技术领域
本发明涉及中药应用的技术领域，特别涉及一种二氢杨梅素在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的应用。
背景技术
二氢杨梅素(Dihydromyricetin，DMY)是一种多酚羟基双氢黄酮醇，该化合物首次从葡萄科蛇葡萄属植物楝叶玉葡萄的叶中分离得到，后从藤茶的茎叶中再次分离得到该化合物，化学名为(2R,3R)-3,5,7-三羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮，结构式如下：
研究表明：藤茶茎叶中二氢杨梅素含量可达30％以上。
藤茶，学名显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata(Hand-Mazz)WT Wan)，是葡萄科蛇葡萄属的一种野生藤本植物，主要分布于广西、广东、云南、贵州、湖南、湖北、江西、福建等省区，集中或散生在海拔400～1300m山坡的混交林中，是极为丰富并可利用的野生植物资源。藤茶的主要活性成分具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种功效；而二氢杨梅素在解除乙醇中毒、预防酒精肝、脂肪肝、抑制肝细胞恶化、降低肝癌的发病率，提高SOD活性以及保肝护肝等方面具有特殊功效。
如公开号为CN10181221A的中国专利文献公开了一种二氢杨梅素在制备治疗胃溃疡和胃炎的药物中的用途。又如公开号为CN101023942A的中国专利文献公开了二氢杨梅素在制备预防或治疗心血管疾病的应用。经 动物实验证明，二氢杨梅素具有与阿司匹林相似的抗体内静脉血栓形成的作用，可以有效地防止血栓引发的心血管疾病。
自由基被认为是引起人体衰老和某些慢性疾病发生的原因之一，当人体内的自由基产生过多或清除过慢时，就会转而攻击各种细胞器官并使之受到损伤，从而加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，简称EC，又称Urethane)，具有遗传毒性和致癌性，2007年，国际癌症研究机构(IARC)正式将氨基甲酸乙酯归类为2A类致癌物(人类可能致癌物)。经研究发现氨基甲酸乙酯是发酵食品(面包、酸牛奶、酱油、发酵豆制品等)和酒精饮料(葡萄酒、苹果酒、中国黄酒、日本清酒等)的制备过程中的伴随产物。
肝脏是人体新陈代谢的重要器官，如果肝脏细胞受损伤，人类健康就会受到影响。因此，研制一种对氨基甲酸乙酯导致的肝脏损伤有保护作用的药物是很有必要的。
发明内容
本发明提供了一种二氢杨梅素在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的新用途，拓展了二氢杨梅素的应用领域。
一种二氢杨梅素在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的应用。
进一步，二氢杨梅素在制备由氨基甲酸乙酯诱导的肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的应用。
一种以二氢杨梅素为活性组分与制药学上可接受的附加剂组成的药物组合物在制备肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的应用，尤其是针对由氨基甲酸乙酯诱导的肝脏细胞氧化损伤的抑制剂中的应用。
所述的抑制剂可以为片剂、胶囊或饮料。
作为优选，所述的抑制剂中二氢杨梅素的有效剂量为2.5～10μg/mL。
本发明中的二氢杨梅素可以直接通过商业途径获得；
或者是通过现有的常规方法提取得到。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明首次发现了二氢杨梅素能够有效抗氨基甲酸乙酯诱导的氧化 损伤，减少活性氧的生成，是一个具有良好开发前景的化合物；
本发明为二氢杨梅素提供了新的医疗用途，拓展了一个新的应用领域。
附图说明
图1为二氢杨梅素ABTS总抗氧化能力；
图2为二氢杨梅素DPPH自由基清除能力；
