技术领域
本发明涉及磷脂囊泡(脂质体)制剂的制造方法。特别涉及，比现有技术 效率更高地制造医疗领域中替代输血而使用的人工载氧体(血红蛋白囊泡)的 浓稠分散液的方法。
背景技术
现行的献血-输血系统作为医疗上不可缺少的技术而确立。但是伴随着 各问题(感染、保存期限、献血人数的减少等)，替代输血的输液的探索成为 紧急课题。特别是寻求实现掌握着运载氧功能的红血球的替代品。红血球中 高浓度地含有的血红蛋白(Hb)为氧结合蛋白质，所以利用该血红蛋白的人工 红血球的开发取得进展。由红血球通过精密的精制，能够从血红蛋白中将病 原体、血型物质完全地去除。作为利用血红蛋白的人工载氧体，除了对血红 蛋白加入化学修饰的形式(水溶性高分子结合型、分子内交联型、聚合型)之 外，已知有在磷脂囊泡或高分子胶囊的内水相中内包有高纯度血红蛋白的血 红蛋白囊泡等。纵观世界，领先的是修饰血红蛋白溶液的开发，虽然有到达 临床试验的最终阶段的物质，但由于出现了没有预料到的副作用而中断开发 的案例相继出现，因此不断地淘汰。这是由于基于红血球的生理学意义的结 构的缺陷。红血球为直径约8μm的中部凹陷的圆盘状粒子，具备将本来具有 毒性的血红蛋白(分子量64,500)的高浓度溶液(约35%)内包于红血球膜的结 构。只是对血红蛋白进行化学修饰并不能将血红蛋白的毒性完全地排除(非 专利文献1；酒井宏水、土田英俊.ファルマシア2009;45:23-28)。
历史上，在60年代后期公开有：作为两亲性分子的磷脂在水中自缔合形 成双分子膜，从而形成为小泡结构(磷脂囊泡、脂质体)；从70年代后期起进 行了将血红蛋白内包于该磷脂囊泡的尝试，但由于粒径控制等调制难题、得 不到充分的手段抑制血浆蛋白质相互作用导致的凝集，所以没能实用化(非 专利文献2：Djordjevich L&Miller IF.Fed Proc.1977;36:567)。然而之后，公 开有通过“挤出法,Extrusion method”用磷脂双分子膜将高浓度血红蛋白溶 液覆盖的技术，特别是实现了能够容易地通过毛细血管的粒径的控制、提高 血中分散稳定度的血红蛋白囊泡(非专利文献3：Sakai H,Hamada K,Takeoka S,Nishide H,Tsuchida E.Biotechnol Prog.1996;12(1):119-125)。将聚乙二醇配 置于粒子表面而得到囊泡粒子间的凝集抑制和分散稳定度提高的效果，将氧 实质上完全地由溶液去除，由此能够以溶液的状态在室温下长期保存(专利 文献1；日本专利第3466516号公报)。动物投药实验全面发展，作为输血替 代的安全性、运载氧功能的细节变得明确(非专利文献4：Sakai H,Sou K, Horinouchi H,Kobayashi K,Tsuchida E.J Intern Med.2008;263(1):4-15)。到目 前为止，已经研究了作为失血性休克时的复苏液的利用、作为手术中的频繁 出血中的补充给予(血液稀释)、体外循环回路(人工心肺)的补充液的利用法 等，证实有充分的运氧功能。另外，对于输血不能治疗的疾病，已经研究了 通过对心肌梗塞、脑梗塞模型的给予而防止梗塞病灶的扩大，对于带蒂皮瓣 的缺血性区域的氧供给、利用肿瘤组织的氧化进行的放射线治疗效果的改 善、作为移植用器官、培养细胞中的氧供给源的利用法等(非专利文献5： Tsuchida E,Sou K,Nakagawa A,Sakai H,Komatsu T,Kobayashi K.Bioconjug Chem.2009;20(8):1419-40)。
发明内容
发明要解决的问题
作为磷脂囊泡的制造方法，已知有超声波照射法、使用有机溶剂的反相 法、使用表面活性剂使之分散后将其透析去除的方法等(非专利文献6：「リ ポソーム」野島庄七、砂本顺三、井上圭三著、南江堂、1988)。但是，将 血红蛋白这样的功能蛋白质进行处理并且以血管内给予作为前提的制剂的 制造中，有工序中蛋白质变性、残留物质的担心，这些方法并不合适。另外， 与通常的脂质体制剂相比以大量给予作为前提的人工红血球制剂的制造方 法效率极低。作为表示人工红血球粒子性能之一的参数，使用相对于单位脂 质重量的血红蛋白重量的比。该值越高则越能够有效地运送与血红蛋白结合 的氧。因此，需要尽可能地提高粒子的内水相的血红蛋白浓度，总而言之在 高浓度(例如，35-45g/dL)的血红蛋白溶液中分散复合脂质、形成囊泡时以浓 度高的状态将血红蛋白内包成为必要条件。高浓度血红蛋白溶液的粘度高， 在其中使脂质粉末分散时粘度进一步提高。
通过所谓的挤出法(Extrusion Method)使其分阶段地(例如，Millipore公司 制造的MF滤器,按照孔径3.0μm,0.8μm,0.6μm,0.45μm,0.3μm,0.22μm 的顺序)透过孔径不同的滤器而调节粒径的情况，不仅滤器的更换麻烦，滤 器的堵塞也容易发生。为了回避这些问题，已知有使用将脂质预先在水溶液 中形成囊泡进行冷冻干燥而得到的粉末的方法(非专利文献7：Sou K,Naito Y, Endo T,Takeoka S,Tsuchida E.Biotechnol Prog.2003;19(5):1547-1552、专利 文献2；日本特愿2000‐344459号公报)。但是，将水用冷冻干燥去除的操作 需要极长的时间，另外也花费成本，在考虑到产业化的情况下，存在效率差 的问题。还混合存在有粒径小的干燥囊泡，存在其在分散于血红蛋白溶液之 后不能充分地将血红蛋白内包而残留至最后的情况。粘稠的浓稠血红蛋白溶 液中能够添加的干燥脂质的重量也由于搅拌效率、挤出法的效率而受到制 约，最多6g/dL为上限(将6g的脂质分散于1dL的浓稠血红蛋白溶液中)。为了 将搅拌后大量产生的泡沫去除而需要时间，泡沫还助长蛋白质的变性、脂质 粉末不能完全地分散而变成块残留也是问题。
另外，作为使干燥的复合脂质粉末分散于粘稠的浓稠血红蛋白溶液的方 法，使用螺桨式搅拌器的方法也存在有脂质块形成、结果需要很长时间、另 外脂质粉末水合时产生的气泡在粘稠溶液中很难消失，从而也存在使挤出法 中的滤器的通透性降低、没能完全分散的脂质块残留于滤器上而成为损失的 问题。血红蛋白的回收率最多成为20%，没有被内包的血红蛋白再度回收并 再浓缩再利用、或者不得不废弃，从而效率极低。
另外，已知有将粘稠的血红蛋白溶液-复合脂质分散液通过微射流法高 压高速地相对喷出使之撞击而产生剪切应力，由此减小粒径的方法(非专利 文献8：Beissinger RL,Farmer MC,Gossage JL.ASAIO Trans.1986;32:58-63)。 但是，该方法中剪切应力的调节是困难的，另外用于在回路中流通血红蛋白 -脂质分散液程度的流动性是必须的，因此需要将脂质的浓度降低至6g/dL程 度，结果血红蛋白的回收率低至20%程度。
另外，已知还有将脂质粉末预先用少量的水乳化、水合溶胀而形成糊剂， 将其与血红蛋白溶液高速地混合·乳化，由此将血红蛋白内包的方法(专利 文献3：日本特开2009-035517号公报)。但是也可以预想，将干燥脂质用少量 的水水合时囊泡立即形成，这样在血红蛋白混合后也不内包血红蛋白而直接 残留的可能性存在，结果不能效率良好地内包血红蛋白，血红蛋白的内包效 率降低。
本发明是鉴于以上问题而做出的，其目的在于提供磷脂囊泡(脂质体)制 剂的新的制造方法。
另外，本发明的目的在于提供比现有技术效率良好地制造特别在医疗领 域作为输血的替代而使用的人工载氧体(血红蛋白囊泡)的浓稠分散液的方 法。
另外，本发明的目的在于提供能够比现有技术格外地提高血红蛋白的回 收率、将工序简化、缩短操作时间还能够提高生物适应性的磷脂囊泡(脂质 体)制剂的制造方法。
另外，为了提高每个粒子的运载氧功能，重要的是将干燥的复合脂质粉 末与浓稠血红蛋白溶液直接地混合。因此，目的也在于如何效率良好地将“多 量的蓬松的干燥状态的复合脂质粉末”与“粘稠的浓稠血红蛋白溶液”混合， 将浓稠血红蛋白溶液内包于囊泡且调节粒径，并且提高血红蛋白的回收率。
