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1、10申请公布号CN104195247A43申请公布日20141210CN104195247A21申请号201410431759522申请日20140828C12Q1/6820060171申请人广州和实生物技术有限公司地址510665广东省广州市经济技术开发区科学城荔枝山路6号1号楼510室72发明人陈华云肖湘文丁渭刘淑园陈嘉昌方凤银赵丽74专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人郑莹54发明名称多色高危HPV荧光检测试剂盒57摘要本发明公开了多色高危HPV荧光检测试剂盒，包括热启动TAQ酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针。本发明的。
2、试剂盒适用于定性检测宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物样本中18种可引起宫颈癌的高风险HPV基因型。本试剂盒应用多重荧光PCR技术实现了在同一管扩增体系中检测18种HPV基因型，同时本试剂盒在同时检测15种常见高风险HPV基因型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82）时，还可检测三种少见高风险HPV基因型（26、53、73）。本发明的检测试剂盒，检测通量高，大大降低了筛查成本。51INTCL权利要求书2页说明书6页序列表9页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页序列表9页附图3页10申请公布号CN1041。
3、95247ACN104195247A1/2页21多色高危HPV荧光检测试剂盒，包括热启动TAQ酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，其特征在于所述荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的序列如下探针1TTGGCATAATCAATTATTT探针2TGGGGCAATCAGTTRTTTGT探针3CTGATTGTTCCARCARATG探针4AATCAGTTGTTTGTTACTGT探针5TTTRTTACCTGTGTTGATAC探针6TAACTGTTGTGGATACCAC探针7TATATGTTGGCACAATCAA探针8TGGTTACCCCAACAAATG探针9TAATTGAT。
4、TATGCCAGCAAACA探针10TTACCTGTGTTGATACYAC探针11CTGATTGCCCCAACAAAT探针12TATWTGTTGGCATAATCAATTA探针13ACAAAYAACTGATTGCCCCA探针14ACTACAGTAACAAAYAATTG探针15ACAAACAACTGATTATGCCAAC探针16CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC探针17TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG探针18CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC；上述探针的3端连接有MGB，5端连接有荧光基团。2根据权利要求1所述的多色高危HPV荧光检测。
5、试剂盒，其特征在于所述通用引物为引物1GCMCAGGGWCATAAYAATGG引物2GCTCAGGGTTTAAACAATGG引物3GCCCAGGGCCACAATAATGG引物4GCNCAGGGNCACAATAATGG引物5GCNCAGGGNCATAACAATGG引物6GCNCAGGGNCATAATAATGG引物7CGTCCMARRGGAWACTGATC引物8TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC引物9CCTATTCTTCACCATGCCTTA引物10TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC；引物中的N指肌苷。3根据权利要求1或2所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特。
6、征在于所述试剂盒设有内标引物及内标探针，内标引物如下引物11CAACTTCATCCACGTTCACC引物12GAAGAGCCAAGGACAGGTAC权利要求书CN104195247A2/2页3内标探针的序列如下探针19TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC。4根据权利要求1或2所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于所述热启动TAQ酶系统中添加有UDG酶。5根据权利要求1或2所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还设有DNA提取液，DNA提取液的组成为EDTA的浓度为025MOL/L、乙酸钠的浓度为25MMOL/L和DTT的浓度为1MMOL/L。6根据权利要求。
7、4所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于所述热启动TAQ酶系统含有经过化学修饰的热启动TAQ酶、DNTPS和UDG酶，其中每人份体系中热启动TAQ酶为5U，DNTPS为02MMOL/L，UDG酶为03U。7根据权利要求1、2或6所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于所述多色高危HPV荧光检测试剂盒为三色高危HPV荧光检测试剂盒，其探针1618连接的荧光基团不同于探针115连接的荧光基团。8根据权利要求1、2或6所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于所述多色高危HPV荧光检测试剂盒为四色高危HPV荧光检测试剂盒，其探针12连接的荧光基团不同于探针318连接的荧光基团。9根。
