技术领域
本发明属于来源于软体动物的提取物和植物的医药配制品技术领域。
背景技术
海参，是我国的海味八珍之一，其滋补价值为人们所公认。其中海参多糖是海参中最为重要的活性成分，具有多种生理活性，根据实验研究表明，海参多糖在对抗心脑血管方面疾病的效果显著。将海参纳米化后，直接进行开发，不仅可充分利用海参多糖等重要的活性成分，同时，可将海参蛋白、脂质等成分共同进行充分利用。
三七为云南南部特产的人参属植物，根茎肉质如姜块状，民间用于治疗跌打损伤、活血祛瘀等疾患。三七的主要功能成分是三七总皂苷，在医药保健领域有广泛的应用，医药企业利用三七这种特殊的功效，研制开发了很多如云南白药、血塞通系列、复方丹参滴丸、片仔癀等知名药品。其中，以三七总皂苷为原料制成的药物通称“血塞通”，目前市场上有血塞通粉针、血塞通片、血塞通胶囊、血塞通颗粒等。血塞通是全国医院急诊科室必备中成药，也主要用于心脑血管方面的疾病。
现代科技发展已经确定了海参和三七的活性成分和对人体的作用，而且有相当数量的药品、保健品生产和上市。但是目前对于利用海参和三七等各自的特点进行复配能否起到更为有利人体健康作用，是当前重要研究课题。
海参复方制剂，目前市场基本还属于空白，仅有少数如专利200710114414.7复方海参糖肽口服液，其是利用海参，配以蜂王浆以及中药提取液而开发的一种复方海参口服液，其针对人群不清，效果不明确。
发明内容
本发明的目的在于利用低分子化后的海参纳米粉，直接配以三七皂苷提取物，开发一种比单用海参或三七及其制品更好治疗和保健效果的复方制品。
本发明的技术方案是将海参经胶化、冷冻干燥、粉碎至纳米级颗粒，而后与三七皂甙提取物混合而成。具体步骤为：
(1)原料处理：将鲜活海参剪开，取出内脏，将其分别充分清洗干净，可以仅是用海参体壁，也可以连同海参内脏一起绞碎，置于密闭容器中。原料也可以采用各种形式的海参制品，如干海参、半干海参、盐渍海参等，将其发制好清洗干净置于密闭容器中。原料鲜活海参、干海参、半干海参或盐渍海参为海刺参、叶瓜参等品种的制品。
(2)加热胶化：加热，温度为70～130℃，时间为1min～20h。优选100～105℃，1h。
(3)冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分小于10wt％。为了利于后续的粉碎过程，干燥后得水分越低越好，优选水分小于3wt％。
(4)粗粉碎：将冷冻干燥后的海参进行粗粉碎。粗粉碎选择的设备以功率大的为佳，粉碎时间很短，一般在1～20min内可以得到细度为10～300目不等的海参粉。
(5)超微粉碎：将粗粉碎的海参粉用气流粉碎机进行超微粉碎，粉碎细度为100～3000目的海参超微粉。
(6)纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为4～20h，优选10～12h，细度可达到10～1000nm。其中用X-射线检测粒度分布，在0～300nm范围，它的平均粒径是100～200nm。
(7)纳米海参粉与三七皂甙提取物按照海参∶三七为99～80wt％∶1～20wt％的比例进行混合。三七皂甙提取物为市售的商品。
(8)混合后即可制成各种制剂，如胶囊、片剂、冲剂等。
产品为一种灰白色或浅黄色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙(以R1+Rb1+Rg1成分总含量来计算)，海参多糖含量为2.5～8.1wt％，三七总皂甙含量为0.3～14.0wt％。
本发明药效实验证明：复方海参制品高、低剂量组对大鼠静脉血栓形成均有明显的抑制作用，其抑制率分别为88.9％和81.5％；复方海参制品能降低大鼠高、低切变率时的全血比黏度，但对血浆比黏度无明显影响，说明海参粉降低血液黏度的作用主要来自对红细胞的影响，它既可降低红细胞的聚集性，又可增强红细胞的变形能力，海参粉对血液流变学的改善作用成为它的抗血栓作用的主要药理学基础之一。
复方海参制品与单纯纳米海参粉相比较进行体内、体外血小板聚集试验显示：单纯纳米海参粉有促进血小板聚集的作用；而复方海参制品对促进血小板聚集的作用不明显。本发明实验还证实：不同品种海参的抗凝血活性和抗栓活性的比较没有显著差异。