另外，磷脂囊泡在给予至血管内后最初与血液成分接触。已知由磷脂囊 泡的脂质组成引起严重的补体活性，影响血流动力(非专利文献9：Szebeni J. Toxicology2005;216:106-121)。为了效率良好地将血红蛋白内包于磷脂囊泡， 少量添加带负电荷脂质是有效的；但已有报道指出：根据带负电荷脂质的种 类不同而激活补体活性，所以带负电荷脂质的选择变得重要。另外，作为主 要脂质成分的磷脂酰胆碱型磷脂，大多使用1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰 胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoatidylcholine,DPPC)、来源于大豆的 氢化卵磷脂(HSPC)，凝胶-液晶相转变温度分别高达41℃、50-56℃。因此， 在发现本发明的过程中，可知将含有相转变温度高的脂质的复合脂质粉末分 散于浓稠血红蛋白溶液中时，控制粒径需要强的能量(剪切应力,搅拌速度)， 要求选择相转变温度更低的脂质(30℃以下)。另外，一言蔽之，对于磷脂囊 泡，其脂质膜成分为多成分复合物，所以目的也在于各成分的选择及决定其 复合比率。
用于解决问题的方案
本发明人等考虑到上述的背景和课题，经过深入研究的结果发现一种采 用混炼操作的原理的方法作为人工红血球的调制法，其能够使干燥脂质粉末 高浓度地均匀地分散于浓稠血红蛋白溶液中且将粒径调节为较小，提高血红 蛋白的回收率且抑制操作中的血红蛋白的变性。例如，搅拌消泡装置用于制 作混炼材料(将少量的液体与大量的粉末混合而成的糊剂状的材料)而使用 (专利文献4：日本专利第3860770号公报、专利文献5；日本专利第2711964 号公报)，本发明的发明人等发现了该搅拌消泡装置具有除了简单地混合的 功能以外的功能，另外，着眼于该装置为效率良好地进行操作的装置这一点。 该装置通过使密封有想要混炼的试样的圆柱型容器同时地沿自转方向和公 转方向转动而进行行星运动，基本上能够在容器内均匀地搅拌，另外能够由 公转的离心力进行消泡，通过完全密封的容器内的混炼，能够维持无菌环境。 本发明的一实施方式中，将该装置用于制造工序的一部分，能够对血红蛋白 溶液添加·分散比现有大量的脂质粉末，能够效率良好地进行血红蛋白囊泡 分散液的调制。另外，不仅是简单地将脂质分散，也能够调节脂质分子自发 缔合形成的囊泡的粒径。另外，产生强的剪切应力而预先将血红蛋白以铁二 价的状态稳定下来，因此对结合一氧化碳或成为脱氧血红蛋白是重要的。现 在已知有：通过结合一氧化碳能够由血红蛋白纯化工序中的加热处理(低温 杀菌法)导致病毒失活的技术(专利文献6：日本专利3331433号公报)；以结合 一氧化碳的状态给予血红蛋白囊泡而制作能够得到细胞保护效果的输液制 剂(专利文献7：日本特开2007-269665号公报)或最终制成脱氧血红蛋白，由 此能够长时间保存的技术(专利文献8：日本专利3466516号公报)，但在混炼 操作中作为防止变性的方法利用则是本发明首次进行。
现有的，作为该混炼装置(搅拌消泡装置)的应用例，已知有：金／银／ 碳糊剂等的导电／电阻材料用途、玻璃/陶瓷糊剂等的封闭／绝缘材料用途、 环氧树脂等的密封材料／粘合剂用途、LED荧光剂·有机硅树脂等的成型材 料用途、墨／涂料／颜料等各种色材混合用途、齿科材料／药品软膏材料／ 化妆品基材等的制造用途、精密部件等的研磨用途等；在食品领域中蛋黄酱 等本来不相混溶的油和水的乳化等中的利用；本发明这样使脂质分子分散而 形成分子缔合体、在静脉注射用脂质体制剂的调制中使用的例子尚不存在。 可以认为其理由是，现有的所谓的脂质体制剂中，到目前为止并不需要高浓 度溶液的内包、高的胶囊化效率、大量给予。将血红蛋白内包于磷脂囊泡(脂 质体)自1977年最初公开(非专利文献2；Djordjevich L&Miller IF.Fed Proc. 1977;36:567)以来已经过34年。另外，基于容器的行星运动的混炼装置的开 发追溯至1992年以前(专利文献5；日本专利第2711964号公报)，也经过了19 年。期间，在血红蛋白囊泡的制造中使用混炼法的例子并没有，可知本发明 对于本领域技术人员来讲不是能够容易想到的。
另外，进行混炼操作的装置除了上述的搅拌消泡装置(例如，THINKY CORPORATION制造,KURABO INDUSTRIES LTD.,制造等)以外，已知还有 例如：由双轴扭曲框型叶片的自转公转运动(行星运动)导致的捏合效果(搅 拌、混炼、分散)、由涡轮叶片起到冲击和剪切作用的装置等(PD Mixer, Planetary Mixer等，INOUE MFG.,INC.制作)，所以只要有用于进行消泡的 压力调节的工序、或者抑制泡的发生的工序、或者产生充分的剪切应力的工 序，就有能够同样地利用的可能性。
对于作为主要成分的磷脂酰胆碱型磷脂，通过使用相转变温度尽可能低 的物质，复合脂质粉末的分散和囊泡化的促进、粒径的控制变得容易。另外， 为了提高内包效率，一直以来需要带负电荷脂质，使用1,5-O-双十六烷基-N -琥珀酰谷氨酸（1,5-O-dihexadecyl-N-succinyl-L-glutamate），能够提高生物适 应性(非专利文献10；Sou K,Tsuchida E.Biochim Biophys Acta 2008;1778:1035-1041)。这样，作为多成分复合物的磷脂囊泡的构成成分及其 组成的选择是极其重要的。
血红蛋白囊泡的粒径为200-300nm程度的情况下，为了透过孔径0.22μm 的灭菌滤器需要压力，所以存在不能保证无菌性的情况。此处，在工序的最 终阶段添加β-丙内酯(非专利文献11；LoGrippo GA,Wolfran BR,Rupe CE. JAMA1964;187:722-766)。本药剂在杀菌的原理上存在引起蛋白质变性的情 况，所以重要的是用上述的方法预先使血红蛋白稳定化。另外，因为β-丙内 酯在其性质上呈现出致癌性，所以有必要确认添加后的残留物水解而完全地 失活。
为了达到前述目的，根据本发明的其他的主要的观点，提供含有功能物 质的囊泡的制造方法，其特征在于，具有：(a)将前述功能物质、脂质和水收 容于筒状容器内的工序、和(b)使前述筒状容器围绕其中心轴自转并且围绕规 定的公转轴公转而将前述筒状容器内的收容物进行混炼，由此制造在以前述 脂质作为主要成分的脂质囊泡中含有前述功能物质的前述囊泡的工序。
另外，根据本发明的实施方式，提供囊泡的制造方法，其特征在于，在 前述方法中，在前述(a)的工序中收容于前述筒状容器内的前述收容物通过向 含有前述功能物质的水溶液中加入前述脂质而调制。另外，提供囊泡的制造 方法，其特征在于，前述方法中，在前述(a)的工序中收容于前述筒状容器内 的前述收容物通过使脂质粉末分散于水中而调制，所述脂质粉末是将含有前 述功能物质的前述脂质干燥而得的。另外，提供囊泡的制造方法，其特征在 于，前述方法中，前述功能物质为血红蛋白，前述工序(a)的前述水溶液如下 调制：在溶解有前述血红蛋白30～50g／dL的血红蛋白水溶液中，加入相对 于1dL前述血红蛋白水溶液为15g以上的作为前述脂质的复合脂质粉末。另 外，提供囊泡的制造方法，其特征在于，前述方法中，在前述工序(b)中，以 前述筒状容器的公转速度成为200～3000rpm，前述筒状容器的自转速度成为 100～3000rpm的方式使前述筒状容器自转和公转而将前述水溶液进行混炼。 另外，提供囊泡的制造方法，其特征在于，在前述方法中，进一步具有：(c) 在前述工序(b)之后，在前述筒状容器中的液体或糊剂中加入水或生理盐水的 工序；和(d)在前述工序(c)之后，使前述筒状容器进一步围绕前述中心轴自转 并且围绕前述规定的公转轴公转而使前述筒状容器内的液体或糊剂的粘度 降低的工序。另外，提供囊泡的制造方法，其特征在于，前述方法中，进一 步具有(e)在前述工序(d)之后，对于前述筒状容器中的液体或糊剂适用超滤膜 或超离心分离法，由此从前述液体或糊剂中将未被前述脂质内包的前述功能 物质去除的工序。
另外，根据本发明的实施方式，提供囊泡的制造方法，其特征在于，在 前述方法中，在前述工序(b)中，使前述筒状容器围绕前述中心轴自转并且围 绕前述规定的公转轴公转而将前述水溶液进行混炼的混炼处理进行数次，并 且在前述各混炼处理之间，进行使前述筒状容器的自转和公转的至少一者停 止或使前述筒状容器的自转和公转的至少一者的转动速度降低，从而进行使 前述液体或糊剂冷却的冷却处理。另外，提供囊泡的制造方法，其特征在于， 在前述方法中，前述筒状容器在其侧壁的内周面具有多个凹曲面并且相邻的 前述各凹曲面的曲率中心的位置彼此不同，由此在相邻的各凹曲面之间面向 前述筒状容器的内侧形成凸形状的突部。
