本发明是关于一种改进了的生产二羟乙酸的方法，此方法是利用酶催化氧化羟基乙酸，具体地说，涉及采用固定在不溶载体上的羟基氧化酶和过氧化氢醇作为催化剂。 羟基氧化酶一般存在于多叶的绿色植物或哺乳动物细胞中，催化氧化羟基乙酸生成二羟乙酸，且同时产生过氧化氢，陶伯特（N.E.Tolbert）在“J.Biol.Chem.”Vol.181，905-914（1949）中首先报道了一种酶，它由烟草叶中提取而得，它能够通过生成二羟乙酸的中间体催化氧化羟基乙酸形成甲酸和二氧化碳，且加入一些特定的化合物，如乙二胺，就可限制中间产物二羟乙酸的继续氧化，氧化大约是在PH8下进行，典型使用的羟基乙酸浓度为大约3-40mm，最佳的羟基氧化PH值为8.9。且据报道100mm的草酸能抑制羟基氧化酶的催化作用。类似地，里查森（K.E.Richardson）和陶伯特在“J.Biol.Chem.”Vol 236，1280-1284（1961）中报道，三羟甲基氨基甲烷缓冲液可以在羟基氧化酶催化氧化羟基乙酸中抑制草酸的形成;克莱哥特（C.O.Clagett）、陶伯特和伯里，（K.H.Burris）在“J.Biol.Chem.”Vol178，977-887（1949）中报道，羟基氧化酶用氧催化氧化羟基乙酸的最佳PH值范围是7.8～8.6，最佳温度范围是35℃～40℃;
查里克（I.Zelitch）和澳克（S.Ochoa）在“J.Biol.Chem.”Vol 707-718（1953）中以及罗滨逊（J.C.Robinson等在“J.Biol.Chem.”Vol 237，2001-2009（1962）中报道，在菠菜羟基乙酸氧化催化过程中，甲酸和二氧化碳的生成，是由于非酶反应过氧化氢和二羟乙酸反应造成的。他们发现，加入一种能使过氧化氢降解的过氧化氢酶，可以通过抑制甲酸和二氧化碳的生成来大大提高二羟乙酸的产量。加入FMN（黄素单核苷酸）也能大大提高羟基氧化酶的稳定性。
福里格（N.A.Frigerio）和哈伯（H.A.Harbury）在“J.Biol.Chem.”Vol 231，135-157（1958）中已报道了有关羟基乙酸氧化酶的制备和性质，并发现纯化了的酶在溶液中很不稳定，并认为这种不稳定性是由于FMN和酶活性部位连接力太弱以及酶催化活性的四聚物或八聚物降解成酶催化非活性的单聚物或双聚物造成的，而且形成了不可逆的凝聚和沉淀。在酶液中加入FMN可以提高它的活性。且高浓度蛋白或高离子强度可保持酶呈四聚物或八聚物形态。实际上，羟基乙酸催化氧化生成二羟乙酸的文献报道很多，例如：
酶的分离（通常包括一种分析方法）
I.Zelitch in Methods of Enzymology.Vol.1，Academic Press，New York，1955，p.528-532，从菠菜烟草叶中
M.Nishimura et al.，Arch.Biochem.Biophys.，Vol.222，397-402（1983），从南瓜、猪耳中
H.Asker and D.Davies，Biochim.Biophys.Acta，Vol.761，103-108（1983），从鼠肝中
M.J.Emes and K.H.Erismann，Int.J.Biochem.，Vol.16，1373-1378（1984），从柠檬中
酶结构
E.Cederlund et al.，Eur.J.Biochem.，Vol.173，523-530（1988）.
