技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡毒支原体和鸡滑液囊 支原体二联灭活疫苗。
背景技术
鸡毒支原体(MycoplasmaGallisepticum，MG)是鸡的慢性呼吸道病(Chronic RespiratoryDisease，CRD)的病原体，其特征为呼吸啰音、咳嗽、流浆液性鼻液， 气囊炎，严重时张口呼吸。通常与病毒、细菌协同感染，导致呼吸道症状加剧， 使死亡率增高。MG感染在国内禽群中相当普遍，感染后鸡死亡率一般很低， 主要表现为产蛋率、孵化率降低，出栏期延长和饲料利用率降低，对该病的预 防和控制程序也额外增加了成本，同时造成禽产品中药物残留，给养禽业造成 严重的经济损失。
鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae，MS)又称鸡传染性滑膜炎，是由 鸡滑液囊支原体引起鸡和火鸡等的一种急性或慢性传染病。鸡传染性滑膜炎是 Olson等(1964)首先报道的。本病以侵害关节滑液，腱鞘膜为主，其特征为 关节、腱鞘和足掌肿胀等。鸡群感染该病可导致明显的跛行、生长发育迟缓及 胴体降级等，本病可垂直传播，导致种鸡发病期间所产种蛋孵出的雏鸡发病。 鸡滑液囊支原体感染已遍及全球，呈世界性分布，主要侵害商品肉鸡、蛋鸡和 种鸡，本病一年四季均可发生，但以冬春季节易发。鸡滑液囊支原体感染一般 多见于4～16周龄的鸡，发病率一般为5％～15％，死亡率约为1％～10％。由 于本病发展缓慢，病程长，一旦在鸡群中感染，根除很困难，因此在鸡群中长 期蔓延，导致饲料利用率低、生长发育迟缓、淘汰率增高、产蛋量下降等。鸡 群如存在两种病原时，易发生混合感染，加剧病情，死亡率增高，造成严重的 经济损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗，用 于预防由鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体引起的感染，从而弥补现有技术的不足。
本发明提供的鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗，其包含有抗原 和疫苗佐剂，其中抗原为鸡毒支原体CR株和鸡滑液囊支原体YBF-MS1株；
鸡滑液囊支原体YBF-MS1株(MycoplasmasynoviaeYBF-MS1)，2016年3 月3日保藏于位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M2016080。
鸡毒支原体CR株购自中国兽医药品监察所，编号为CVCC3616；
本发明的二联灭活疫苗，其制备方法如下：
1)将鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体分别按10％的量接种于改良CM培养基 中，于37℃,150r/min振荡培养24～30小时后收获菌液，作为一级种子液；逐 步做种子扩大培养，获得菌液；
2)用连续流离心的方法将鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体培养菌液分别作5 倍浓缩值每毫升活菌含量不低于5×109CCU；
3)将浓缩后的菌液无菌导入灭活罐内加入10％甲醛溶液至终浓度为0.2％， 开动搅拌电机慢速搅拌，使其充分混合；37℃搅拌灭活12～16小时，灭活后的 菌液置2～8℃保存；
4)将鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体灭活后的菌液混合，加入终浓度为5％ 吐温-80，充分混匀即为水相；取注射用白油95份，硬脂酸铝1份在油相制备 罐中混合均匀并加热至80℃后，再加入司本-805份，至温度达到115℃时维持 40分钟，冷却后作为油相备用；将水相溶液与油相溶液按照体积比1:1.5～1:2 乳化，即为鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗。
所述的改良CM培养基，其组分浓度为PPLO肉汤21.0g/L、葡萄糖5.0g/L、 灭活马血清200～300ml/L、25％酵母浸出液200～300ml/L、1％酚红溶液 1.0ml/L、1％辅酶I溶液20～30ml/L、1％L-半胱氨酸溶液20～30ml/L，pH值 调至7.6～7.8。