本发明利用低分子化后的海参纳米粉，直接配以三七(总皂甙提取物)，开发一种主要针对心脑血管疾病的一种效果显著的保健食品。目前的研究显示，海参多糖不仅具有抗凝功能，同时可以从骨髓动员肝细胞的能力，而三七总皂甙则可促进被动员的干细胞转化或分化为新生的心肌细胞或脑细胞，以替代因缺血而引发的心肌或脑组织的坏死。纳米海参粉和三七总皂甙复合制剂在药理作用上可起到互补和协同，海参多糖对血小板促聚的副作用，可以通过与三七总皂甙的复合剂而得以消除。纳米海参和三七总皂甙的复合制剂，能够大大提高海参或三七单一组方的药理功能，并可用于多种药用用途。
因此，与现有技术比较，本发明将的突出特点是将纳米海参和三七总皂甙合理的复配，去掉了原来单一使用所带来的一些缺陷，而取得比原来单一使用更好的保健效果。
具体实施方式
一.海参复方制品的制备
实施例1
(1)原料处理：将鲜活海刺参剪开，取出内脏，将海参体壁分别充分清洗干净，置于密闭容器中。
(2)胶化：将上述容器于70～80℃，加热20h。
(3)真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为0.1wt％
(4)粗粉碎：将冷冻干燥后的海参进行粗粉碎。得到细度为10～300目不等的海参粉。
(5)超微粉碎：将粗粉碎的海参粉用气流粉碎机进行超微粉碎，得到粉碎细度为100～3000目的海参超微粉。
(6)纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为4h。
(7)纳米海刺参纳米粉与三七皂甙提取物99％∶1％的质量比例进行混合。三七皂甙提取物为南京泽朗医药科技有限公司生产。
产品为一种灰白色粉末，其主要活性成分为海参多糖7.28wt％，三七总皂甙(以R1+Rb1+Rg1成分总含量来计算)0.3wt％。混合后粉剂制成胶囊。每囊0.3克。
该配方的复方海参制品进行了对血栓及血液流变学的影响的实验，结果见下部分海参复方制品对动物的凝血、抗栓效果。
实施例2
(1)原料处理：将鲜活叶瓜参剪开，取出内脏，将其分别充分清洗干净，叶瓜参体壁和内脏一起绞碎置于密闭容器中。
(2)胶化：将上述容器于90～95℃，加热6h。
(3)真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为3wt％
(4)粗粉碎：将冷冻干燥后的海参进行粗粉碎。得到细度为10～300目不等的海参粉。
(5)超微粉碎：将粗粉碎的海参粉用气流粉碎机进行超微粉碎，得到粉碎细度为100～3000目的海参超微粉。
(6)纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为10h。
(7)纳米海刺参纳米粉与三七皂甙提取物按照：80wt％∶20wt％的比例进行混合。
产品为一种灰白色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙(以R1+Rb1+Rg1成分总含量来计算)，海参多糖含量为3.8％，三七总皂甙含量为12.5％。
(8)混合后粉剂制成胶囊。每囊0.3克。
产品进行了对动物体内和体外血小板聚集试验，结果见下部分海参复方制品对动物的凝血、抗栓效果。
实施例3
(1)原料处理：将鲜活叶瓜参剪开，取出内脏，将其分别充分清洗干净，叶瓜参体壁和内脏一起绞碎置于密闭容器中。
(2)胶化：将上述容器于100～105℃，加热1h。
(3)真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为3wt％
(4)粗粉碎：将冷冻干燥后的海参进行粗粉碎。得到细度为10～300目不等的海参粉。
(5)超微粉碎：将粗粉碎的海参粉用气流粉碎机进行超微粉碎，得到粉碎细度为100～3000目的海参超微粉。
(6)纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为12h。
(7)纳米叶瓜参粉与三七皂甙提取物按照90wt％∶10wt％的比例进行混合。
(8)混合后制成胶囊。每囊0.3克
该产品为一种浅黄色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙(以R1+Rb1+Rg1成分总含量来计算)，海参多糖含量为4.7％，三七总皂甙含量为6.3％。
实施例4
(1)原料处理：将盐渍海刺参剪开，用水浸泡软化后，剪开体壁，并清洗干净后，置于密闭容器中。
(2)胶化：将上述容器于105～110℃，加热0.8h。
(3)真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为5wt％
