过氧化氢酶用于染色前的双氧水的降解、淀粉糖工业中利用淀粉酶类从淀粉加工获得葡萄糖、麦芽糖、高果糖浆等产品，洗涤剂方面，添加在洗涤剂中蛋白酶分解蛋白污物，饲料中添加酶制剂可使饲料转化率提高，促进饲料消化等，果汁加工业利用果胶酶来分解果实中地果胶，过滤得到清澄果汁。制备工业酶制剂通常采用硫酸铵盐析的传统工艺，应用的菌种发酵单位不高，传统工艺产生三废污染(“生物学杂志”第17卷，第2期2000年4月；木霉T6木聚糖酶制剂研究等)。
【发明内容】
本发明目的提供采用微生物技术制备工业用酶制剂，该方法是利用微生物高产菌种，在发酵培养过程中产生分泌酶活性生物物质的特性，生产制造具有生物催化活性的酶制剂，该方法能克服现有技术不足，提供发酵活力高、生产工艺条件温和、缩短生产周期、减少三废。
本发明采用微生物发酵培养的方法分泌产生含有酶活性生物物质，经过精制、分离提取获得各种酶制剂。本发明采用的发酵分固体发酵和液体发酵两种。本发明首先采用的菌种为米曲霉(Aspergillus oryxae)ATCC6061、ATCC2151和黑曲霉(Aspergillus Niger)ATCC2628、Trichodema KoringiiATCC7632，菌种由国外购得。经物理、化学方法诱变菌种，先用X射线连续照射0-5次，每次离菌种20cm处照射，，照射时间为1-5分钟，存活菌种培养后用γ射线照射时，同样照射0-5次，每次离菌种30cm，照射时间为2-10分钟，经X、γ射线照射存活的菌种培养后再用紫外线照射0-5次，每次离菌种30cm处照射，照射时间为3-12分钟，照射后与NTG(N-methyl-N-Nitro-N-Nitro Soguanidine)浓度为10-1000μg/ml浸泡处理，获得高产菌种。
表1诱变技术数据类别 X γ 紫外线 NTG方法20cm/1-5分钟 30cm/2-10分钟 30cm/2-10分钟 10-1000μg/ml死灭率％99.8-99.9 99.97-99.98 99.7-99.8 99.97-99.99
本发明是通过下列步骤完成：
获得的高产菌种接种入已消毒的种子培养基中发酵，种子培养基为(重量％)葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母精0.5％，磷酸盐0.01％(磷酸盐可为磷酸胺、磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢钠、磷酸氢钾等)，加水配成所需体积，0.1MP灭菌20分钟，种子培养温度为32-42℃，培养时间为16-40小时。种子培养发酵后将所得的菌种按需要接种到固体培养基中或接种到液体培养基中发酵培养。
现对固体培养或液体培养分述如下。
1、固体发酵：
a、种子罐培养的菌种接种到固体培养基中，该培养基成分以小麦麸皮为主要原料，再根据工业酶制剂的品种不同而添加米糠、豆饼粉、无机盐等，0.1MP灭菌40分钟，采用自动固体发酵机，按照接入微生物特性调节好水份、温度、PH等进行固体发酵培养。温度控制在32-42℃，PH5-8发酵培养96-120小时。
b、通过发酵后的麯用水浸泡，然后用板框压滤，粗过滤后，再用微孔滤膜精过滤，然后用膜超过滤浓缩到一定倍数，通过无菌过滤获得高浓度的浓缩液，再经过气流干燥成粉剂成品，或通过保存剂的配合获得液体成品。
c、酶活性的测定与计算方法同液体发酵的酶活性测定与计算方法。
2、液体发酵：
采用液态罐式发酵方法，可控制发酵体系稳定，生产量大、通过优化培养条件提高目标物产量。
a、菌种筛选：种子罐培养与固体发酵相同。
b、液体发酵的培养基组分的选择：
碳源：多糖、淀粉、葡萄糖、麦芽糖等
氮源：蛋白胨、酵母浸膏、尿素以及NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3等。
无机盐包括磷酸盐、氯化盐、钠盐、镁盐等，小麦麸皮等作添加辅料。
培养基(重量％)：新型培养剂配方为麸皮水提取液3-8％、鱼肉水提取液0.5-1％、葡萄糖2-5％、谷氨酸钠0.1-0.5％、(NH4)2SO4 0.1-0.5％、KH2PO40.05-0.01％、MgSO4·7H2O 0.001-0.005％，加水配成所需体积，0.1MP灭菌30分钟
c、培养条件和提取：
发酵温度控制在32℃-42℃范围内，最佳温度36-38℃，培养基的PH为5-8，发酵时间控制在68-80小时，当培养完毕，用离心分离，培养液以及菌丝体中含大量的目的产物，过滤的残渣用H2O或对酶制剂的活力无影响的PH范围内的缓冲液浸泡，抽提、浓缩，浓缩液可通过保存剂的配合，制成液体成品，也可通过气流干燥工艺，制成粉状成品。
d、酶制剂的理化性质测定同固体发酵的酶制剂理化性质的测定。
e、酶活性的测定与计算：
i、按酶反应的最适PH范围(通常范围5-8)，配制缓冲液及配制一定浓度的底物。(如：Casein酪蛋白)