Y.Lindquist and C.Branden，J.Diol.Chem.Vol.264，3624-3628，（1989）：
本发明涉及一种二羟乙酸（OCHCOOH）的生产方法，此方法是羟基乙酸（HOCH2COOH）（200-约2500mM）在羟基氧化酶（（S）-2-羟基酸氧化酶，ECl.1.3.15）和过氧化氢酶（EC1.11.1.6）固定在不溶载体上地情况下，在水溶液中（PH7-10）和氧反应，最佳条件下，可以获得高产率的二羟乙酸，同时羟基乙酸转化率很高。且固定化的酶能再生和重新利用。
本发明描述了一种固定化酶的制备并利用它从羟基乙酸生产二羟乙酸，虽然羟基乙酸和氧化酶催化反应已知多年，但是从没获得过99%的高选择性，也没有羟基乙酸的氧化操作浓度在0.20～2.5M低范围内。一个早先的共同申请“U.S.S.N，07/422，011，Oct.16提交，1989，从羟基乙酸生产二羟乙酸”中描述了一种酶催化转化羟基乙酸生成二羟乙酸的方法。它是在有氧情况下，氨缓冲液及羟基氧化酶和过氧化氢酶液中进行的。此法显示了一种预想不到的使用过氧化氢酶（破坏副产物过氧化氢）和氨缓冲液的协同效应，从而更有效地形成了与二羟乙酸的化学加合物（限制了它的进一步氧化），该文作为参考文献并入本文。不论是单独加入过氧化氢酶还是氨缓冲液都不能产生两者同时加入的高选择性，同时产率也比单独加入任何一种也高很多。本发明是在上述方法下作了改进，即用了固定化酶作为催化剂。
先前报道的利用溶解酶作为催化剂的方法有不少问题，例如，催化剂的再生和重新使用不那么容易操作;催化剂的稳定性也不如固定化的酶，且溶解酶在反应物中鼓氧（提高氧的溶解度从而提高反应速度）状况下也不太稳定。现在已经发展了一种催化剂的制备方法，它包括同时把羟基氧化酶（例如：从菠菜或甜菜中分离或从商业渠道获得）和过氧化氢酶（例如：从曲霉皂脚、构巢曲菌或啤酒酵母或牛肝中分离也可从商业渠道获得）这两种酶固定在同一个固体载体（例如：商业上可得到的环氧乙烷丙烯酸珠粒）上。用这种固定化酶作为催化剂有如下优点：
1.反应完毕后，固定化酶容易从反应混合物中再生并重新利用，而溶解酶再生很困难，且易失活。
2.固定化酶比溶解酶稳定的多。和溶解酶相比，不论是获得的催化剂转换率还是在反应后或长时间在缓冲液中贮存后所得活性，固定化酶都要高得多。
3.更重要地，固定化酶的稳定性不受为增加溶氧和反应速度而鼓氧的反应条件的影响，而同样情形下，溶解酶会很快失活。
对某种特定的酶，没有一种可选择的固定化方法可以预期它固定化成功，而且，超过一种酶的共固定化，就更没法预见其成功性。因此，本领域专业人员通常认为，要想成功地固定化一种酶，必须使用不同的方法尝试，最佳的结果往往要反复试验才能获得。对于羟基氧化酶，没有有关固定化尝试方面的报道。酶的固定化可以用不同的技术，包括1）通过共价连接，物理吸附，静电连接或亲和连接把酶结合到载体上，2）和双功能或多功能试剂交联，3）包埋在琼脂、聚合物、乳胶或其它种类的膜里，4）上述方法的结合。有关固定化方法的详述以及影响固定化方法选择的因素可以参阅下列资料以及本文的参考文献：
Methods in Enzymology，K.Mosbach（ed.），Academic Press，New York：Vol.44（1976），Vol.135（1987），Vol.136（1987），Vol.137（1988），and the references
用了不同的固定化方法来固定羟基氧化酶，这些方法的最佳结果都显示在实施例中。把蛋白酶共价连接到环氧乙烷丙烯酸珠粒（Ewpergit C），溴化氰活化的琼脂糖以及三乙胺交联的丙烯酰胺/N-丙烯氧基琥珀酰亚胺共聚物凝胶（PAN-500）都能产生活性的固定化酶。正如物理吸附到XAO-8树脂及苯基琼脂糖那样。用离子连接到各种载体上的方法也很成功，如已尝试的把蛋白质交联到戊二醛，二甲基已二酰二胺，二甲基辛二酰二胺或1-4丁二醇二环氧甘油醚等。在这些不同的固定化活性羟基氧化酶中，只有环氧乙烷丙烯酸珠粒上的酶能作为羟基乙酸氧化的催化剂来使用。物理吸附上的酶，在PH9.0的反应混合物中，羟基乙酸的浓度为0.75m以及乙二胺浓度为0.79M时就解吸，而溴化氰活化的琼脂和乙二胺反应，将共价结合酶再次释放，进入反应混合物。结合到PAN-500上的酶活性太低，以至不能在实际反应中作为催化剂使用。