(4)粗粉碎：将冷冻干燥后的海参进行粗粉碎。得到细度为10～300目不等的海参粉。
(5)超微粉碎：将粗粉碎的海参粉用气流粉碎机进行超微粉碎，得到粉碎细度为100～3000目的海参超微粉。
(6)纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为16h。
(7)纳米海刺参纳米粉与三七皂甙提取物按照95wt％∶5wt％的比例进行混合。
产品为一种浅黄色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙(以R1+Rb1+Rg1成分总含量来计算)，海参多糖含量为5.1wt％，三七总皂甙含量为2.3wt％。
混合后按照原料∶辅料为2∶1的比例，制成片剂。每片0.2克。
实施例5
(1)原料处理：将干制叶瓜参泡软后剪开，清洗干净后，水发，置于密闭容器中。
(2)胶化：将上述容器于110～120℃，加热0.6h。
(3)真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为7wt％
(4)粗粉碎：将冷冻干燥后的海参进行粗粉碎。得到细度为10～300目不等的海参粉。
(5)超微粉碎：将粗粉碎的海参粉用气流粉碎机进行超微粉碎，得到粉碎细度为100～3000目的海参超微粉。
(6)纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为18h。
(7)纳米叶瓜参纳米粉与三七皂甙提取物按照海参∶三七为85wt％∶15wt％的比例进行混合。
产品为一种浅黄色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙(以R1+Rb1+Rg1成分总含量来计算)，海参多糖含量为2.56wt％，三七总皂甙含量为3.9wt％。
混合后按照原料∶辅料为1∶1的比例，制成冲剂。
实施例6
(1)原料处理：将水发海刺参剪开，置于密闭容器中。
(2)胶化：将上述容器于120～130℃，加热0.2h。
(3)真空冷冻干燥：将胶化后的海参进行冷冻干燥，水分为9wt％
(4)粗粉碎：将冷冻干燥后的海参进行粗粉碎。得到细度为10～300目不等的海参粉。
(5)超微粉碎：将粗粉碎的海参粉用气流粉碎机进行超微粉碎，得到粉碎细度为100～3000目的海参超微粉。
(6)纳米粉碎：将经过气流粉碎的海参超微粉用高能球磨粉碎机进行纳米化粉碎，粉碎时间为20h。
(7)纳米海刺参粉与三七皂甙提取物按照97wt％∶3wt％的比例进行混合。
产品为一种浅黄色粉末，其主要活性成分为海参多糖和三七总皂甙(以R1+Rb1+Rg1成分总含量来计算)，海参多糖含量为3.9wt％，三七总皂甙含量为1.1wt％。
混合后按照原料∶辅料为1∶1的比例，制成冲剂。
二.海参复方制品对动物的凝血、抗栓效果
1.复方海参制品对大鼠下腔静脉血栓形成的影响：
SD大鼠30只，雄性，体重180～220g，随机分为3组，即生理盐水(NS)组、
复方海参制品高剂量组、复方海参制品低剂量组。20％乌拉坦ip 1g·kg-1麻醉。按Rayers氏法，于正中切开腹壁，分离下腔静脉，并于左肾静脉下方预置丝线备结扎用。NS组、复方海参胶囊高、低剂量组分别灌胃给予NS和药物两周，并于末次给药1小时后结扎下腔静脉，关闭腹腔。结扎后4小时重新打开腹腔，于结扎线下方2厘米处夹闭血管，同时夹住段内主要静脉侧枝并用注射器吸尽静脉内残血，纵行剖开管腔，观察有无血栓形成，若有血栓形成，则于烤箱内60℃烘20分钟称其干重，记录血栓形成动物数和血栓干重。计算血栓形成率(血栓形成动物数/受试动物数)及血栓干重抑制百分率。
复方海参制品高、低剂量组均有明显的抑制大鼠静脉血栓形成作用，其抑制率分别为88.9％和81.5％。结果见表1：
表1复方海参制品抗大鼠静脉血栓形成实验结果(n＝10)
***P＜0.001与生理盐水组比较
2.复方海参制品对血液流变学的影响：
SD大鼠30只，雄性，体重180～220g，随机分为3组，即生理盐水(NS)组、复方海参制品高剂量组、复方海参制品低剂量组。除NS组灌胃等量NS外，其余给药组灌胃给药两周，末次给药后1小时，乙醚麻醉动物，腹主动脉采血4.9ml，置于加有1.25％肝素0.1ml的硅化试管内，立刻用血流变仪测定高切变率与低切变率下的全血比粘度、血浆比粘度等血液流变学指标。