ii、调节酶反应的最适温度，通常为30-40℃，将所测样品加入到反应底物中进行酶反应，反应时间为10-40分钟
iii、当酶反应进行10-40分钟后，加入酶失活剂，例CCl3COOH，Na2CO3等，仃止酶反应。
iv、添加菲林(Folin)试剂，用比色法或用酸硷滴定法等进行酶活力的定量测定，在上述条件下，酶活性单位定义为每分钟酶液水解底物生成分解物所需的酶量。
v、以标准液浓度曲线为基准，换算出酶的单位活力。
本发明工艺的固体发酵和液体发酵工艺均采用全封闭连续提取法。
表1传统提取工艺与本发明提取工艺比较。 污染率提取周期产品收率％产品合格率％新工艺 1-5％ 72小时 70-80 98传统工艺 10-30％ 144小时 50-60 80
表2本发明工艺与常规工艺比较 项目 本发明 常规工艺 发酵周期 68小时 80小时 菌丝体重 0.432 0.286 酶蛋白量 4.8％ 3.6％
本发明方法适用制备的酶制剂有植酸酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶等。
本发明的有益效果如下：
1、本发明采用酶作为独特的生物催化剂，应用于各类工业中，它的反应条件温和，具有分解力强，改善了生产的效率，提高产品的收率。
2、本发明的提取分离是在全封闭式中进行，提高了产品收率，防止发生污染。
3、本发明应用的培养基原料均是农村中常用的，价格便宜的农产物，所以成本较低，并且操作方便，极易工业化生产。
4、采用本发明的菌种诱变使其效价提高，促进了酶制剂的产量及提高纯度降低了成本。
附图说明：
图1为本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明作进一步叙述，但不限制本发明。
实施例1制备植酸酶
种子培养经诱变筛选、鉴定得到的Aspergillus niger ATCC 2628进行植酸酶的制备。
1、种子培养基
葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母精0.5％、磷酸盐0.01％，0.1Mp灭菌20分钟，将菌种接入种子培养基。
种子培养装液量200ml/500ml三角瓶，箱式往复摇床200rpm，培养16小时，温度32C。种子发酵液稀释20倍，分光光度计430nm测定菌体光密度OD值为0.43-0.45。
2、30L液态发酵培养
新型的培养基配方为麸皮提取液5％、鱼肉提取液0.8％、葡萄糖3％、谷氨酸钠0.3％、硫酸铵0.3％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸镁0.003％，按需要体积配制消毒后，将上述种子发酵液接入培养基中。
30L液态发酵培养条件：
装液量15L，转速200rpm，通风量0.05-1.0L/L-min，培养68小时，温度为32℃。发酵液稀释10倍，分光光度计270nm测定酶蛋白量3.10-3.40％。发酵结束后的发酵液，经离心分离(3000-5000rpm)，获得清液，再经过微孔滤膜精过滤，再用超过滤浓缩方法浓缩6-10倍，最后用0.2μm膜进行无菌过滤，获得液体原体，此时可通过添加保存剂例甘油、一定的盐类等，制备成液体成品或通过气流干燥法脱水而成粉剂成品，产品收率70-80％，产品植酸酶的活性为2000μ/g。(SMAT法，日本“饲料安全法令要览”饲料添加剂一般的试验法)。上述的处理均在全封闭条件下进行分离提取。
3、固态发酵培养
固态发酵培养基：以麸皮为主要培养基，加0.1-0.2％磷酸盐，0.1Mp灭菌40分钟。将种子发酵液接入培养基中，调节好水份，进行培养。
固态发酵培养条件：装料量100g/500ml三角瓶，箱式恒温培养箱，96小时，温度32℃。发酵结束后，加200ml水进行2小时，40℃浸泡，发酵液酶蛋白测定法同液态发酵法，测定数据为酶蛋白量10.5-11.2％。提取液经过微孔膜精过滤，再用超过滤浓缩方法浓缩6-10倍，最后用0.2μm膜进行无菌过滤，获得液体原体，此时可通过添加保存剂，制备成液体成品，或通过气流干燥脱水而成粉剂成品产品，植酸酶的活性为2000μ/g(SMAT法)，产品收率70-80％。同样固态发酵处理时在全封闭条件下进行分离提取。
实施例2制备工业用蛋白酶
菌种采用诱变的Aspergillus S.P.ATCC2151进行种子培养，培养基为(重量％)葡萄糖1％、蛋白胨0.5％、酵母精0.5％、磷酸盐0.01％。种子培养条件同上，种子培养后将种子接种到液态培养基中培养，成分为(重量％)为麸皮水提取液3-8％、鱼肉水提取液0.5-1％、葡萄糖2-5％、谷氨酸钠0.1-0.5％、(NH4)2SO4 0.1-0.5％、KH2PO4 0.05-0.01％、MgSO4·7H2O 0.001-0.005％，0.1MP灭菌30分钟；培养温度为30-32C，培养时间为68小时，处理同上，种子菌体光密度0.44-0.46，成品酶活力50000μ/g(蛋白酶活力测定采用Casein-Folin法，Estabilishment；June 29/1967)，产率60-85％