8、据权利要求3所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于内标探针连接的荧光基团不同于探针118连接的荧光基团。权利要求书CN104195247A1/6页4多色高危HPV荧光检测试剂盒技术领域0001本发明涉及一种HPV荧光检测试剂盒，特别涉及一种多色高危HPV荧光检测试剂盒。背景技术0002宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为3035岁，浸润癌为4555岁，近年来其发病有年轻化的趋势。宫颈癌的早期发现和治疗是有效治疗宫颈癌的关键。0003现有研究表明，宫颈癌的主要病因是由高危型人乳头瘤病毒（HUMANPAPILLOMAVIRUS，HPV）的持续感染或反复感染所致。90以上的宫颈癌伴。
9、有高危型HPV感染，高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要危险因素。因此，HPVDNA检测在世界范围内多个国家已经成为宫颈癌筛查和健康管理的一个重要部分。人乳头瘤病毒有多种基因型，依据不同型别与宫颈癌发生危险性的高低可将其分为低危型和中高危型HPV。HPVDNA检测的主要意义在于1）基于液基细胞学结果决定患者是否需要进一步进行阴道镜检查；2）液基细胞学异常而阴道镜检或活检阴性患者随访；3）高级别宫颈上皮内病变患者临床处理后治疗结果预测；4）年龄30岁女性联合巴氏涂片针对宫颈癌早期筛查。0004现有的运用荧光PCR方法进行高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的技术的缺点主要是扩增灵敏度低，耗时长。前期一般。
10、都需要经过步骤繁琐的核酸提取，然后运用普通TAQMAN探针的方法进行多重PCR扩增，而且一般都是FAM和HEX两通道检测，无法具体分区高危HPV型别，难以满足实际使用的需要。0005开发出可以快速、高效的HPV高危型检测试剂盒，具有非常实际的意义。发明内容0006本发明的目的在于提供一种多色高危HPV荧光检测试剂盒。0007本发明所采取的技术方案是多色高危HPV荧光检测试剂盒，包括热启动TAQ酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的序列如下探针1TTGGCATAATCAATTATTT探针2TGGGGCAATCAGTTRTTTGT。
11、探针3CTGATTGTTCCARCARATG探针4AATCAGTTGTTTGTTACTGT探针5TTTRTTACCTGTGTTGATAC探针6TAACTGTTGTGGATACCAC探针7TATATGTTGGCACAATCAA探针8TGGTTACCCCAACAAATG探针9TAATTGATTATGCCAGCAAACA探针10TTACCTGTGTTGATACYAC说明书CN104195247A2/6页5探针11CTGATTGCCCCAACAAAT探针12TATWTGTTGGCATAATCAATTA探针13ACAAAYAACTGATTGCCCCA探针14ACTACAGTAACAAAYAATTG探针1。
12、5ACAAACAACTGATTATGCCAAC探针16CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC探针17TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG探针18CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC；上述探针的3端连接有MGB，5端连接有荧光基团，其中，三色高危HPV荧光检测试剂盒探针115分别用于检测15种常见高风险HPV基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82；探针1618分别用于检测三种少见高风险HPV基因型26、53、73。四色高危HPV荧光检测试剂盒探针1用于检测常见高风险HPV基因型16型；探。
13、针2用于检测常见高风险HPV基因型18型；探针318分别用于检测另外13种常见高风险HPV基因型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82和三种少见高风险HPV基因型26、53、73。0008优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的通用引物为引物1GCMCAGGGWCATAAYAATGG引物2GCTCAGGGTTTAAACAATGG引物3GCCCAGGGCCACAATAATGG引物4GCNCAGGGNCACAATAATGG引物5GCNCAGGGNCATAACAATGG引物6GCNCAGGGNCATAATAATGG引物7CGTCCMARRGGAWACT。
14、GATC引物8TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC引物9CCTATTCTTCACCATGCCTTA引物10TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC；引物中的N指肌苷。0009优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒设有内标引物及内标探针，内标引物如下引物11CAACTTCATCCACGTTCACC引物12GAAGAGCCAAGGACAGGTAC内标探针的序列如下探针19,TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC。0010优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的热启动TAQ酶系统中添加有UDG酶。0011优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使。
15、用的热启动TAQ酶系统含有经过化学修饰的热启动TAQ酶、DNTPS和UDG酶，其中每人份体系中热启动TAQ酶为5U，DNTPS为02MMOL/L，UDG酶为03U。0012优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒还设有DNA提取液，DNA提取液的组成为EDTA的浓度为025MOL/L、乙酸钠的浓度为25MMOL/L和DTT的浓度为1MMOL/L。说明书CN104195247A3/6页60013优选的，上述三色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的探针1618连接的荧光基团不同于探针115连接的荧光基团。0014优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒为三色高危HPV荧光检测试剂盒，其中所使用的内标。