固定化结合在环氧乙烷丙烯酸珠粒Eupergit C以及Eupergit C-250L（120hm Pharma）上的羟基氧化酶在反应条件下很稳定，且活性（酶活力单位/克催化剂）很高，在实际过程中很有用。过氧化氢酶也被固定在环氧乙烷丙烯酸珠粒上，这两种分开固定化的催化剂一起使用，或者把两种酶一起固定在同一载体上，再加到反应混合物中（后一种方法更好）。
采用固定化酶催化剂的方法消除了溶解酶的很多不足之处，在水缓冲溶液中，固定化羟基氧化酶比溶解酶要稳定得多（稳定性接近硫酸铵沉淀的酶）。从反应液中简单过滤就可回收这些固定化催化剂。再加入新鲜反应液就可再使用。用这种方法，固定化氧化酶的转换率（即酶失活前每摩尔催化剂所能转化底物成产物的摩尔数）可高达107（mol/mol）。由于鼓氧到反应液中不会使酶催化剂失活，从而可通过加大鼓氧量使反应速度增加至少10培，从而明显地降低了此工艺方法的生产成本。
这种固定化的羟基氧化酶在反应中必须在一个有效的浓度范围内使用，通常为0.001～10.0IU/ml，最佳0.1～4IU/ml。一个“IU”（国际单位）被定义为每分钟催化一微摩尔底物转化成产物所需酶的量。这种酶的分析方法可在下列文献中找到：
I.Zelitch and S.Ochoa，J.Biot.Chem.Vol.201，707-718（1953）
此法也用来分析回收的或循环的羟基氧化酶活性。
反应液的PH值应在7-10范围内，最好是在8.0-9.5，由于酶活性随PH值而变，我们可用缓冲液来维持溶液PH值。当反应进行时，反应的PH值略微下降，所以通常反应开始时PH靠近酶活性PH范围的最高端，大约9.0-9.5，让它在反应期间下降。正如先前已在“U.S.S.N.07/422，011，filed October 16 1989”中描述的，采用一种能和二羟乙酸结合成复合物（形成一种对化学或酶氧化更稳定的亚铵）的氨缓冲液以及过氧化氢酶一起，可以最大限度地提高产物的选择性。乙二胺或效果差一些的三（羟甲基）甲胺（下文记为TRIS），哌嗪，或N-甘氨酰甘氨酸都能提高二羟乙酸的产量。这些胺对每摩尔羟基乙酸（起始浓度）所使用的比率一般为1.0-3.0，最佳1.05-1.33。在此范围，可精确调节PH值在所要求的范围内。在本身胺对羟基乙酸的比率太高时，有必要调节PH值，可采用加酸如盐酸或硫酸的方法，当用碱性较低的胺时，如TRIS，有必要采用加碱的方法以维持所需的PH值。
固定化催化剂的浓度应在50-100000IU/ml，最佳在350-14000IU/ml。最好是把酶共同固定在一起以限制加入到反应中的催化剂量，而过氧化氢酶和羟基氧化醇浓度可调节在上述范围内以使过氧化氢酶与羟基氧化酶的比例（以IU为单位）至少为约250∶1。FMN是最佳的加入成份，浓度为0.0-2.0mM，最佳为0.01-0.2mM。
反应速度至少受水介质中的溶氧量所部分控制。可以通过加入空气的方法加入氧，但最好是使用相对纯的氧，并加压。虽然氧压的上限还不知道，但可以使用到50大气压，最好是15个大气压作为上限。为维持高的溶氧率（从而维持反应），向反应物中鼓氧是必要的。鼓氧速度为0.05-5体积的氧（大气压下测量）/每体积反应混合物。每分钟且最好在0.2-2Vol/Vol.min。另外，简单搅拌是必需的。
反应温度是一个很重要的变量，它影响反应速度和酶的稳定性。反应温度可在0℃-40℃，但最佳为5℃-15℃。在此最佳范围内操作，反应结束后酶活性回收率最大。