本发明将鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体两种优势菌株联合制备二联灭活疫 苗，其中鸡滑液囊支原体YBF-MS1株为新分离筛选的毒力强、免疫原性好的 优势菌株，对鸡传染性滑膜炎具有很好的预防效果。本发明疫苗安全性和效力 均良好，能有效的预防鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体感染。
具体实施方式
下面结合具体实施案例来进一步描述本发明。本领域的技术人员应该理解 的是，在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形 式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
实施例1：鸡滑液囊支原体YBF‐MS1株的分离纯化和鉴定。
1鸡滑液囊支原体生产用培养基
1.1改良CM液体培养基制备取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5g、去离子水 加至1000ml、1％酚红溶液1ml，上述成分混合溶解后，116℃高压灭菌30分 钟作为基础液。基础液冷却后无菌加入灭活马血清200ml、25％酵母浸出液 200ml、80万单位/ml青霉素溶液1.2ml、1％辅酶I溶液30ml、1％L‐半胱氨酸 溶液30ml，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至7.6～7.8，2～8℃保存。
1.2改良CM固体培养基制备取PPLO肉汤21.0g、葡萄糖5g、琼脂粉 15.0g去离子水加至1000ml，上述成分混合后加热溶解，定量分装，以116℃ 灭菌30分钟后，置2～8℃保存。使用前将100ml固体培养基加热溶解，当温 度降到60℃左右时，添加灭活马血清20.0ml、25％酵母浸出液20ml、1％辅酶 I溶液3.0ml、1％L‐半胱氨酸溶液3.0ml、8万单位/ml青霉素1.2ml。用1mol/L 的氢氧化钠溶液调培养基pH值至7.6～7.8，2～8℃保存。
2鸡滑液囊支原体分离、鉴定
2.1病原菌分离：
2015年3月份，在青岛一养鸡场，已注射了鸡滑液囊支原体疫苗的鸡群中 发生了典型的传染性滑膜炎症状。从发病鸡上取肿胀跗关节、足掌及龙骨囊肿 内容物，接种于改良CM液体培养基，置37℃，150r/min振荡培养24～48小 时，待接种后的液体培养基的颜色由猩红变成橘黄时收获，传代，取第2代(F2 代)菌液进行鉴定。
2.2病原菌鉴定
2.2.1形态观察鸡滑液囊支原体分离株(命名为：YBF‐MS1株)经吉姆 萨染色，菌体形态为多形态的球状菌。
2.2.2生化特性鸡滑液囊支原体分离株YBF‐MS1株能发酵葡萄糖及麦芽 糖，产酸不产气；不发酵乳糖，不能分解精氨酸；细菌L型鉴定均为阴性；可 凝集鸡的红细胞。
2.2.3培养特性鸡滑液囊支原体分离株YBF‐MS1株在含有辅酶I的改良 CM液体培养基中生长良好，培养24～30小时，呈轻度浑浊生长，培养基颜色 由猩红变成橘黄(培养基pH值下降0.7及以上)；接种含有辅酶I的改良CM固 体培养基上，置5％～10％CO2条件下，37℃培养3～5日，在低倍镜下可见圆 形、隆起，表面光滑的菌落，典型菌落呈“煎蛋状”。本菌在不含有辅酶I的培 养基中不生长。
2.2.4纯粹检验鸡滑液囊支原体分离株YBF‐MS1株按2010年版《中国 兽药典》附录进行检验，结果纯粹。
2.2.5特异性
2.2.5.1代谢抵制试验在加有鸡滑液囊支原体YBF‐MS1株菌液的改良 CM液体培养基中加入鸡滑液囊支原体阳性血清，出现了特异性代谢抑制作用， 培养基颜色未发生变化。
2.2.5.2生长抑制试验加有鸡滑液囊支原体YBF‐MS1株菌液的改良CM 固体培养基中加入鸡滑液囊支原体阳性血清，出现了特异性代谢抑制作用，培 养基未见支原体菌落生长。
2.2.5分子生物学鉴定用鸡滑液囊支原体特异性引物进行PCR扩增，结 果YBF‐MS1株能扩增出约595bp的特异性片段。
鸡滑液囊支原体分离YBF‐MS1株通过以上各项鉴定结果表明，均符合鸡滑 液囊支原体特性。
2.3鸡滑液囊支原体YBF‐MS1株VlhA基因序列测定与分析
2.3.1引物设计根据GenBank中收录的鸡滑液囊支原体VlhA基因，比 对后针对保守区设计引物，由大连宝生物工程有限公司合成。该引物扩增片段 大小为595bp，引物序列如下所示：
FvolA：CATTGCTCCTGCTGGTATAG
RvolA：TTGGAAGTCAAGTCCTGGTT
2.3.2DNA模板的制备取YBF‐MS1株培养物5.0ml，12000r/min离心 15min，弃上清，沉淀用1.0ml双蒸水重悬，100℃水浴10min后，12000r/min 离心15min收集上清，即为PCR模板，‐20℃保存备用。