为了达成前述目的，根据本发明的其他的主要观点，提供囊泡的制造方 法，其特征在于，其为制造用脂质内包功能物质的囊泡的制造方法，其具备： 工序(a)：在于水中溶解有前述功能物质的功能物质水溶液中添加脂质的工 序，前述功能性水溶液的粘度在剪切速度1000s-1的条件下、23℃时的粘度为 4cP以上；和工序(b)：通过将前述调制的混合物进行混炼而将前述功能物质 用前述脂质内包的工序，该混炼物的粘度在剪切速度1000s-1的条件下、23℃ 时的粘度为1000cP以上。
另外，根据本发明的实施方式，提供囊泡的制造方法，其特征在于，在 前述方法中，前述血红蛋白是血红素的铁为二价状态的碳氧血红蛋白或者血 红素的铁为二价状态的脱氧血红蛋白。另外，提供囊泡的制造方法，其特征 在于，在前述方法中，进一步具有：去除工序，在前述血红蛋白水溶液中加 入前述脂质之前，预先将前述血红蛋白水溶液在50℃以上进行5小时以上的 加热处理，使夹杂的不稳定的蛋白质变性，通过超滤膜或离心分离将其去除； 前述去除工序为用于在前述工序(b)中的前述混炼中减少变性蛋白质的不溶 物的产生的工序。另外，提供囊泡的制造方法，其特征在于，在前述方法中， 前述脂质含有：磷脂酰胆碱型磷脂、胆甾醇、带负电荷脂质、以及结合有聚 乙二醇的脂质。另外，提供囊泡的制造方法，其特征在于，在前述方法中， 前述脂质含有：作为磷脂酰胆碱型磷脂的1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆 碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine)、胆甾醇、作为带负电荷 脂质的1,5-O-双十六烷基-N-琥珀酰谷氨酸 (1,5-O-dihexadecyl-N-succinyl-glutamate)、以及作为结合有聚乙二醇的脂质的 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-聚乙二醇即 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine-N-Poly(oxyethylene)5000 (聚乙二醇链的分子量为5000)。另外，提供囊泡的制造方法，其特征在于， 在前述方法中，前述磷脂酰胆碱型磷脂的凝胶-液晶相转变温度为30℃以下。 另外，提供囊泡的制造方法，其特征在于，在前述方法中，该方法具有制作 脂质层状凝胶干燥脂质粉末作为前述脂质的脂质粉末制作工序，前述脂质粉 末制作工序具有：在实质上不含有溶质的纯水中以15g／dL浓度以上加入脂 质粉末制作脂质水溶液的工序，将前述脂质水溶液收容至筒状的容器中，使 该容器围绕其中心轴自转并且围绕规定的公转轴公转，由此将前述脂质水溶 液进行混炼的工序；和将进行了前述混炼的前述脂质水溶液冻结干燥而得到 前述脂质层状凝胶干燥脂质粉末的工序。
为了达成前述目的，根据本发明的其他的主要的观点，提供囊泡的制造 方法：将干燥的复合脂质粉末以15g/dL以上的浓度与包含想要内包于囊泡的 功能物质的水溶液进行混炼，由此使脂质分子分散于水溶液中，构成由脂质 分子自发地缔合形成的囊泡，同时将功能物质内包并且通过混炼所产生的剪 切应力控制粒径。
另外，根据本发明的其他的主要的观点，提供血红蛋白囊泡的制造方法， 其特征在于，将干燥的复合脂质粉末(15g/dL以上)与浓稠血红蛋白水溶液 (30-50g/dL)进行混炼，使脂质分子分散于血红蛋白溶液中，构成由脂质分子 自发地缔合形成的囊泡，将血红蛋白内包于囊泡，由此血红蛋白内包效率成 为60%以上，构成血红蛋白囊泡的血红蛋白与复合脂质的干燥重量比超过 1.2，并且通过混炼所产生的剪切应力将囊泡的平均粒径调节至400nm以下。
另外，根据本发明的实施方式，提供囊泡或者血红蛋白囊泡的制造方法， 其特征在于，在前述方法中，使用使密封有试样的圆柱型容器围绕公转方向 和自转方向同时转动的行星运动，边通过离心力将干燥的复合脂质粉末水合 时产生的气泡排除边均匀地进行混炼。
另外，根据本发明的实施方式，提供囊泡和血红蛋白囊泡的制造方法， 在前述方法中，公转的转速为200-3000转/分钟、自转的转速为100-3000转/ 分钟，另外作为通过混炼操作得到的粘稠的囊泡糊剂的处理法，包含如下操 作：添加水或者生理盐水，使之再度围绕公转方向和自转方向同时地转动将 糊剂分散而制成具有流动性的液体，使用超滤膜或者超离心分离法去除未被 内包的功能物质或血红蛋白。
另外，根据本发明的实施方式，提供血红蛋白囊泡的制造方法，其特征 在于，前述方法中，浓稠血红蛋白溶液中包含的血红蛋白的血红素的铁为二 价状态，通过制成为结合有作为气体分子的一氧化碳的碳氧血红蛋白、或者 没有结合气体分子的脱氧血红蛋白，在抑制了由混炼操作所产生的剪切应 力、热导致的血红蛋白变性的状态下进行操作。
另外，根据本发明的实施方式，提供血红蛋白囊泡的制造方法，其特征 在于，在前述方法中，预先将使用的浓稠血红蛋白溶液在60℃进行10小时以 上的加热处理，使夹杂的不稳定的蛋白质变性而通过超滤膜或离心分离将其 去除，由此降低在其后的与复合脂质粉末的混炼操作中的剪切应力下的、变 性蛋白质的不溶物的产生。
另外，根据本发明的实施方式，提供囊泡和血红蛋白囊泡的制造方法， 其特征在于，在前述方法中，复合脂质干燥粉末的脂质组成由磷脂酰胆碱型 磷脂、胆甾醇、带负电荷脂质、结合有聚乙二醇的脂质构成。
另外，根据本发明的实施方式，提供囊泡和血红蛋白囊泡的制造方法， 其特征在于，在前述方法中，使用复合脂质组成如下的复合脂质粉末：由作 为磷脂酰胆碱型磷脂的1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱、胆甾醇、作为 带负电荷脂质的1,5-O-双十六烷基-N-琥珀酰基-谷氨酸、以及作为结合有聚 乙二醇的脂质的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-聚乙二醇5000(聚 乙二醇链的分子量为5000)构成。
另外，根据本发明的实施方式提供一种方法：在前述方法中，对于作为 干燥复合脂质的主要成分的磷脂酰胆碱型磷脂，置换为凝胶-液晶相转变温 度为30℃以下的磷脂酰胆碱型磷脂，由此容易进行囊泡和血红蛋白囊泡制造 中的复合脂质的分散以及粒径的控制。
另外，根据本发明的其他的主要的观点，提供一种方法：在实质上不含 有溶质的纯水中以15g/dL浓度以上加入干燥复合脂质粉末，使容器同时地围 绕自转方向和公转方向转动，由此边排除气泡边均匀地进行混炼，制作脂质 层状凝胶；以及将其冷冻干燥而制作脂质层状凝胶干燥脂质粉末的方法。
发明的效果
根据本发明，血红蛋白囊泡的制造能够比以往短时间并且高收率地进行 调制。可知：并非只是简单地将脂质粉末与浓稠血红蛋白溶液均匀地进行混 炼，通过该操作脂质分子分散于血红蛋白溶液中，自发地再构成的脂质双分 子膜的高级结构(脂质体胶囊)的内水相中内包有血红蛋白，能够将血红蛋白 囊泡的粒径调节为最适值，作为整体，能够超乎想象的简化操作工序。另外， 除了血红蛋白以外的功能性蛋白质、低分子化合物的内包、囊泡的制作法、 脂质凝胶的制作法，制造效率的提高也变得可能。
需要说明的是，本领域技术人员通过参照例示该发明的原理的以下的实 施方式的说明和附图，将更加明确除了上述以外的本发明的特征和显著的作 用、效果。
附图说明
图1为本发明的一实施方式的混炼装置的示意图。
图2为混炼装置的主要部分示意图。
图3为筒状容器的截面图的例子。
图4为筒状容器的截面图的例子。
具体实施方式
接着，对于本发明的一实施方式进行说明。