反应结束后可通过过滤或离心的方法移走酶催化剂，胺缓冲液可很方便地通过离子交换树脂法去除。适合的酸性阳离子交换树脂有“AMBERLITE”CG120或AMBERLITE”IR120（Rohm ＆ Haas Co.）以及“DOWEX”50（Dow Chemical Co.）。然后再用强碱处理树脂来回收并循环使用胺。
产品二羟乙酸用在香草醛和乙基香草醛的制备，同样也用在离子交换脂以及在药物工业中作为酸性催化剂。一般它以50%（重量百分比）的水溶液出售。需要说明的是在这些应用中的二羟乙酸也可以指二羟乙酸阴离子，特别当溶液中的PH值高子2.3时。
从菠菜中纯化羟基氧化酶
菠菜中的羟基氧化酶可以用分级硫铵沉淀加上DEAE纤维素批吸附提取。后一种方法是基于DEAE纤维素吸附除羟基氧化酶外的所有植物蛋白。除非另有说明，所有纯化操作温度均在4℃下进行。在25℃，把2蒲式耳（16Kg）的新鲜菠菜用一装有0.5英寸网孔筛的“Fitz Mill”磨碎机磨碎成细小颗粒。最后的浆汁液体部分（约6L）可通过4层乳酪布压榨法分离。也可以改用果汁提取器（Vitantonio）分离。加入5.6克的二硫苏糖醇（5mM的最终浓度）到此液体中，然后用5-20mL 20%的乙酸调节PH值到5.2。经过10分钟孵育，最终的混合物在4℃，GS-3转头（Sorvall），13000g下离心25分钟。抛弃沉淀物，上清液用15～20ml的6N氢氧化钾调节PH值到7.5-8.0（Zelitch，I.Ochoa，S.，J.Biol.Chem.，Vol，201，707（1953）;Frigerio，N.A.，Harbury，H.A.，J.Biol.Chem.，Vol.231，135（1958））.然后把上清液（约5.5L）用装有100000MW（分子量）膜片的Pelicon（Millipore）超滤器浓缩5倍;最终的浓缩物体积大约是1.1升。再在10分钟以上，在浓缩液中慢慢加入154克的硫酸铵，硫铵全溶解后，沉淀用13000g离心25分钟移走。抛弃沉淀，在上清液（约1.1L）中加入77克硫酸铵，同上离心，收集蛋白沉淀，上清液抛弃（Zelitch（1953）;Frigerio（1958））。
把蛋白沉淀溶解在大约200ml的20mM N-二（羟乙基）甘氨酸缓冲液（PH8.0）中，用Spectroporz渗析管（1200-14000 MWCO）对4L含2mM FMN的20mM N-二（羟乙基）甘氨酸渗透蛋白液16小时，用电导仪测和新鲜N-二（羟乙基）甘氨酸缓冲液电导相关的蛋白液电导，如果读数不等，则继续渗透蛋白液4小时，然后同前检测。渗析后的蛋白液（约250ml）盛在烧杯中用磁力或顶部机械搅拌，然后加入25克预溶胀的DEAZ树脂（Sigma）（Kerr.M.W.，Groves，D.，phytochemistry，Vol.14，359-362（1975））。混合物孵育10分钟，溶液中蛋白浓度的降低可用Bradford蛋白分析法检测，从而监控蛋白在树脂上的吸附。当上清液中蛋白浓度下降到跟踪水平（0.2mg/ml）时，没有结合的蛋白用真空过滤法通过一装在13cm直径的Buchner漏斗上的Whatman＃1过滤盘来从混合物中回收。为最大限度地回收酶，树脂饼用100ml 20mM的N-二（羟乙基）甘氨酸（PH8.0）冲洗。在蛋白溶液中加入最终浓度为2mM的FMN（Sigma），然后再在15分钟以上，搅拌慢慢加入240克的硫酸铵到酶液中（大约400ml），同时，必须滴加5N的氢氧化钾以维持PH值为8.0。最后沉淀的羟基氧人酶贮存在4℃暗处一直到使用。
从新鲜面包酵母中纯化过氧化氢酶
所有纯化操作均在4℃下进行。把新鲜的面包酵母（11b，通用食品-红星）悬浮在含有1mM苯甲基磺酰氟化物（PMSF，Sigma）的450ml 20mM的Tris缓冲液（PH7.5）中。取200ml酵母蛋白混悬液转移到一容量为400ml，装有200ml玻璃珠（0.5mm直径生物产品）的匀浆器中，经过5分钟连续混合，把溶菌产物转移到一接受容器中（在冰中），余下的酵母混悬液处理同上。