本研究表明复方海参制品能降低大鼠高、低切变率时的全血比黏度，但对血浆比黏度无明显影响，说明海参粉降低血液黏度的作用主要来自对红细胞的影响，它既可降低红细胞的聚集性，又可增强红细胞的变形能力，海参粉对血液流变学的改善作用成为它的抗血栓作用的主要药理学基础之一。结果见表2
表2复方海参制品对大鼠血液流变学的影响(n＝10)
*P＜0.05，与生理盐水组比较
3.复方海参制品与单纯的纳米海参粉相比较进行体内血小板聚集试验：
(1)试验设计：
大鼠分组及给药同上。除NS组灌胃等量NS外，其余给药组灌胃给药两周，末次给药1小时后腹主动脉采血，分别加入3.8％枸橼酸鈉抗凝(血与抗凝剂体积比9∶1)，以200×g离心10分钟，制备富血小板血浆(PRP)，剩余血液经1200×g离心10分钟，制备贫血小板血浆(PPP)。用PPP调PRP中血小板数至4-5×1012·mL-1，分别取PRP 200μL，加入诱导剂ADP(终浓度2μmol·L-1)，按Bron提出的比浊法测定血小板聚集率，并按下式计算对血小板的促聚率(％)。血小板聚集测定均在3小时内完。
分别按200mg∶1mL和100mg∶1mL配制高、低浓度的M粉和N粉混悬液，涡旋混合1分钟，提取其中水溶性活性成分，然后经3500rpm离心10min，取上清液，即水提液备用。
家兔心脏采血，加入3.8％枸橼酸鈉抗凝(血与抗凝剂体积比9∶1)，按体内血小板聚集试验中方法分别制备贫血小板血浆(PPP)和富血小板血浆(PRP)，取PRP 200μL，加入上述配制的海参M粉及N粉水提液10μL，再加入诱导剂ADP(终浓度2μmol·L-1)，按Bron氏法测定血小板聚集率。
(2)试验结果：
①体外血小板聚集试验结果
纳米海参粉200mg∶1mL、100mg∶1mL体外均有促进血小板聚集的作用，其促聚百分率分别为23.6％和11.2％，复方海参制品200mg∶1mL、100mg∶1mL水提物体外血小板聚集反应不明显，结果见表3：
表3纳米海参粉、复方海参制品水提物体外血小板聚集实验结果(n＝10)
*P＜0.05，与生理盐水组比较
△P＜0.05，与纳米海参粉200mg∶1mL组比较
②体内血小板聚集试验结果：
用纳米海参粉、复方海参制品粉末分别灌胃给药两周后，纳米海参粉具有促进血小板聚集的作用。高低剂量组的血小板促聚率分别为47.1％和24.3％。而复方海参制品促聚反应不明显，结果见表4：
表4纳米海参粉、复方海参制品体内血小板聚集实验结果(n＝10)
*P＜0.05，与生理盐水组比较
△P＜0.05，与纳米海参粉900mg/Kg组比较
4.不同品种海参的抗凝血活性和抗栓活性的比较：
(1)抗凝血活性的比较：雄性昆明种小鼠50只，随机分为5组：NS空白对照组、0.5g/kg纳米海刺参粉组、0.5g/kg纳米叶瓜参粉组。小鼠每日灌胃0.5g/kg不同种海参2次，NS空白对照组灌胃给予等容量NS，连续给药3日后，应用生物测定法测定凝血酶时间(TT)及复钙时间(RT)，进而比较纳米海刺参粉及纳米叶瓜参粉的抗凝活性。结果见下表5：
表5.小鼠灌胃不同海参粉3天后对TT及RT的影响(x±s)
注：***P＜0.001与NS组比较
由表5可知，小鼠灌胃给予0.5g/kg上述两种不同纳米海参粉均能明显延长凝血酶时间(TT)(p＜0.001)和复钙时间(RT)(p＜0.001)，说明上述两种纳米海参粉均具有明显抗凝活性。
(2)抗栓活性的比较：雄性昆明种小鼠60只，随机分为6组：空白对照组、血栓模型组、0.5g/kg纳米叶瓜参粉组、和0.5g/kg纳米海刺参粉组。小鼠每日灌胃给予0.5g/kg不同种海参2次，空白对照组和血栓模型组小鼠灌胃给予等容量NS。于连续给药第4日模型组及各给药组小鼠于腰背部皮下注射0.4％角叉菜胶0.1mL/10g复制血栓模型，继续给药至造模后48h测量鼠尾全长及黑尾长度，计算黑尾长度％。以模型组黑尾长度％为基准，计算各给药组黑尾长度％抑制％(血栓形成抑制％)，比较不同海参粉的抗栓作用。
结果见下表6：
表6.小鼠灌胃不同品种纳米海参粉对角叉菜胶诱发的尾部血栓形成的影响(n＝10，x±s)
注：***P＜0.001与模型组比较
由表6可知，与模型组相比，小鼠灌胃给予0.5g/kg上述两种纳米海参粉均能明显降低黑尾长度％(p＜0.001)，说明其具有抑制角叉菜胶所致的小鼠尾部血栓形成作用，即抗栓作用。
结论：不同的海参品种，在制得纳米制剂之后，在效果上没有明显的差别。