图3为二氢杨梅素对氨基甲酸乙酯诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用；
图4为二氢杨梅素对氨基甲酸乙酯诱导的HepG2细胞活性氧自由基ROS(DCF荧光)生成的抑制作用；
图5为二氢杨梅素对氨基甲酸乙酯诱导的HepG2细胞线粒体膜电位(MMP)的保护作用；
图6为二氢杨梅素对氨基甲酸乙酯诱导的HepG2细胞线粒体膜脂质过氧化的保护作用；
图7为二氢杨梅素对氨基甲酸乙酯诱导的HepG2细胞谷胱甘肽含量降低的抑制作用；
图8为二氢杨梅素对氨基甲酸乙酯诱导的HepG2细胞核损伤的抑制作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1二氢杨梅素片剂
按照质量分数：
二氢杨梅素50％，淀粉17.3％，乳糖25％，交联羧甲基淀粉钠7％，硬脂酸镁0.7％。
按照上述配方的质量分数，将二氢杨梅素75克，淀粉25.95克溶解于150克水中，喷雾干燥制成二氢杨梅素微胶囊颗粒。将微胶囊粒与乳糖37.5克、交联羧甲基淀粉钠10.5克，硬脂酸镁1.05克混合，加入到三维运动混合机中，混合时间为15-20分钟，得到总混合物。然后直接压片共得到 1000片，每片0.15克，二氢杨梅素含量75毫克/粒。
用于成人的剂量：每天服用2次，每次1片。
实施例2二氢杨梅素胶囊
按照质量分数：
二氢杨梅素30％，明胶18％，酪蛋白磷酸肽27.5％，硬脂酸镁1.5％，D-甘露糖醇23％。
按照上述配方的质量分数，将二氢杨梅素30克,明胶18克，溶解于150克水中，喷雾干燥制成二氢杨梅素微胶囊颗粒。27.5克酪蛋白磷酸肽，23克D-甘露糖醇，1.5克硬脂酸镁和微胶囊颗粒放入多位混合机充分混合均匀，制成湿粒，过20目筛，干燥，整粒，用胶囊充填机分装制成胶囊。250毫克/粒，二氢杨梅素含量75毫克/粒。
用于成人的剂量：每天服用2次，每次1粒。
实施例3二氢杨梅素饮料
按照质量分数：
二氢杨梅素0.375％，柠檬酸0.1％，蜂蜜4.35％，阿斯巴甜1.5％，香草香精0.05％，水93.625％。
按照上述配方的质量分数，将37.5克二氢杨梅素，10克柠檬酸，435克蜂蜜，150克阿斯巴甜，香草5克香草香精，9362.5克水混合均匀，煮沸，无菌灌装饮料瓶即得。每瓶200mL，二氢杨梅素含量75毫克/瓶。
用于成人的剂量：每天服用2次，每次1瓶。
性能测试
通过抗氧化实验测定二氢杨梅素的体外抗氧化作用
(1)ABTS实验
ABTS[2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)]法可用于测定生物样品的抗氧化能力。ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS·+，若受试物能与ABTS·+发生反应而使反应体系褪色，则提示受试物具有降低ABTS·+自由基的活性。
配制ABTS·+工作液，在700μL ABTS·+工作液中加入20μL含二氢杨梅素的样品液，充分混合，室温条件下反应6min(避光)，测定734nm下的吸光度Ai，以等量的双蒸水代替样品液做空白，记其吸光度为A0。以Trolox(CAS号为53188-07-1)作为阳性对照。
ABTS·+自由基清除率(％)＝[(A0-Ai)/A0]×100％
由图1可知，二氢杨梅素的总抗氧化能力在0-20μg/mL范围内呈剂量依赖性增长，自由基清除率为50％时，所需二氢杨梅素剂量为8.44μg/mL。
(2)DPPH实验
作为一种稳定的自由基，DPPH可以捕获(“清除”)其他的自由基。因此通过加入DPPH后观察某一化学反应的速率是否减慢，作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。由于DPPH自由基在以517nm为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。利用这一特性可以直观地检测反应的过程，通过记录DPPH在在517nm吸光度值可以得到初始自由基的量。