2.3.3PCR扩增及测序PCR扩增体系为：10×PCRBuffer2.5μl，dNTPs1.0μl， 引物F0.5μl，引物R0.5μl，模板DNA5.0μl，Taq酶0.25μl，双蒸水15.25μl。反 应条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min， 35个循环，72℃终延伸5min。取10μlPCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶在120V 电压下电泳鉴定，同时以标准株作为阳性对照，结果出现了与标准参考株 WVU1853株相同的约595bp的特异性条带，说明该分离株为鸡滑液囊支原体。
2.3.4测序与分析根据GenBank中收录的鸡滑液囊支原体VlhA基因序 列，针对保守区设计了一对引物，并进行扩增，经测序扩增出约为595bp大小 的VlhA基因片段；序列分析表明该筛选的支原体菌株与其它不同地方的分离菌 株的同源性仅为95％。
2.4毒力试验将活菌量约为106CCU/ml鸡滑液囊支体YBF‐MS1株菌液， 爪垫注射49日龄SPF鸡10只，0.2ml/只；另设10只作对照，爪垫注射培养基， 0.2ml/只。攻毒后按常规饲养，观察14日，记录试验鸡发病情况。
攻毒结果表明，发病鸡的临床症状主要为攻毒爪不敢着地或跛行；典型症 状为足掌部、趾关节肿胀；个别发病鸡出现跗关节肿胀，精神不振、羽毛粗乱； 所有攻毒鸡均未出现呼吸道症状。发病鸡趾关节和足掌部剖检可见肉芽增生组 织、脓性粘液或纤维素性干酪物，跗关节肿胀部位剖检可见灰白色脓性粘液或 纤维素性干酪样物质，剖检所有攻毒鸡气囊、气管、肺脏等器官均未见异常。 结果见表1。
表1：毒力试验结果
2.5免疫原性的测定将鸡滑液囊支原体YBF‐MS1株灭活检验合格的浓 缩菌液(灭活前活菌量约为5×109CCU/ml)，加入5％吐温‐80制备水相，按照 2:3比例与油相混合乳化，制备灭活疫苗。分别以0.1ml、0.25ml、0.5ml颈部皮 下注射21日龄SPF鸡各10只，另设不免疫对照10只。免疫后28日，各组试 验鸡均用活菌量约为106CCU/ml的YBF‐MS1株菌液爪垫注射攻毒，每只0.2ml。 观察14日内试验鸡发病情况。试验结果表明，以0.1ml免疫21日龄SPF鸡， 免后28日试验鸡的保护率为4/10；以0.25ml和0.5ml免疫21日龄SPF鸡，免 后28日试验鸡的保护率为8/10和9/10；对照鸡8/10发病。由表2结果可见， 鸡滑液囊支原体YBF‐MS1株的最小免疫保护剂量为0.25ml，结果见表2。
表2：免疫原性试验结果
实施例2鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备
1、鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗制备方法
1.1将鸡毒支原体CR株(购于中国兽医药品监察所，保藏号CVCC3616)、 鸡滑液囊支原体YBF-MS1株分别按10％的量接种于CM培养基和改良CM培养基 中，于37℃培养24～30小时(培养基颜色由猩红变成橘黄收获菌液)收获菌 液，作为一级种子液；以此方法逐步做种子扩大培养(菌种传代不应超过8代， 每代培养时间均为24～30小时)，一直到所需要的种子量。
1.2采用培养瓶进行培养鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体菌液按照培养 瓶容积80％加入鸡滑液囊支原体液体培养基，pH值为7.6、种子接种量为10％、 培养温度为37℃、振荡速度为100r/min、培养24～30小时收获菌液置2～8℃ 保存，取样进行半成品检验。
1.3菌液浓缩用连续流离心的方法将鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体培 养物分别作5倍浓缩(每毫升活菌含量不低于5×109CCU)，浓缩后立即灭活。
1.4菌液灭活将浓缩后的菌液无菌导入灭活罐内，按照浓缩菌液数量， 计量加入10％甲醛溶液，开动搅拌电机慢速搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的 终浓度为0.2％。37℃搅拌灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时，开启 搅拌机连续搅拌)，灭活后的菌液置2～8℃保存。灭活检验均合格。