细胞碎片可通过在4℃，13000g，GS-3转头（Sorvoall）下离心45分-1小时。收集上清液（400ml）加入90.4克固体硫酸铵以达到40%不饱和度，在冰上孵育10分钟，再在4℃，13000g，GSA转头（Sorvall）下离心25分钟。抛弃沉淀物，上清液（400ml）中加入48克的固体硫酸铵以达到最终60%的饱和度（Seach，T.C.M.，Daplan，J.G.J.Biol.Chem.Vol.218，No.8.2880（1973））。混合物同前孵育和离心，最终的蛋白沉淀溶解在一个最小体积的20mM TRIS（PH7.5）液中。使用Spectropor 2渗析管，蛋白溶液被20mM的TRIS（PH7.5）渗析;16小时后弃去渗析液，并补换新的TRIS液，继续渗析4小时，然后回收渗析蛋白（100mL）。
取上述蛋白渗析液50ml加入到经向流动装有100ml Q Sepharose快速流离子交换树脂（Pharmacia）色谱柱（Sepragen）中，设有吸附的蛋白随20mM的TRIS（PH7.5）以10ml/min。速度流出。流出蛋白用连接绘图记录仪的装有280nm过滤器（LKB）的流动测定池监控;用LKB部分收集器每10-15ml收集柱流出液。当所有的没结合蛋白流出柱后，用400ml的含0～500mM NaCl的20mM TRIS液（PH7.5）线性梯度洗脱，流速10ml/min，每部分酶活性分析用在240nm下过氧化物消失的方法检测。收集有过氧化氢酶活性的部分，加硫酸铵质最终浓度达80%饱和度，最终沉淀的过氧化氢酶4℃贮存。
此法同样也适用于从构巢曲菌以及曲霉皂脚中纯化过氧化氢酶。固定在环氧乙烷丙烯酸珠粒上羟基氧化酶和过氧化氢酶活性分析
固定在环氧乙烷丙烯酸珠粒上的羟基氧化酶，可用下法分析活性：称量约5-10mg处理过的珠粒加入到3ml的放有磁力搅拌棒的石英杯中，然后加入2.0mL含有0.12mM的2，6-二氯苯靛酚的80mM Tris缓冲液（PH8.3）。用一橡胶隔片盖住石英杯，用氧气鼓泡去氮5分钟，然后再用注射器加入40mL 1.0M的羟基乙酸/1.0MTRis（PH8.3）到石英杯内，搅拌，同时在605nm（e＝22000）下测量吸光度变化。
过氧化氢酶分析方法如下：精确称量2-5mg处理过的珠粒加入到有磁力搅拌棒的石英杯中，然后加入2.0mL的蒸馏水和1.0mL含59mM过氧化氢的50mM磷酸缓冲液（PH20），并在240nm（e＝39.4）下测量吸光度随时间的变化。一般地，固定化的羟基氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为6IU/克珠粒以及6000IU/克珠粒。
高压液相色谱（HPLC）分析羟基乙酸、二羟乙酸。
草酸和甲酸
分析样品准备如下：把0.100mL的反应混合物和0.300mL的0.1N硫酸混合，然后通过Millipore Ultrafre MC过滤器（隔离10000Mw）过滤。通过HPLC用一个Bio-Rad Aminex HPX-87H柱（300×7.8mm）40℃分析羟基乙酸、二羟乙酸、草酸以及甲酸用作溶剂的是0.01N硫酸和0.1mM1-羟基2烷-1，1-二磷酸的水溶液，流速是1.0ml/min.仪器是水840HPLC系统，它用510型泵，一个712WISP自动取样器以及相应地一个490E UV（紫外）检测器和410差示折光计。草酸、二羟乙酸、羟基乙酸、甲酸以及丙酸（国际标准）的保留时间分别是4.29，6.09，7.07，8.79和11.41分钟。
实施例一
羟基氧化酶的固定化
对不同的载体