作为本实施方式的对象的血红蛋白囊泡，有如下形式(血红蛋白囊泡)： 在由以磷脂作为主要成分的脂质双分子膜构成的磷脂囊泡(脂质体)中内包有 血红蛋白。另外，还包含在由亲水性高分子和疏水性高分子共聚而成的表面 活性剂所形成的胶囊(polymersome)中内包有血红蛋白的形式。血红蛋白溶液 也可以为来源于人献血血液、来源于家畜、或者基因重组血红蛋白。虽然基 本上为球状蛋白质的血红蛋白在蛋白质中是稳定的，然而氧合血红蛋白通过 实时地自动氧化而变化成高铁血红蛋白，另外本实施方式的混炼装置(搅拌 消泡装置：同时地进行自转和公转的装置)中存在由混炼时的剪切应力而放 热的情况，因此血红素的中心铁为二价的状态下，为了使血红蛋白带有耐热 性，优选预先通气一氧化碳而制成为碳氧血红蛋白(HbCO)或者完全地去除氧 而制成脱氧血红蛋白(deoxyHb)。通过将血红蛋白浓度提高至35-45g/dL，结 果，囊泡的内包血红蛋白浓度也能够提高。作为原料的浓稠血红蛋白溶液用 超滤膜反复透析后进行浓缩，为了提高其效率，防止超滤膜的堵塞是必要的。 另外，在混炼中，存在容易变性的夹杂蛋白质(由红血球中的纯化的过程中 残留的糖酵解酶、metHb还原系酶、脱羧酶等)变性不溶化而与囊泡的分离变 得困难的可能性。因此，优选预先加热处理血红蛋白(60℃,10-12小时)而将 夹杂蛋白质变性去除。为了将氧亲和度调节为与人血液的值同等，也可以添 加规定量的吡哆醛-5’-磷酸、氯离子作为变构因子。另外，为了向缺血性区 域标记氧靶标，可以完全不添加变构因子地将血红蛋白内包于脂质体。
作为表示血红蛋白囊泡的运氧效率的参数，有血红蛋白与脂质的重量 比。假设该比为约2.0，并且目标是血红蛋白的回收率成为100%，例如，40g/dL 的血红蛋白溶液1dL中溶解有40g的血红蛋白，所以添加脂质粉末20g成为目 标之一。到目前为止的研究中，对于35-45g/dL的浓稠血红蛋白溶液1dL，添 加干燥脂质粉末15g以上(优选为20-25g)进行混炼，由此得到良好的结果。
作为混炼方法，优选使用基于行星运动的公转自转式混炼装置。例如， 密封至灭菌后的不锈钢制、聚乙烯制、特氟龙（注册商标）制等的筒状容器 中，在THINKY CORPORATION制造的混炼装置(搅拌消泡装置，ARE-310) 中重复进行30次的3-6分钟的混炼(公转转数500-1500转、自转转数200-600 转)。如图1和2的示意图所示，混炼装置具有筒状容器10，具有筒状容器10 边围绕中心轴20(自转轴)自转边围绕着规定的公转轴30进行公转的结构。自 转轴20与公转轴30优选不平行而成为规定的角度θ，θ优选为30°以上且60° 以下。以下详述的各实施例中，自转轴20与公转轴30成为作为前述角度范围 的中央值的大约45°，由此如后所述能够得到良好的结果。另外，在以下的 各实施例中，即便在将自转轴20与公转轴30设为上述角度范围的情况下，也 能够得到与后述相同的结果。这样，在后述的各实施例中的筒状容器的形状、 混炼条件下，前述θ优选为前述角度范围内，但前述θ不限定于前述角度范围。 例如，通过使用具有鼓出成桶状的侧面的筒状容器，也能够将θ设为0°附近 的角度或超过60°的角度。这样，根据筒状容器的形状、其他的条件，能够 将θ的值设定在前述角度范围外，本发明不排除这种情况。另外，筒状容器 的内壁并非是光滑的圆筒，可以通过在内侧壁、底面等设置流动的阻挡物促 进混炼。例如，如图3所示，使用容器的内侧壁上设有凹凸的容器(由容器的 上方看时为切削成三叶草状的容器)时效率良好。图3为图1中的Y-Y截面图。 需要说明的是，图3所示的筒状容器10在其侧壁的内周面11上具有多个凹曲 面12并且相邻的凹曲面的曲率中心12a的位置彼此不同，由此，在相邻的各 凹曲面12之间面向筒状容器10的内侧形成凸形状的突部13。另外，如图3和 图4所示，突部13在周部上既可以为1个，也可以为2个以上。筒状容器10也 能够设置同样的突部。注意升温，也可以根据需要连同容器一起进行冷却， 冷却后再开始混炼。通过该操作，能够得到由血红蛋白溶液和复合脂质混炼 而成的牙膏样的糊剂。通常，将脂质粉末分散于水溶液时，泡沫消失需要花 费时间，如果使用本实施方式的方法，则通过由公转产生的离心力泡沫消失， 因此得到的糊剂中几乎确认不到有泡沫。得到的糊剂的处理中使用同一装 置。向糊剂中添加纯水或生理盐水进行密封，进一步使用前述装置在同样的 条件下混炼1分钟左右时，糊剂分散而成为具有流动性的血红蛋白囊泡分散 液，后续的操作变得简便。存在不能通过混炼而完全分散的脂质、变性不溶 化的蛋白的情况下，在该阶段通过弱的离心分离操作(2000-5000g程度)、滤 器过滤而将其去除。为了去除未内包血红蛋白，也可以将得到的血红蛋白囊 泡分散液进行超滤膜处理(截留分子量1000kDa)或者通过超离心分离(50000g 程度)使之沉降而去除上清，将沉淀物再分散于生理盐水中。对于得到的血 红蛋白囊泡，进行血红蛋白的回收率、平均粒径、成分浓度测定。根据混炼 条件的不同，血红蛋白的回收率为50-70%、平均粒径为200-400nm、血红蛋 白相对于复合脂质的重量比为1.2以上。
基于行星运动的公转自转式混炼装置在现如今，由各公司贩卖有各种各 样的机种，公转转速和自转转速及其比率不同。另外，根据处理量不同(由 10mL程度至10L)，装置的规模也变化，越是大型机种转动半径越长，所以 相同转速下混炼的效果也高。因此，根据各种机种的不同最适混炼的转速不 同，大概市售有公转转速为200-3000转/分钟、自转转速为100-3000转/分钟范 围的机种，在该条件下能够进行适合于囊泡调制的混炼。但是，考虑到由发 热导致的成分的变性并且还考虑到在尽可能短时间内结束，所以公转转速优 选设为2000转以下的条件。另外，血红蛋白溶液的浓度变得越高则粘性增大 得越显著(35、40、45g/dL时分别为6、11、29cP)。剪切应力高对于粒径的控 制是重要的，使用高粘性的血红蛋白溶液从粒径的控制这一点出发是有利 的。但是，强的剪切应力下会有放热、生成更多变性蛋白的倾向。另外，血 红蛋白浓度过低时，得到的粒子所含的血红蛋白含量降低。考虑到这些情况， 血红蛋白浓度优选为35-45g/dL。血红蛋白溶液的粘度在23℃、剪切速度 1000s-1的条件下优选成为5cP以上。得到的血红蛋白囊泡分散液进行浓度调 节之后，作为CO结合体样的制剂密封在不透气的容器(玻璃容器)中，或者经 过CO光解离·氧去除操作，进行浓度调节，使用氮气泡或者人工肺等气体 更换单元以脱氧体形式密封保存。如果粒径充分地小，则能够透过孔径 0.22μm的灭菌滤器，在困难的情况下，可以将制造工序整体在灭菌环境下进 行，或者也可以在最终阶段添加规定量的β-丙内酯。该药剂的灭菌机理为与 DNA直接结合使之变性，但也存在与蛋白质结合而引起变性的情况，在为了 保护血红蛋白而将血红蛋白囊泡中溶解的氧完全地排除的状态(碳氧血红蛋 白或者脱氧血红蛋白的状态)下添加β-丙内酯时，能够一定程度抑制血红蛋白 的变性(高铁化)。
作为磷脂囊泡的复合脂质组成，优选以磷脂酰胆碱型磷脂、胆甾醇、带 负电荷脂质以及PEG-结合脂质这4种成分作为主要成分，但不限定于此，有 无限的组合以及复合比。作为磷脂酰胆碱型磷脂，为了抑制过氧化脂质的生 成，与甘油骨架的1,2位羟基形成酯键的脂肪酸优选为饱和型，除了1,2-二肉 豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DMPC)之外，有1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂 酰胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、1-棕榈酰-2- 肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(PMPC)、1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3- 磷脂酰胆碱(SMPC)；还有来源于大豆的氢化卵磷脂(HSPC)；另外，不饱和 型磷脂中，作为结合有比较稳定的脂肪酸的油酸的磷脂，优选1-硬脂酰-2- 油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(SOPC),1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (POPC)等。这些磷脂中，如果考虑得到的囊泡的稳定性、回避被巨噬细胞捕 捉后的蓄积性这些问题，优选使用DPPC。但是，从制造的简便性的观点出 发，比DPPC的相转变温度(Tc=41℃)低的磷脂酰胆碱型磷脂从分散性、粒径 的控制观点出发而优选，可列举出例如：SMPC(Tc=30℃),PMPC(28℃), DMPC(23℃),SOPC(6℃),POPC(-3℃)等。另外，作为带负电荷脂质优选使 用1,5-O-双十六烷基-N-琥珀酰基-L-谷氨酸。目前认为：相转变温度低的磷 脂酰胆碱型脂质，得到的囊泡的结构不稳定，但需要从实际使用目的的观点 来判断稳定性是否充分。