1.5活菌计数鸡毒支原体菌液的活菌数为8×109CCU/ml，鸡滑液囊支 原体菌液的活菌数为4×109CCU/ml。
1.6水相配制与二联苗的乳化将鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体灭活检 验合格的菌液按体积比1:1的比例混合后，加入终浓度为5％吐温-80，充分混 匀即为水相；取注射用白油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并 加热至80℃后，再加入司本-805份，至温度达到115℃时维持40分钟，冷却 后作为油相备用；将水相溶液与油相溶液按照体积比1:1.5乳化成鸡毒支原体、 鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗。
2：疫苗检验
2.1性状检验和装量检查本发明疫苗外观呈乳白色乳剂；取一清洁吸 管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均不扩散，为油包水型；吸取 疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，疫苗无水相析出；黏度 测定结果分别为46.9cP。
2.2无菌检验按2010年版《中国兽药典》对本发明疫苗进行无菌检验， 结果无菌生长。
2.3安全检验取21日龄SPF鸡10只，颈部皮下注射本发明疫苗，每只 1.0ml(2羽份)，观察14日内试验鸡均无因注射疫苗而引起的局部或全身不良 反应。
2.4效力检验采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，再用免疫 攻毒法进行检验。
2.4.1血清学方法取21日龄SPF鸡20只，其中10只颈部皮下注射本 发明疫苗0.5ml，另设10只不免疫作对照。疫苗免疫后28日，将所有试验鸡 采血，
检测鸡毒支原体ELISA抗体和鸡滑液囊支原体平板凝集抗体。血清学结 果：疫苗免疫后28日，免疫鸡鸡毒支原体ELISA抗体9/10为阳性；对照鸡ELISA 抗体10/10均为阴性；免疫鸡鸡滑液囊支原平板凝集抗体9/10≥1:8,对照鸡凝集 抗体10/10均为阴性。
2.4.2免疫攻毒方法取21日龄SPF鸡40只，其中20只颈部皮下注射 本发明疫苗0.5ml，另设20只不免疫作对照。疫苗免疫后28日，分别取免疫 鸡和对照鸡各10只进行鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体攻毒。
2.4.2.1鸡毒支原体攻毒方法将免疫鸡和对照鸡各10只在2～3m3的密 室(室温度应为15～30℃，相对湿度为50～70％)内喷雾攻击R株培养物500～ 600ml(活菌量约为108～9CCU/ml)，喷雾持续时间应不少于5分钟，雾滴在2.0μm 左右，观察14日，剖检，观察气囊病变，并进行病变记分。计算免疫攻毒保护 率。攻毒结果本发明二联苗对鸡毒支原体免疫攻毒的保护率为87.5％；对照鸡 攻毒后7/10气囊出现2分以上的病变。结果见表3。疫苗效力试验合格。
表3二联灭活疫苗鸡毒支原体R株攻毒效力检验判分结果
鸡毒支原体免疫攻毒保护率＝(对照组攻毒平均分－免疫组攻毒平均分)/ 对照组攻毒平均分
保护率计算方法及公式：
以气囊病变程序来计算保护率将试验鸡每侧气囊按病变程度分为五个等级。
0分——正常的气囊，清洁透明而薄；
1分——气囊稍有增厚和轻度浑浊，局部有少数灰色或黄色渗出物斑点；
2分——部分气囊区域有可见的灰色和黄色渗出物，同时伴有气囊中度增厚；
3分——大片气囊布满黄色干酪样渗出物；
4分——整个气囊布满黄色干酪样渗出物，气囊失去弹性。
气囊保护率计算公式：
2.4.2.2鸡滑液囊支原体攻毒方法将免疫鸡和对照鸡各10只同时各爪垫 注射鸡滑液囊支原体YBF-MS1株培养物0.2ml(2×105CCU/只)，观察14日， 观察攻毒鸡试验情况。结果对照鸡9/10发病，免疫鸡9/10保护。
对比实验表明，用目前市场上出售的鸡滑液囊支原体疫苗进行免疫，再用 本发明筛选的YBF-MS1株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的 免疫效果远低于本发明YBF-MS1株制成的灭活疫苗的效果。推测是由于 YBF-MS1株基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。
以上结果说明，本发明所制备的鸡毒支原体、滑液囊支原体二联灭活疫苗 安全有效适合推广应用。