聚乙烯亚胺（PEI）、在硅胶上的PEI，在硅胶上的苄基化PEI，Bio-Rex760，CHSepharose 4B，XAD-4，XAD-8，苯琼脂糖，Eupergit C，Eupergit C-250L以及Eupergit C-30N都能从商业渠道获得。制备PAN-500）三乙胺交联的丙烯酰胺/N-丙烯氧基琥珀酰胺共聚物凝胶）并用它来固定羟基氧化酶，方法可根据“Pollack，A等在J.Am.Chem.Soc.，1980，102，6324-6336”中描述的步骤。对于那些利用物理吸附结合蛋白的载体，固定化操作可先用PH5-10的水缓冲液洗涤，然后在5℃或25℃把载体浸在酶的缓冲溶液中预定时间，再用新鲜的缓冲液清洗载体3-4次以去除没有结合的蛋白，分析载体的羟基氧化酶活性。对于用戊二醛法连接的载体，重复上述方法，只是在加入酶之前，载体用5%的戊二醛水溶液处理。一种详细的用Eupergit作载体固定羟基氧化酶的方法在例2中给出，羟基氧化酶对不同载体最佳条件下的固定化率如下表所示，且它们是基于每步中整个酶的活性。
载体 固定化率 活性 连接方式
PEI O O 离子吸附
PEI／戊二醛 0 0 共价连接
PEI－硅胶／戊二醛 0 0 共价连接
Bio-Rex70 0 0 离子吸附
CH Sepharose 4B 0 0 离子吸附
CNBr-琼脂 20 5.0IU／mL 共价连接
PAN－500胶 19 0.14IU/mL 共价连接
XAD-4 0 0 物理吸附
XAD-8 4 0.76IU/gr 物理吸附
PEI－硅胶／苯 0 0 物理吸附
苯基琼脂 3 0.62IU/gr 物理吸附
EupergitC 17 7.8IU/gr 共价连接
Eupergit C-250L 8 5.0IU/gr 共价连接
实施例二
同时在Eupergit C上固定化羟基氧化酶和过氧化氢酶
称重10.0g的环氧乙烷丙烯酸珠粒（EupergitC）放入一125ml的锥形烧瓶，然后加入含50mm甘氨酸缓冲液（PH8.0）及0.02mM的FMN溶液约75mL，摇荡烧瓶，使环氧乙烷丙烯酸酸珠粒悬浮。当珠粒沉积到烧瓶底部后，漂留在混合物顶上的细小颗粒用移液管去除，并同时在不扰动底部珠粒的情况下尽可能地移走上清液。重复清洗一次。
把用硫酸铵沉淀所得的活性为327IU的羟基氧化酶（从新鲜菠菜中分离）混合液100mL在12000rpm（Sorvall，GSA转头，4℃）离心20分钟，弃去上清液，饼块用含50mM甘氨酸缓冲液（PH8.0）和0.02mMFMN缓冲液50mL溶解。把用硫酸铵沉淀从曲霉皂脚中分离的100mg过氧化氢酶（Sigma（-3515，715000Iu）的混合液10mL在15000rpm（Sorvall SS-34 rotor）离心10分钟，弃去上清液，饼块用上述含羟基氧化酶的缓冲液溶解，然后把这种酶液加入到已清洗了的环氧乙烷丙烯酸珠粒烧瓶中，用缓冲液调节最终体积125mL。再把此混合液转移到～250mL的带盖聚丙烯瓶中，然后把此瓶放在一瓶振荡器上15℃下4～5rpm振荡16小时。再把混合物倒入装有多孔载体床的色谱柱中，任其自流。用30mL的甘氨酸/FMN缓冲液清洗此固定化酶三次，然后在5℃同样的缓冲液中保存。这样获得的共固定化酶催化剂，羟基氧化酶的活性为7.2IU/克EupergitC以及过氧化氢酶活性为5680IU/克Eupergit C。
实施例三
溶解酶和相应固定化酶的羟基氧化酶稳定性
没有固定的（溶解的）羟基氧化酶对固定在环氧乙烷丙烯酸珠粒（Eupergit C）上的羟基氧化酶的稳定性可以通过测量贮存在4℃下含2.0mMFMN的缓冲液（PH8.0）中酶获得，检测酶活性随时间的变化。另外，在相同条件下还监测了在3.2M硫酸铵和2.0mM FMN液中沉淀下来并在相同条件下贮存的酶稳定性。结果如下：
酶回收率 1天 2天 3月 6月
溶解下的 50% 0 0 0
固定化的 92% 95% 50% 50%
沉淀的 100% 100% 95% 85%
实施例四
鼓氧共固定化酶反应
在一个2.5cm内径×20cm长的装有20mm聚乙烯床载体的玻璃柱内放入含羟基乙酸（0.25M）、乙二胺（0.33M）、丙酸（0.075M，HPLC内标物）以及FMN（0.2mM）液10ml。把柱子及内装物冷却到15℃，然后加入菠菜羟基氧化酶（2.5IU）和曲霉皂脚过氧化氢酶（27000IU）在Euperigt C上的共固定化酶。以10ml/min速度从多孔载体床鼓氧，每一固定间隔时间取100ml等分的反应混合物监控。方法是把这等分液和300mL的0.1N硫酸混合以终止反应，过滤这等分液并用高压液相色谱分析。5.5小时后，二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别为98%，2%和0%。相应地羟基乙酸全部转化。最终的羟基氧化酶和过氧化氢酶的活性分别是最初的95%和65%。