作为与浓稠血红蛋白混炼的干燥复合脂质粉末的调制法的实施方式，可 以考虑以下的5个。(1)将各成分暂时溶解于规定的有机溶剂中、通过CRUX 法迅速地去除有机溶剂而得到的干燥粉末；(2)将各成分暂时溶解于叔丁醇、 苯中进行冷冻干燥而得到的干燥粉末；(3)使之溶解于叔丁醇、醚等有机溶剂 中后与水接触、去除有机溶剂而在水中形成囊泡，将其冷冻干燥而得到的囊 泡粉末；(4)将(1)或者(2)中得到的复合脂质粉末分散于水中制成囊泡，将其 冷冻干燥而得到的囊泡粉末；(5)将(1)或者(2)中得到的复合脂质粉末在上述 的混炼装置中水合而得到的脂质凝胶的冷冻干燥粉末；等。但是，水溶液的 冷冻干燥需要长时间，为了装置运转需要莫大的劳动力和电力成本。从效率 的方面出发，优选将(1)、(2)的操作中得到的复合脂质粉末直接使用。另外， 在本发明的实施方式中，由(1)、(2)得到的干燥复合脂质粉末直接与浓稠血 红蛋白溶液进行混炼，由此实现充分的血红蛋白内包效率、平均粒径的控制。
[实施例1]
作为复合脂质，将总计10g的1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DPPC)、胆甾醇、1,5-O-双十六烷基-N-琥珀酰-谷氨酸(DHSG)、以及1,2-二 硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-聚乙二醇5000(DSPE-PEG5000,PEG链的 分子量为5000)按照以摩尔比计成为5/4/0.9/0.03的方式溶解于叔丁醇1dL中， 加入至0.5L茄型烧瓶。接着，用干冰/甲醇混合冷却介质进行冷冻，在冷冻干 燥装置(东京理化制FD-1000)中进行24小时，得到复合脂质粉末。对于该粉末， 将10g加入至特氟龙制的THINKEY CORPORATION制的圆柱状容器(外 径:76mm、高度约93mm、内壁加入有凹凸，从容器上方看时成为三叶草形)， 添加高纯度人血红蛋白溶液(一氧化碳结合-HbCO体、45g/dL、0.4dL、pH7.4)。 此时的血红蛋白(18g)：脂质(10g)的重量比成为1.8:1。接着，盖上内盖而密 封，用混炼装置(自转公转搅拌器、THINKEY CORPORATION制、ARE-310) 以公转1500转、自转600转进行3分钟混炼处理，待冷却3分钟后，将容器内 的气相完全地用一氧化碳气体置换而密封。接着，再次在公转1500转、自转 600转下重复3分混炼·3分冷却的操作，进行总计30次(总计90分钟)的混炼处 理。此时，糊剂的温度由于混炼时的剪切应力和装置的传热上升至40℃左右， 为了抑制血红蛋白的变性CO化被认为重要。得到暗红色的粘稠且均匀的糊 剂。没有确认到任何脂质的块、泡沫。接着，添加冷却的生理盐水0.50dL， 使之转动15秒钟，降低糊剂的粘度而制成分散液。将溶液进一步用生理盐水 稀释至二倍之后，进行离心分离(3000rpm、30分钟、Hitachi公司制CF12RX)， 结果可见没有完全分散的粒径大的级分的沉淀、与一部分变性的血红蛋白的 沉淀。对于上清相，加入至超离心分离用的离心管(230mL容器)，进一步加 满生理盐水，在50,000g下进行30分钟超离心分离(Hitachi公司制CP90WX)。 检测转动前的分散液以及分离后的上清的血红蛋白浓度和体积，计算血红蛋 白的内包效率，结果得到约65%。将粒径使用HORIBA制Nanoparticle analyzer 进行检测的结果，成为约270nm。以Soret带的光谱为基准计算高铁化率，确 认为3%以下。进行超离心分离而得到的沉淀再度分散于生理盐水中，将血 红蛋白浓度调节为2.5g/dL，在2L茄型烧瓶中各加入2dL在旋转蒸发仪中转 动，边向内部通入空气边由外部照射卤素灯45分钟，使CO气体光解离（light dissociate），转换为结合有氧的血红蛋白。将得到的溶液再度进行超离心分 离，将沉淀分散于生理盐水中，将血红蛋白浓度调节为10g/dL。分散液的脂 质浓度为6.8g/dL，血红蛋白相对于脂质的重量比为1.5。分注至药瓶中，用 丁基橡胶制的盖密封，进行氮气鼓泡而排除氧将血红蛋白制成为脱氧体。之 后，以0.5%以下的浓度添加β-丙内酯，进行灭菌。
[比较例1]
如实施例1所述，使4种脂质成分溶解于叔丁醇而制成均匀溶液，进行冷 冻干燥，得到复合脂质粉末10g。将其添加至45g/dL浓度的血红蛋白溶液0.4dL 中，加入搅拌子(2cm长)，使用搅拌器(stirrer)进行24小时搅拌。但是，未分 散的脂质块大量地存在还很粘稠，所以通过现有方法即挤出法不能控制粒 径。
[比较例2]
如实施例1所述，使4种脂质成分溶解于叔丁醇而制成均匀溶液，进行冷 冻干燥，得到复合脂质粉末。将其中的5g添加至45g/dL浓度的血红蛋白溶液 1dL中，加入搅拌子(2cm长)，使用搅拌器进行12小时搅拌。可见分散的若干 脂质块，但将其阶段地通过挤出法(Extruder,Lipex Biomembrane公司制)进行 处理，按照滤器孔径3.0-1.0-0.8-0.65-0.45-0.22μm的顺序使之透过而控 制粒径。该阶段中使用流变仪(MCR-300,Anton Paar公司制)测定25℃时的粘 度，结果为62cP(剪切速度1000s-1)、70cP(剪切速度100s-1)、98cP(剪切速度 10s-1)。回收量为0.8dL，在操作工序中损失了0.2dL。内包效率止步于20%。 将血红蛋白浓度调节为10g/dL，得到血红蛋白囊泡分散液70mL。
[比较例3]
在实施例1所述的方法中，使用结合了氧的氧合血红蛋白作为血红蛋白 溶液，按照同样的方法与复合脂质粉末进行混炼。将糊剂稀释、进行离心分 离操作((2000rpm、60分钟)，结果褐色的不溶物的沉淀大量地可见。另外， 上清的血红蛋白的高铁化率上升至10%程度。因此可以判定，通过一氧化碳 化、脱氧化的血红蛋白的稳定化是不可或缺的。
[实施例2]
使用与实施例1相同的脂质种类，将DPPC/胆甾醇/DHSG/DSPE-PEG5000 按照以摩尔比计为5/4/0.9/0.03、成为脂质总重量10g的方式溶解于叔丁醇1dL 中，加入至茄型烧瓶。接着，用液氮冷冻而进行冷冻干燥，得到复合脂质粉 末。接着，将该复合脂质加入至与实施例1中使用的相同的特氟龙制的筒状 容器中，添加0.5dL的超纯水。带负电荷脂质DHSG的重量为1.13g，相当于 1.48m摩尔，为了用等量的NaOH进行中和，添加1N-NaOH溶液0.074mL。接 着，盖上内盖而密封，用混炼装置(自转公转搅拌器、THINKEY CORPORATION制、ARE-310)进行5分钟混炼处理(公转2000转、自转800转)， 待冷却5分钟之后，再度进行5分钟混炼，进行总计10分钟的处理。对于得到 的脂质层状凝胶，用液氮冷冻而进行冷冻干燥，得到脂质凝胶的冷冻干燥粉 末。对于该复合脂质10g，与实施例1所述的方法同样地，添加HbCO溶液 0.4dL，将容器用CO密封，用混炼装置(自转公转搅拌器,公转1500转,自转 600转)进行混炼，得到血红蛋白溶液与冷冻干燥脂质粉末的混炼糊剂。将该 糊剂通过同一方法添加生理盐水并稀释，使之分散，通过离心分离将凝集块 等进行分离去除。将得到的上层液进一步超离心分离，检测未内包血红蛋白 的浓度和体积，计算血红蛋白的内包效率，结果得到约60%。使沉降的血红 蛋白囊泡再分散于生理盐水中，将血红蛋白浓度调节为10g/dL，1dL药瓶中 各密封0.50dL。用一氧化碳气体进行通气而赶出溶解氧，将血红蛋白完全地 进行一氧化碳化。之后，以0.5%以下的浓度添加β-丙内酯，进行灭菌。
[实施例3]