在1.5mL的离心管中依次加入700μL、0.1mM DPPH溶液和20μL含二氢杨梅素的样品液，充分混匀，在暗室室温条件下反应，30min后在517nm波长处测吸光值，记为Ai；试管中加入700μL DPPH溶液和20μL水，混合后在黑暗处放置30min，在517nm下测定其吸光度值，记为A0作为空白对照。
DPPH自由基清除率(％)＝[(A0-Ai)/A0]×100％
由图2可知，二氢杨梅素抗氧化能力在0-10μg/mL范围内呈剂量依赖性增长，自由基清除率为50％时，所需二氢杨梅素剂量为4.08μg/mL。
二氢杨梅素对氨基甲酸乙酯诱导的肝脏细胞氧化损伤的保护作用
(1)细胞存活率测定(MTT法)
采用MTT法检测细胞的存活率。选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，将细胞接种到96孔细胞培养板中(浓度为4×103个细胞/孔)，孵育24h后；分别用2.5μg/mL和5μg/mL的二氢杨梅素预处理24h，再用62.5 mM氨基甲酸乙酯处理HepG2细胞24h，然后用MTT(0.5mg/mL)孵育4h。生成的沉淀物溶解于150μL的DMSO中，用酶标仪检测490nm处的吸光度。
细胞存活率(％)＝[A样品/A空白]×100％
由图3可知，2.5μg/mL和5μg/mL剂量的二氢杨梅素溶液作用于HepG2细胞(分别记为62.5EC+2.5DMY和62.5EC+5DMY)，与氨基甲酸乙酯组(记为62.5mM EC)相比，细胞数量明显增多，细胞存活率分别增加了14.6％和9.8％。上述实验结果证实了氨基甲酸乙酯对肝脏细胞氧化损伤具有防护作用。
(2)细胞内ROS水平检测(DCF荧光)
利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光强度就可以知道细胞内活性氧的水平，DCF荧光越强，ROS越多。
选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，以4x104个/孔的密度接种于12孔板中，置培养箱中培养24h后吸出培养基，分别加入终剂量为2.5μg/mL和5μg/mL的二氢杨梅素，再用氨基甲酸乙酯(62.5mM)处理肝脏细胞24h，用PBS洗2次，加入10μM的DCFH-DA染色30min，染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，并计算平均光密度值。
由图4可知，氨基甲酸乙酯能引发HepG2细胞产生大量的活性氧自由基ROS(与正常对照组相比，荧光强度为196.36％)；剂量为2.5μg/mL和5μg/mL二氢杨梅素溶液均能显著降低细胞内ROS水平，细胞ROS荧光强度分别降低了40.81％(62.5EC+2.5DMY)和28.06％(62.5EC+5DMY)。上述结果表明二氢杨梅素溶液可以减少胞内ROS生成和积累，从而干预肝脏细胞的氧化损伤。
(3)细胞线粒体膜电位MMP水平检测
选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛 血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，以4×104个/孔的密度接种于12孔板中，置培养箱中培养24h后吸出培养基，分别加入终剂量为2.5μg/mL和5μg/mL二氢杨梅素溶液作用24h，再用氨基甲酸乙酯(62.5mM)处理肝脏细胞24h，用PBS洗2次，然后采用线粒体膜电位探针罗丹明123(RH123)荧光探针进行染色，37℃孵育30min，将染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，然后分析其荧光强度。
线粒体膜电位变化与活性氧自由基(ROS)的产生相关联。线粒体是细胞中制造能量的结构，它与细胞的活力密切相关，线粒体膜电位能有效反映细胞内线粒体的功能状态。由图5可知，与对照组(control)相比，经62.5mM氨基甲酸乙酯作用HepG2细胞24h，细胞膜电位显著降低(荧光强度52.68％)，2.5μg/mL和5μg/mL剂量的二氢杨梅素均能显著抑制氨基甲酸乙酯诱导的细胞膜电位的降低，细胞膜电位荧光强度分别升高到63.95％(62.5EC+2.5DMY)和77.65％(62.5EC+5DMY)。上述结果表明二氢杨梅素溶液能有效抑制氨基甲酸乙酯诱导的细胞膜电位降低。