对比实施例一
鼓氧溶解酶反应
重复实施例四的反应，只是改用同样数量的没有固定化的羟基氧化酶和过氧化氢酶。4小时后，二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别为43%，0%和0%，相应地羟基乙酸的转化率为46%，最终羟基氧化酶和过氧化氢酶的活性分别是最初的2%和82%相应地，延长反应时同已观察不到进一步反应。
实施例五
鼓氧单独固定化的酶反应
重复实施例四的反应，用含羟基乙酸（0.75M）、乙二胺（0.86M），丙酸（0.075M，MPLC内标物），FMN 0.2mM液10mL，固定在EupergitC上的羟基氧化酶（2.5IU）以及固定在另一Eupergit C上的曲霉皂脚过氧化氢酶（1400IU）。20小时后，二羟乙酸、草酸和甲酸的产率分别为99%，0.2%和0.5%。相应地，羟基乙酸转化率为100%，羟基氧化酶和过氧化氢酶的最终活性是最初的72%和66%。
实施例六
共固定化酶固定床反应器
在一气体提升式生化反应器中放入400ml下列混合液：羟基乙酸0.75M，乙二胺0.86M，丙酸（HPL C内标）0.075M，FMN 0.01M（PH9.0）。湿氧气在生化反应器中通过溶液鼓泡，用一蠕动泵从生化反应器通过一套层1厘米×内径30cm的色谱柱来循环富氧化的溶液（40ml/min），色谱柱内装有含菠菜羟基氧化酶（13.9Iu）和曲霉皂脚过氧化氢酶（56000Iu）的共固定化在Eupergit C珠粒（21ml固定床体积）。上生化反应器内含物及套层色谱柱用-10℃制冷淋浴循环装置通过夹层循环50∶50乙二醇/水来保持在15℃，377小时后，二羟乙酸、草酸以及甲酸的产率分别为93%，0%和0.3%。相应地羟基乙酸的转化率为94%。羟基氧化酶和过氧化氢酶的最终活性是最初的48%和69%。
实施例七
在一搅拌的高压釜反应器内用共固定化羟基氧化酶/过氧化氢酶氧化羟基乙酸在一个300ml EZE密封的搅拌反应釜内装有100ml含下列物质的溶液：羟基乙酸0.75M，乙二胺0.86M（PH9.0），丙酸（HPLC内标物）0.075M，FMN0.01mM溶液被冷却到15℃，然后在反应釜中加入共固定化了的89IU的菠菜羟基氧化酶和72600IU的曲霉皂脚过氧化氢酶Eupergit C珠粒（约28克）。15℃，500rpm搅拌。在70Psig（48Kpa）氧压下通过混合物以100ml/min速度鼓氧。反应监控方法为定期取100μl反应物等分，与300mL 0.1N硫酸混合以骤冷反应，过滤等分，用HPLC分析。3小时后，羟基乙酸、草酸以及甲酸的产率分别是100%，0%和0%，相应地羟基乙酸完全转化。羟基氧化酶和过氧化氢酶的最终活性分别是最初的100%和100%。
实施例八
自一搅拌的高压釜反应器内回收和重新利用共固定化的羟基氧化酶/过氧化氢酶。
从实施例七中描述的反应中回收固定化酶方法如下：通过一2.5cm内径×20cm长的装有20mm聚乙烯载体床玻璃柱过滤反应混合物，吸附在催化剂上的残余液体短暂地在柱内通过一氮气流来去除，然后把化合物悬浮在15℃100ml的新鲜溶液中，此溶液含羟基乙酸0.75M，乙二胺0.86M，丙酸0.075M（HPLC内标物，以及FMN 0.01mM。把它们再装入300ml的高压釜反应器，于是反应又重复。这种催化剂回收方法被连续操作了10批，且反应时间，羟基氧化酶（G.O）和过氧化氢酶的回收率以及二羟乙酸的产率如下表所示
二羟乙酸
轮次# 时间(小时) G.O.(%) 过氧化氢酶(%) 酸(%)