由Nippon Fine Chemical Co.,Ltd.制作将DPPC/胆甾醇 /DHSG/DSPE-PEG5000按照以摩尔比计成为5/4/0.9/0.03的方式溶解于有机溶 剂中，将其通过CRUX法使有机溶剂迅速地蒸发而得到的复合脂质粉末。对 于该复合脂质粉末10g，与实施例1的方法同样地，添加浓稠血红蛋白溶液 0.4dL，用混炼装置(自转公转搅拌器、THINKEY CORPORATION制、 ARE-310、公转速度1000转、自转速度400转)重复进行6分钟混炼、3分钟冷 却的操作30次。糊剂的温度上升停留在30℃左右。全部进行180分钟混炼。 该阶段中，对于得到的糊剂，用流变仪(MCR-300、Anton Paar公司制)检测25℃ 时的粘度，结果成为约2200cP(剪切速度1000s-1、23℃),约10000cP(剪切速度 100s-1、23℃),约52000cP(剪切速度10s-1、23℃)。之后，通过与实施例1所述 的方法相同的方法回收血红蛋白囊泡，结果血红蛋白的内包效率为约74%， 粒径为约280nm。通过降低公转和自转速度，混炼时间变长，但糊剂的温度 上升被抑制，可以认为是适合于降低蛋白质变性的混炼条件。
[比较例4]
调制在实施例1的复合脂质的成分中不包含DHSG的复合脂质。将总计 10g的DPPC/胆甾醇/DSPE-PEG5000按照以摩尔比计成为5/4/0.03的方式溶解 于叔丁醇1dL中，加入至0.5L茄型烧瓶。接着，用干冰/甲醇混合冷却介质进 行冷冻，在冷冻干燥装置(东京理化制FD-1000)中进行24小时，得到复合脂质 粉末。对于该粉末，将10g加入至特氟龙制的圆柱状容器中，与实施例3所述 的方法同样地，添加高纯度人血红蛋白溶液(一氧化碳结合-HbCO体、45g/dL、 0.4dL、pH7.4)。接着，与实施例3所述的方法同样地，进行混炼处理。血红 蛋白的内包效率仅有26%，血红蛋白与脂质的重量比为0.94，为显著低的值。 因此可知，此次进行的将血红蛋白内包的实验中，对于提高Hb的收率而言， DHSG是不可缺少的。需要说明的是，DHSG对于血红蛋白的收率带来的影 响如上所述已经明确，但根据内包的功能物质、混炼条件，存在DHSG对于 收率的影响发生变化的可能性，本发明并不排除使用不含有DHSG的脂质。
[实施例4]
添加相对于键合有一氧化碳的血红蛋白溶液为2.5倍摩尔的吡哆醛5’- 磷酸。对于血红蛋白溶液0.4dL(45g/dL、pH7.4)，加入实施例3所述的用CRUX 法得到的复合脂质粉末10g，通过与实施例3相同的方法，用混炼装置(自转 公转搅拌器、THINKEY CORPORATION制、ARE-310、公转速度1000转、 自转速度400转)重复进行6分钟混炼、3分钟冷却的操作30次。总共进行180 分钟混炼。得到的血红蛋白囊泡的血红蛋白的内包效率为约65%，粒径为约 250nm。通过实施例1所述的方法，实施脱一氧化碳，经过脱氧操作，在1dL 药瓶中各分注0.50dL。之后，以0.5%以下的浓度添加β-丙内酯而完成灭菌。
[实施例5]
与实施例1所述的方法同样地，由Nippon Fine Chemical Co.,Ltd.制作将混 合脂质组成为DPPC/胆甾醇/DHSG/DSPE-PEG5000按照以摩尔比计成为 5/4/0.9/0.03的方式溶解于有机溶剂中、将其通过CRUX法使有机溶剂迅速地 蒸发而得到的复合脂质粉末。此处，将混合的一氧化碳结合血红蛋白溶液的 浓度减小至40g/dL。添加复合脂质粉末10g、血红蛋白溶液0.4dL，用混炼装 置(自转公转搅拌器、THINKEY CORPORATION制、ARE-500、公转速度800 转、自转速度784转)重复30分钟混炼的操作3次，进行总计90分钟的混炼。 之后，通过与实施例1所述的方法相同的方法，用生理盐水稀释、进行离心 分离(3000rpm、30min)而去除沉淀。对于上清进行超离心分离并回收血红蛋 白囊泡，将其再分散而得到血红蛋白囊泡的分散液。血红蛋白的内包效率为 约80%，粒径为约280nm。
[比较例5]
将实施例5所述的脂质的量与血红蛋白的量设为二倍而进行研究。将复 合脂质粉末20g、一氧化碳结合血红蛋白溶液(40g/dL)0.8dL收容于实施例1所 述的容器中，采用实施例5所述的方法进行总计90分钟的混炼。之后，通过 与实施例1所述的方法相同的方法，用生理盐水稀释、进行离心分离 (3000rpm、30min)而去除沉淀。对于上清进行超离心分离并回收血红蛋白囊 泡，将其再分散而得到血红蛋白囊泡的分散液。血红蛋白的内包效率减少至 约50%，所以可知收率根据容器中收容的原料的量而变化。
[实施例6]
保持比较例5所述的脂质的量与血红蛋白的量，将收容的容器替换成大 的而进行研究。将复合脂质粉末20g、一氧化碳结合血红蛋白溶液 (40g/dL)0.8dL收容至比实施例1所述的容器大的容器中(外径:90mm、高度约 108mm)，用混炼装置(自转公转搅拌器、THINKEY CORPORATION制、 ARE-500、公转速度800转、自转速度784转)重复30分钟混炼的操作3次，进 行总计90分钟的混炼。之后，通过与实施例1所述的方法相同的方法，用生 理盐水稀释、进行离心分离(3000rpm、30min)而去除沉淀。对于上清，通过 超滤膜处理(截留分子量1000kDa,Millipore公司制Biomax V screen,膜面 积:0.1m2)去除未被内包的血红蛋白，得到血红蛋白囊泡的分散液。血红蛋白 的内包效率为约75%。在转动的容器的内壁与糊剂的接触面产生最强的剪切 应力，所以可以认为接触面积大对于胶囊化效率的提高是有效的。
[实施例7]
使用比DPPC相转变温度低的PMPC作为磷脂酰胆碱型磷脂，使PMPC/ 胆甾醇/DHSG/DSPE-PEG5000按照以摩尔比计成为5/4/0.9/0.03的方式溶解于 叔丁醇中，进行冷冻干燥，得到干燥脂质粉末4g。向其中添加浓稠血红蛋白 溶液(40g/dL、0.2dL)，采用与实施例1相同的方法尝试进行血红蛋白囊泡的 制造。用混炼装置(自转公转搅拌器、THINKEY CORPORATION制、 ARE-310、公转速度1500转、600转)进行3分钟30次混炼之后，将溶液用生理 盐水稀释至4倍，进行离心分离(2000rpm、60分钟)，结果没有完全分散的粒 径大的级分的沉淀的量与实施例1相比较格外地降低。另外，粒径也被调节 至200-230nm，调节为较小。因此，可以认为使用相转变温度低的磷脂酰胆 碱型磷脂更容易制造。
[实施例8]
对于由实施例1中制作的以DPPC作为主要成分的复合脂质调制的血红 蛋白囊泡、与由实施例7中调制的以PMPC作为主要成分的复合脂质调制的血 红蛋白囊泡，进行稳定性的评价。使用大鼠的洗涤红血球作为比较。分别调 节为3g/dL的血红蛋白浓度，对于它们，进行(1)通过液氮冷冻之后融解、(2) 用蒸馏水稀释至5倍、(3)通过磷脂酶A2进行磷脂的水解、(4)进行剪切速度 1000s-1的流动二小时时的溶血率的测定。通过超离心分离使血红蛋白囊泡或 红血球沉降，由上清的血红蛋白浓度和体积计算溶血率。设为N=3，计算平 均±标准偏差。关于(1)，红血球表现出75.9±9.2%的溶血，与此相对，DPPC 系为33.7±4.7%、PMPC系为33.3±4.2%；关于(2)，红血球表现出89.0±6.6% 高的溶血，与此相对，DPPC系为低至0.9±0.4%的值，PMPC系为低至0.6± 0.4%的值。另外，关于(3)，红血球为6.9±1.3%，与此相对，DPPC系为0.9 ±0.7%、PMPC系为0.5±0.1%。关于(4)，红血球为4.8±0.3%，与此相对， DPPC系、PMPC系均为1%以下。因此，相比于红血球，DPPC系、PMPC系 血红蛋白囊泡结构均极为稳定，另外可知，DPPC与PMPC虽然相转变温度不 同，但制成血红蛋白囊泡时的稳定性没有特别的差异。
[实施例9]