16、探针上连接的荧光基团不同于探针118的。0015优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒为四色高危HPV荧光检测试剂盒，其中所使用的探针1连接的荧光基团不同于探针2，318连接的荧光基团。0016优选的，上述四色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的探针2连接的荧光基团不同于探针1，318连接的荧光基团。0017优选的，上述四色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的内标探针上连接的荧光基团不同于探针118的。0018本发明的有益效果是本发明的试剂盒适用于定性检测宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物样本中18种可引起宫颈癌的高风险HPV基因型。本发明应用多重荧光PCR技术实现了在同一管扩增体系中检测18种HP。
17、V基因型，同时三色高危HPV荧光检测试剂盒在同时检测15种常见高风险HPV基因型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82）时，还可检测三种少见高风险HPV基因型（26、53、73）。四色高危HPV荧光检测试剂盒在同时检测13种常见高风险HPV基因型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82）和三种少见高风险HPV基因型（26、53、73），同时还能具体分型高风险HPV基因型16型和18型，本发明的检测试剂盒，检测通量高，大大降低了筛查成本。0019通过加入UDG酶防污染，使得本发明试剂盒的灵敏度更高，最低检出。
18、量为10E03拷贝/反应。附图说明0020图16是本试剂盒检测范围内的检测结果示意图。具体实施方式0021下面结合实施例，进一步说明本发明。0022三色高危HPV荧光检测试剂盒，包括DNA提取液、热启动TAQ酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的序列如下探针1TTGGCATAATCAATTATTT（SEQIDNO1）探针2TGGGGCAATCAGTTRTTTGT（SEQIDNO2）探针3CTGATTGTTCCARCARATG（SEQIDNO3）探针4AATCAGTTGTTTGTTACTGT（SEQIDNO4）探针5TTTRTT。
19、ACCTGTGTTGATAC（SEQIDNO5）探针6TAACTGTTGTGGATACCAC（SEQIDNO6）探针7TATATGTTGGCACAATCAA（SEQIDNO7）探针8TGGTTACCCCAACAAATG（SEQIDNO8）探针9TAATTGATTATGCCAGCAAACA（SEQIDNO9）说明书CN104195247A4/6页7探针10TTACCTGTGTTGATACYAC（SEQIDNO10）探针11CTGATTGCCCCAACAAAT（SEQIDNO11）探针12TATWTGTTGGCATAATCAATTA（SEQIDNO12）探针13ACAAAYAACTGATTGCCC。
20、CA（SEQIDNO13）探针14ACTACAGTAACAAAYAATTG（SEQIDNO14）探针15ACAAACAACTGATTATGCCAAC（SEQIDNO15）探针16CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC（SEQIDNO16）探针17TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG（SEQIDNO17）探针18CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC（SEQIDNO18）；上述探针的3端连接有MGB，5端连接有荧光基团，其中，探针115连接的荧光基团为FAM，探针1618连接的荧光基团为ROX。0023四色高危HPV荧光检测试剂盒，包括DNA提。
21、取液、热启动TAQ酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的序列如下探针1TTGGCATAATCAATTATTT（SEQIDNO1）探针2TGGGGCAATCAGTTRTTTGT（SEQIDNO2）探针3CTGATTGTTCCARCARATG（SEQIDNO3）探针4AATCAGTTGTTTGTTACTGT（SEQIDNO4）探针5TTTRTTACCTGTGTTGATAC（SEQIDNO5）探针6TAACTGTTGTGGATACCAC（SEQIDNO6）探针7TATATGTTGGCACAATCAA（SEQIDNO7）探针8TGGT。
22、TACCCCAACAAATG（SEQIDNO8）探针9TAATTGATTATGCCAGCAAACA（SEQIDNO9）探针10TTACCTGTGTTGATACYAC（SEQIDNO10）探针11CTGATTGCCCCAACAAAT（SEQIDNO11）探针12TATWTGTTGGCATAATCAATTA（SEQIDNO12）探针13ACAAAYAACTGATTGCCCCA（SEQIDNO13）探针14ACTACAGTAACAAAYAATTG（SEQIDNO14）探针15ACAAACAACTGATTATGCCAAC（SEQIDNO15）探针16CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGAC。
23、AC（SEQIDNO16）探针17TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG（SEQIDNO17）探针18CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC（SEQIDNO18）；上述探针118的3端连接有MGB，5端连接有荧光基团，其中，探针1连接的荧光基团为HEX，探针2连接的荧光基团为ROX，318连接的荧光基团为FAM。0024上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的通用引物为引物1GCMCAGGGWCATAAYAATGG（SEQIDNO19）引物2GCTCAGGGTTTAAACAATGG（SEQIDNO20）引物3GCCCAGGGCCACAATAATGG（SEQID。