1 3 100 100 100
2 2 100 100 96
3 2 98 70 97
4 2 64 100 100
5 2 80 92 100
6 2 77 77 98
7 2.5 78 96 100
8 2.5 75 100 100
9 3 77 89 100
10 3 85 100 93
实施例九
在搅拌高压反应釜内鼓氧酶氧化下羟基乙酸的反应速度
在-300ml EZE密封搅拌的高压釜内装有100ml含下列物质的溶液：羟基乙酸0.75M，乙二胺0.86M（PH9.0），丙酸（HPLC内标物）0.075M以及FMN0.01mM。溶液冷却到15℃。然后在釜内加入共固定化在约15克EupergitC上的14Iu菠菜羟基氧化酶以及42800Iu的曲霉皂脚过氧化氢酶。15℃，400rpm搅拌，鼓氧的氧压分别为35，70，105和140PSig（242，483，724和965KPa），气速为50ml/min。监控方法同实验四，相对于上述氧气压力，羟基乙酸的反应速度相应为0.48，0.54，0.53和0.57mmol/min。
对比实施例2
没有鼓氧下酶氧化反应速度
重复实施例九，只是反应液中不鼓氧。在氧压是35，70和105psig下，羟基乙酸的反应速度分别为0.032，0.053和0.071mmol/min。
实施例十
用渗透的面包酵母以及固定化羟基氧化酶氧化羟基乙酸
重复实例七和八，只是50IU的菠菜羟基氧化酶固定在约15克的Eupergit C上，4克的鲜啤酒酵母（面包酵母，红星商标，通用食品）已用异丙醇渗透并含100000Iu过氧化氢酶活性。它们被用作催化剂。混合物在15℃、400rpm下搅拌，氧压70 PSig（483Kpa）。鼓氧速率为20ml/min。大批的连续反应时间、羟基氧化酶（G.0）和过氧化氢酶回收率以及二羟乙酸的产率结果例表如下：
二羟乙酸
轮次# 时间(小时) G.O.(%) 过氧化氢酶(%) 酸(%)
1 2.5 81 62 100
2 3 97 30 100
3 3 73 54 100
4 3 51 53 96
5 4 49 57 98
6 6 24 45 97
实施例十一
羟基乙酸的氧化速率对鼓氧速率的依赖
重复实施例七，使用固定化在约18克Eupergit C上的52Iu的菠菜羟基氧化酶和95000IU的曲霉皂脚过氧化氢酶珠粒反应混合物在70Psig（48KPa）氧压和15℃下，以500rpm的转速搅拌，鼓氧速率为5-50ml/min。在不同鼓氧速率下羟基乙酸的氧化速率如下表所示。
mLO2/min mmolO2/min mmol羟基乙酸/min
5 0.40 0.22
10 0.57 0.45
15 0.70 0.67
20 0.79 0.89
25 0.78 1.11
30 0.99 1.34
50 1.10 2.23
实施例十二
羟基乙酸的氧化速率对高压釜的搅拌速度的依赖。
重复实施例七，用50IU共固定化在约15g Eupergit C上的菠菜羟基氧化酶和47000IU曲霉皂脚过氧化氢酶，反应物的搅拌速度为100-500rpm，15℃，70psig（483KPa）氧压。鼓氧速率为20ml/min，羟基乙酸随转速变化的氧化速度如下：
rpm mmol羟基乙酸/min
100 0.08
200 0.15
300 0.22
400 0.43
500 0.45
实施例十三
羟基乙酸的氧化速度对羟基氧化酶浓度的依赖
重复实施例七，用共固定化羟基氧化酶和过氧化氢酶，前者活性分别为80，60，40和20IU，相应地后者为1400000，1000000，70000或35000IU。15℃400rpm搅拌，氧压70psig。鼓氧速率20ml/min。随羟基氧化酶浓度不同氧化速度如下表所示。
羟基氧化酶
(IU/mL) mmol二羟乙酸/min
0.2 0.20
0.4 0.30
0.6 0.36
0.8 0.57
上面我们相当具体地描述和列举了本发明。应该说，下列的权利要求不是限定范围，而只是努力提出本发明范围。