作为低分子性的功能物质的模型，调制以10mM浓度溶解作为荧光物质 的5(6)-羧酸基荧光素(CF)而成的磷酸缓冲溶液(pH7.4)。由Nippon Fine Chemical Co.,Ltd.制作将DPPC/胆甾醇/DHSG/DSPE-PEG5000以摩尔比 5/4/0.9/0.03计溶解于有机溶剂中、将其用CRUX法使有机溶剂迅速地蒸发而 得到的复合脂质粉末。对于该复合脂质粉末10g，加入至实施例1所述的圆柱 状容器，添加CF溶液40mL，用混炼装置(自转公转搅拌器、THINKEY CORPORATION制、ARE-310、公转速度1000转、自转速度400转)重复进行6 分钟混炼、3分钟冷却的操作30次。在该阶段，由于得到了护手霜这样的糊 剂，用流变仪(MCR-300、Anton Paar公司制)测定25℃时的粘度，结果成为 1020cP(剪切速度1000s-1、23℃)、4600cP(剪切速度100s-1、23℃),36800cP(剪 切速度10s-1、23℃)。在得到的糊剂约1g中加入生理盐水约10mL，进行振荡 而得到囊泡分散液。进行超离心分离(100000g、1小时)而沉降囊泡，由得到 的上清的CF浓度与体积、还有超离心分离前的分散液的CF浓度与整体的体 积计算CF的内包效率，结果得到85%。囊泡的平均粒径成为800nm。粒径不 充分地小可以认为是由于：CF溶液的粘度(0.9cP程度)低于血红蛋白溶液，不 能充分地得到剪切应力。为了进一步减小粒径，需要进一步延长混炼的时间。
需要说明的是，上述示出了制造作为内包有血红蛋白的囊泡与作为模型 分子的内包有荧光物质CF的囊泡的方法，但是内包的物质不限定于血红蛋白 或CF，制造内包有各种功能物质的囊泡是可能的。例如，制造如日本特表第 2008-542360号公报所述的内包有适用于疾病的治疗、预防、诊断等的药物、 治疗剂作为功能物质的囊泡是可能的。该情况的功能物质选自例如：抗病毒 剂、抗微生物剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗肿瘤剂、抗炎症剂、放射标识剂、 放射线不透过化合物、荧光化合物、色素化合物、核酸序列、抗癌剂、细胞 增殖因子、造血因子(促红细胞生成素、G-CSF)、生理活性物质等的药物。 另外，作为将它们内包的脂质，也可以使用前述的物质，也可以使用适合于 各药物、治疗剂的其他的脂质。另外，为缺乏水溶性的功能性物质或分子量 小的功能性物质的情况下，也可以例如：通过使之吸附或者通过化学键固定 于水溶性高分子(白蛋白、明胶等)之后，将溶解有该水溶性高分子-功能性分 子的复合物的水溶液稳定地内包于囊泡。对于以下的功能物质的例子也同 样，为缺乏水溶性或分子量小的功能物质的情况下，为了将该功能物质分散 于水中，使用水溶性高分子等辅助物质，由此能够使该功能物质稳定地内包 于囊泡。另外，对于通过上述的方法在水中的溶解困难的脂溶性功能性物质， 预先混合在构成囊泡的脂质粉末中，使该混合物分散于水中，通过混炼法效 率良好地构成囊泡，这从原理上也是可能的。
[实施例10]
白蛋白能够物理性地吸附各种脂溶性功能物质而成为其载体。因此，此 处进行内包有浓稠白蛋白溶液的囊泡的调制。将实施例1所述的混合脂质10g (DPPC/胆甾醇/DHSG/PEG-DSPE以摩尔比计5/4/0.9/0.03进行混合)收容于实 施例1所述的圆柱状容器中。接着，添加来源于人血清白蛋白(Baxter International Inc.,制,25g/dL)40mL，用混炼装置(自转公转搅拌器、THINKEY CORPORATION制、ARE-310、公转速度1000转、自转速度400转)重复进行6 分钟混炼、3分钟冷却的操作30次。向得到的糊剂中加入冷却的生理盐水120 mL，再度进行1分钟混炼而降低粘性。将其进行超离心分离(50,000g、1小时) 而使囊泡沉降，而去除未被内包的白蛋白。使沉淀再分散，得到内包有白蛋 白的囊泡。
[实施例11]
进行负载有作为脂溶性的功能物质的姜黄素的囊泡的调制。在叔丁醇中 将DMPC/胆甾醇/DHSG/PEG-SDPE/姜黄素按照以摩尔比计为5/1/1/0.03/1的 比例进行加热使之溶解，将其进行冷冻干燥而得到姜黄素与脂质混合的粉 末。对于该混合粉末20g，将其收容于实施例1所述的圆柱状容器中，进一步 添加磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)0.8dL，用混炼装置(自转公转搅拌器、 THINKEY CORPORATION制、ARE-500、公转速度800转、自转速度784转) 在氮气氛下进行总计150分钟的混炼，得到负载有姜黄素的囊泡分散液。
作为抗病毒药剂的具体例，包含有磷酸奥司他韦和硫酸茚地那韦。作为 抗微生物剂包含有：环丙沙星、defotetan以及阿奇霉素这样的抗细菌剂；两 性霉素B、利霉菌素和酮康唑之类的抗真菌剂；以及异烟肼、链霉素和利福 平之类的抗结核(anitubercular)剂。也可以考虑维生素D、钙、PTH拮抗剂或 者双膦酸盐这样的、用于刺激骨的成长或者保护骨的消失的药剂。
也可以考虑将抗肿瘤剂(anti-neoplasm agents)作为用于通过本发明的传 递物质传递的药物。根据本发明，可以使用广泛的化疗剂。术语“化疗”是 指用于治疗癌症的药剂的应用。“化疗剂”是指在癌症的治疗中被给予的化 合物或组合物。这些制剂或药物根据在细胞内的它们的活性的样式、如它们 是否对细胞周期产生影响以及在哪个阶段造成影响而被分类。或者，根据直 接结合DNA的能力、插入DNA中的能力、或者通过对核酸合成带来影响而 诱导染色体和有丝分裂异常的能力的特征将制剂分类。几乎所有的化疗剂被 分为如下几类：烷化剂、代谢拮抗物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂以及 亚硝基脲。
作为化疗剂的例子，包含：噻替哌和环磷酰胺这样的烷化剂；二甲磺酸 丁酯，英丙舒凡和哌泊舒凡这样的烷基磺酸酯；苯佐替派(Benzodepa)、卡波 醌、美妥替哌和乌瑞替哌等氯丙啶;六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基蜜胺、 三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺等亚乙基酰亚胺以及 甲基三聚氰胺；番荔枝内酯(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合 成类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin;CC-1065(包括其阿多来新、卡折 来新和比折来新合成类似物)；隐藻素类(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司 他丁；duocarmycin(包括合成类似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素 (eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类，例如氯丁酸 氮芥(chlorambucil)、萘氮芥、胆磷酰胺、雌氮芥、异磷酰胺、双氯乙基甲胺、 盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮 芥；硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀 和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如烯二炔类抗生素(如加利车霉素， 尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1)；蒽环类(dynemicin)抗生素，包括 dynemicin A；二碳磷酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新抑癌菌素 发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴 霉素(authrarnycin)、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、 嗜癌霉素、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6- 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比 