固体发酵为发酵后的种子接种入固体培养基小麦麸皮加上0.1-0.2％的磷酸盐即可，发酵温度为30-32℃，发酵96小时。处理按实施例1。
实施例3制备果胶酶
菌种采用诱变的Aspergills.SP.ATCC进行种子培养，种子培养基为(重量％)为葡萄糖6.8％、蛋白胨0.5％、酵母精0.05％、磷酸盐0.01％，培养条件同上，培养后种子接种入液态培养基中，培养成分同实施例，培养温度35℃，培养时间为68-72小时，种子菌体光密度0.40-0.42，成品酶活力测定为12000μ/g(酶活力测定法按照Establishment；July 20/1978，果胶酶PLA法)。应用上述同样方法还可以制备纤维素酶、淀粉酶等。
实施例4制备其它的工业酶
采用不同的菌种诱变成高产菌种来制备不同的工业酶制品。
1、材料与方法：
1-1、诱变筛选技术：通常应用可购得的Aspergillus nigerATCC2628，Aspergillsp.ATCC2152，AspergillusoryzaeATCC6061，Trichoderma koringii ATCC7632.等原始菌种进行物理与化学诱变的优化筛选技术，已培育鉴定出具有高表达能力的生产菌种。
表1诱变技术数据 类别 紫外线 x-线 γ-线 NTG 方法30cm/2-10min 20cm/1-5min 30cm/2-10min 10-1000μg/ml 死灭率％99.7-99.8 99.8-99.9 99.97-99.99 99.97-99.99
1-2、培养基
1-2-1、斜面培养基：葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母精0.5％，磷酸盐0.01％，0.1mp灭菌15分钟。
1-2-2、种子培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母精0.5％，磷酸盐0.01％，自然pH，0.1mp灭菌20分钟。
1-2-3、30L发酵培养基：淀粉8-10％，酵母精0.5-0.8％，磷酸盐0.01％，0.1mp灭菌30分钟。
1-2-4、固态发酵培养基：以麸皮为主要培养基，加0.1-0.2％磷酸盐，0.1mp灭菌40分钟。
1-1、培养条件
1-3-1、摇瓶发酵培养条件：装液量200ml/500ml三角瓶，箱式往复摇床200rpm，培养16-40小时，温度32-42℃。
1-3-2、30L液态发酵培养条件：装液量15L，转速100-200rpm，通风量0.05-1.0L/L-min，培养68-80小时，温度为32-42℃
1-3-3、固态发酵培养条件：装料量100g/500ml三角瓶，箱式恒温培养箱，96-120小时，温度32-42℃。
1-2、全封闭式分离提取
1-4-1、工艺流程
1-4-2、生产工艺条件：发酵液经离心取得上清液，离心速度3000-5000rpm。离心液经过滤，去除所有不溶物后进行6-10倍的超滤浓缩，最后用0.2um膜无菌过滤后配合成工业用酶制剂。也可通过离心喷雾干燥或酒精沉淀后真空干燥获得工业用酶制剂。
1-5、分析方法
1-5-1、菌体生长测定：发酵液用0.5mol的磷酸盐缓冲液稀释20倍，分光光度计430nm测定菌体光密度。
1-5-2、酶蛋白含水量量测定：发酵液用0.5mol的磷酸盐缓冲液稀释10倍，分光光度计270nm测定酶蛋白含量。
1-5-3、pH测定：818型酸度计测定。
2、中试结果
表-2种子发酵稳定培养数据 批号菌体密度430nm培养时间hrs. pH 1 0.453 48 5.67 1 0.443 48 5.65 2 0.434 50 5.75 2 0.435 50 5.70 3 0.438 49 5.69 3 0.440 49 5.68
表-3 30L发酵稳定培养数据 批号酶蛋白表达量％培养时间hrs. pH 1 3.45 58 5.7 1 3.42 59 5.5 2 3.34 60 5.5 2 3.35 59 5.7 3 3.12 62 5.9 3 3.10 61 5.8
表-4 固态发酵稳定培养数据 批号酶蛋白表达量％培养时间hrs pH 1 10.5 88 5.8 1 10.3 90 5.7 2 10.8 96 5.9 2 10.5 94 5.7 3 11.2 120 5.6 3 11.1 122 5.8
3、质量指标
工业用酶制剂已经取得30L发酵和酶的分离，纯化的工艺条件，该技术实验重复性好，产品质量稳定，可靠性高。
表-5 工业用酶制剂产品的国际水平质量指标 项目 指标细菌总数(个/g) 50000以下外观 淡黄色粉末或棕色液体重金属 40PPM以下Pb 5PPM以下As2O3 4PPM以下