(4)细胞线粒体膜脂质过氧化的检测
选择对数生长期的HepG2细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，以4×104个/孔的密度接种于12孔板中，置培养箱中培养24h后吸出培养基，分别加入终剂量为2.5μg/mL和5μg/mL二氢杨梅素溶液作用24h，再用氨基甲酸乙酯(62.5mM)处理肝脏细胞24h，用PBS洗2次，加入10μM的NAO染色30min，染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，并计算平均光密度值。
ROS的大量产生可能引起线粒体膜的脂质过氧化，用NAO可检测细胞膜是否脂质过氧化。由图6可知，与对照组(control)相比，经62.5mM氨基甲酸乙酯作用HepG2细胞，NAO荧光强度下降到75.40％，二氢杨梅素2.5μg/mL溶液能显著抑制氨基甲酸乙酯诱导的细胞线粒体膜脂质过氧化，NAO荧光强度分别升高到97.15％。
(5)细胞内谷胱甘肽GSH水平检测
收集对数期的HepG2细胞，将细胞接种到12孔细胞培养板中(浓度为4×104个细胞/孔)，孵育24h后；在含有2.5μg/mL和5μg/mL剂量二 氢杨梅素溶液的条件下作用24h，用氨基甲酸乙酯(62.5mM)处理HepG2细胞24h，然后用GSH荧光探针染色，37℃孵育30min，将染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照，然后分析其荧光强度。
GSH作为一种良好的细胞内氧化还原状态的调节剂，能清除氧自由基，对毒物所致的氧化损伤具有保护作用。由图7可知，与对照组(control)相比，经62.5mM氨基甲酸乙酯作用HepG2细胞24h，细胞谷胱甘肽含量显著降低(荧光强度74.83％)。2.5μg/mL和5μg/mL剂量的二氢杨梅素溶液均能有效地抑制氨基甲酸乙酯诱导的细胞谷胱甘肽含量降低，谷胱甘肽含量分别升高到83.73％(62.5EC+2.5DMY)和77.74％(62.5EC+5DMY)。上述结果表明二氢杨梅素能抑制氨基甲酸乙酯诱导的细胞谷胱甘肽含量的降低。
(6)Hoechst细胞核检测
Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低，可用于细胞核染色。Hoechst 33258为特异性DNA染料，与A-T键结合，对死细胞或经70％冷乙醇固定的细胞可立即染色。而对于活细胞的染色则是渐进性的，在10min内达到饱和。观察荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块荧光。
选择对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化单层细胞，用含10％新牛血清的RPIM1640培养基配成单个细胞悬液，以4×104个/孔的密度接种于12孔板中，置培养箱中培养24h后吸出培养基，加入终剂量为2.5μg/mL和5μg/mL二氢杨梅素溶液预处理24h，再用氨基甲酸乙酯(62.5mM)处理肝脏细胞24h，用PBS洗2次，加入10μM的Hoechst 33258染色30min，染料洗净后用荧光显微镜观察并拍照。
由图8可以观察到，正常HepG2细胞(control)细胞核体积较大，染色质是均一的，经62.5mM氨基甲酸乙酯作用HepG2细胞24h，部分细胞的染色质明显发生了浓缩，并出现凋亡小体，而加入不同剂量的二氢杨梅素(2.5μg/mL和5μg/mL)预处理24h后，染色质稍有舒展，细胞核形态有所恢复，表明二氢杨梅素能抑制氨基甲酸乙酯诱导的细胞核损 伤。
最后，本发明可用其他的不违背本发明的精神和主要特征的具体形式来概述。因此，无论从那一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。