星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、依达比星、 麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素(nogalarnycin)、 橄榄霉素、培来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素、罗 多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比 星；抗代谢物，例如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲 叶酸、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、 6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、 6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿啶、依诺他滨、氟尿 苷；雄激素类，例如卡鲁睾酮、羟甲雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内 酯；抗肾上腺类，例如氨鲁米特、曼托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚 叶酸；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；氨苯吖啶； bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；依洛尼塞 (elfornithine)；醋酸羟吡咔唑；epothilone；依托格鲁；硝酸镓；羟脲；香菇 多糖；氯尼达明；美登木素生物碱类，例如：美登素、安丝菌素；米托胍腙； 米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔 比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK(多 糖复合物)；雷佐生；根霉素；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢菌素(尤其是T-2毒素、 verracurinA、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露 醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)； 环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷，例如：紫杉醇和多西他塞；苯丁酸氮芥；吉 西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，例如：顺铂、奥沙 利铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异磷酰胺；米托蒽醌；长春 新碱；长春瑞滨；诺安托；替尼泊甙；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希 罗达；伊拜膦酸盐；伊立替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000； 二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸，例如视黄酸；卡培他滨；以及上述任何 物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。在特别的方式中，化疗剂选自由以 下所组成的组；多柔比星、拓扑异构酶I抑制剂如托泊替康和伊立替康、以 及分裂抑制剂例紫杉醇和依托泊甙、以及抗代谢物如甲氨蝶呤以及单克隆抗 体如利妥昔单抗。
也可以考虑传递产生红血球的刺激因子，包含铁、促红素α和非格司亭。 也可以考虑用于保护骨髄免受放射线以及化学疗法导致的损伤的制剂，包 含：阿米福汀、天然抗氧化剂如维生素e和姜黄素之类的含有酚的天然产物、 以及亚叶酸钙之类的甲氨蝶呤救援剂。
药物可以是喷替酸钙钠之类的为了从骨髄将重金属去除而使用的制剂。 布洛芬泼尼松，氢化可的松，阿司匹林，吲哚美辛，塞来昔布之类的抗炎药 也可以考虑与99mTc、111In、186Re以及188Re这样的放射性标记剂同样地用于传 递。含碘的CT造影剂之类的放射线不透过化合物也可以考虑与钆喷酸葡胺之 类的MRI诊断剂同样地用于传递。
另外，作为前述功能物质，可以使用：骨形成促进剂、骨疾病予防或治 疗剂、骨折予防或治疗剂、软骨形成促进剂和软骨疾病予防或治疗剂、或者 变形性关节炎或慢性关节风湿等软骨疾病的予防或治疗药；由骨折、脱臼和 骨破损等外伤、骨膜炎、结核性骨关节炎、梅毒性骨炎、麻风病导致的骨病 变、放线菌症、芽生菌病和布鲁氏杆茵病等炎症性疾病、良性骨瘤、骨软骨 瘤、骨样骨瘤、多发性软骨性外骨瘤、孤立性骨囊瘤、骨巨细胞瘤、骨纤维 异常形成、骨组织细胞增生症X、近肩膀骨的肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、骨 纤维肉瘤、尤文氏肉瘤、多发性骨髓瘤以及癌向骨转移等肿瘤；佝偻病、骨 软化症、坏血病、甲状旁腺功能龚甲状腺功能亢进症、Paget氏病、垂体脑贡 不耐、缺铁性贫血、骨炎纤维化、肾性骨病、骨质疏松症、骨缺损以及强直 性脊髄炎等代谢性·内分泌疾病，或者无软骨形成症、无锁骨·头盖骨形成 症、退行性骨发育不良、骨形成不全症、大理石骨病、颅缝早闭 (craniosynostosis)、齿状突发育不全(dens hypoplasia)、克-菲二氏综合征 (Klippel-Feil syndrome)、脊柱裂，半椎体异常病，骨畸形，脊柱侧弯以及派 尔特斯病(Perthes disease)等先天性骨系统疾病·畸形综合征的治疗剂或诊 断剂。
另外，作为前述功能物质，可以优选适用于高效率传递骨髄炎、骨髄性 白血病、多发性骨髓瘤、造血障害、缺铁性贫血、恶性贫血、巨幼细胞性贫 血、溶血性贫血、遗传性球形细胞增多症(herediary spherocytosis)、镰刀状红 血球性贫血以及再生不良性贫血等骨髄疾病的治疗剂或诊断剂；或者优选适 用于传递作为伴随着肾病的贫血的改善药物通过基因重组而产生的促红细 胞生成素、治癌疗法中使用的粒细胞减少症的治疗药物、以及骨髄移植和获 得性免疫缺陷综合征(AIDS)中适用的集落刺激因子(CSF)。作为骨髄性肿瘤 的治疗剂的例子，可以使用：阿糖胞苷，柔红霉素，伊达比星，阿柔比星， 米托蒽醌，依诺他滨，6-巯基嘌呤，硫鸟嘌呤，氮杂胞苷，安吖啶，类甾 醇，亚砷酸，羟基脲，hydrea，阿糖胞苷，蒽环类药物，长春花生物碱类药 物，视黄酸，普力多宁，L-天冬酰胺酶，干扰素，左旋苯丙氨酸氮芥，长春 新碱，阿霉素，环磷酰胺，氨甲喋呤，沙利度胺，足叶乙甙，环磷酰胺，卡 莫司汀，地塞米松，细胞因子，干扰素制剂，白消安，羟基脲，甲磺酰基磺 酸伊马替尼，泼尼松龙和硼替佐米。
另外，在负载放射γ射线或者正电子放射性同位素的情况下，前述功能 物质也可以作为骨或骨髄疾病的诊断试剂而使用。前述功能物质还可以负载 用于放射性核素治疗骨或骨髄疾病的治疗学的放射性核素(奥格电子、β放射 性或α粒子放射性)。进一步，负载有放射性不透射剂的情况下，前述功能物 质也可以用作X射线以及X射线计算机断层摄影术的诊断试剂。在负载有超 常磁性或常磁性药剂的情况下，前述功能物质也可以用作磁共振成像法的诊 断试剂。在此基础上，前述功能物质能够高效率地将基因输送或导入至骨髓， 所以该传递物质能够例如，将耐药性基因输送至骨髄，用于在使用抗癌剂治 疗的辅助疗法中保护骨髄。
产业上的可利用性
上述的实施方式为适用本发明的原理例示的多个可能的实施方式中的 几个。在不改变本发明的主旨的范围内，本领域技术人员能够容易地实现其 他的多种并且多样的变形。
附图标记说明
10筒状容器
11内周面
12凹曲面
13突部
20中心轴(自转轴)