24、NO21）引物4GCNCAGGGNCACAATAATGG（SEQIDNO22）说明书CN104195247A5/6页8引物5GCNCAGGGNCATAACAATGG（SEQIDNO23）引物6GCNCAGGGNCATAATAATGG（SEQIDNO24）引物7CGTCCMARRGGAWACTGATC（SEQIDNO25）引物8TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC（SEQIDNO26）引物9CCTATTCTTCACCATGCCTTA（SEQIDNO27）引物10TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC（SEQIDNO28）；引物中的N指肌苷，可与A、T、C、G中的任一。
25、种配对。0025上述多色高危HPV荧光检测试剂盒设有内标引物及内标探针，内标引物如下引物11CAACTTCATCCACGTTCACC（SEQIDNO29）引物12GAAGAGCCAAGGACAGGTAC（SEQIDNO30）内标探针的序列如下探针19,TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC（SEQIDNO31），三色高危HPV荧光检测试剂盒探针的5端连接荧光基团HEX，3端连接有MGB；四色高危HPV荧光检测试剂盒探针的5端连接荧光基团CY5，3端连接有MGB。0026上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的热启动TAQ酶系统含有经过化学修饰的热启动TAQ酶、DNTPS和UDG酶，。
26、其中每人份体系中热启动TAQ酶为5U，DNTPS为02MMOL/L，UDG酶为03U。0027上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的DNA提取液的组成为EDTA的浓度为025MOL/L、乙酸钠的浓度为25MMOL/L和DTT的浓度为1MMOL/L，1200L/管。0028阴性质控品灭菌纯化水，100L/管；HPV阳性质控品HPV18型样本，100L/管。0029检测操作如下1样本处理与DNA提取11向宫颈刷保存管中加入2ML灭菌生理盐水（务必使拭子头完全浸入液体中），震荡60秒（使细胞充分落入液体，灭菌生理盐水变浑浊），将全部洗涤液转至相应编号的2ML离心管；12编好号的样品10,000R。
27、PM离心3分钟，弃上清；13样品沉淀中加入1ML灭菌生理盐水，洗涤沉淀，10,000RPM离心3分钟，弃上清；14样品沉淀中加入50L病毒提取液，震荡60秒，充分悬浮细胞沉淀，备用。0030DNA的提取也可以使用其他公知的方法进行。00312质控品处理取装有HPV阳性质控品、阴性质控品的离心管，10,000RPM离心30秒，然后按1314的提取步骤操作。00323核酸扩增试剂准备（试剂准备区，冰上操作）1从试剂盒中取出HRHPVPCR反应管，瞬时离心备用；2往上述反应管中分别加入提取后的待测样本核酸20L（如样本不足20L，请用灭菌纯化水补足20L后加样）、阴性质控品、阳性质控品各20L。盖紧。
28、管盖，5000RPM离心30秒后转移至扩增检测区。00334PCR扩增说明书CN104195247A6/6页9PCR参数为50，3MIN；95，5MIN；95，5S，58，31S，循环45次。0034在58时测定荧光值。0035根据荧光值变化曲线，确定检测结果。0036质量控制。0037使用本试剂盒和对照试剂盒对临床样本进行检测，两者不符的使用复核试剂盒进行检测，并根据对照与复核检测结果将样本分为阳性组和阴性组，对比本试剂盒检测的CT值，从而确定本试剂盒参考值，当本试剂盒CT值大于37时，均属于阴性组，当本试剂盒CT值小于等于37时，均属于阳性组。因此，将CT值大于37作为为本试剂盒的参考值（。
29、CUTOFF值）。0038使用本发明检测试剂盒的检测结果示意图如图16所示。从图中可以清楚地看出，本发明的检测试剂盒可以有效地检测出高危型HPV，检测结果准确可靠。说明书CN104195247A1/9页10NN多色高危HPV荧光检测试剂盒31PATENTINVERSION35119DNA人工引物1TTGGCATAATCAATTATTT19220DNA人工引物2TGGGGCAATCAGTTRTTTGT20319DNA人工引物3CTGATTGTTCCARCARATG194序列表CN104195247A102/9页1120DNA人工引物4AATCAGTTGTTTGTTACTGT20520DNA人工引。
30、物5TTTRTTACCTGTGTTGATAC20619DNA人工引物6TAACTGTTGTGGATACCAC19719DNA人工引物7TATATGTTGGCACAATCAA19818DNA人工引物序列表CN104195247A113/9页128TGGTTACCCCAACAAATG18922DNA人工引物9TAATTGATTATGCCAGCAAACA221019DNA人工引物10TTACCTGTGTTGATACYAC191118DNA人工引物11CTGATTGCCCCAACAAAT181222DNA人工引物12TATWTGTTGGCATAATCAATTA22序列表CN104195247A124/。
31、9页131320DNA人工引物13ACAAAYAACTGATTGCCCCA201420DNA人工引物14ACTACAGTAACAAAYAATTG201522DNA人工引物15ACAAACAACTGATTATGCCAAC221628DNA人工引物16CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC2817序列表CN104195247A135/9页1426DNA人工引物17TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG261828DNA人工引物18CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC281920DNA人工引物19GCMCAGGGWCATAAYAATGG202020。
32、DNA人工引物20GCTCAGGGTTTAAACAATGG202120DNA人工引物序列表CN104195247A146/9页1521GCCCAGGGCCACAATAATGG202220DNA人工引物MISC_FEATURE33N为肌苷MISC_FEATURE99N为肌苷22GCNCAGGGNCACAATAATGG202320DNA人工引物MISC_FEATURE33N为肌苷MISC_FEATURE99序列表CN104195247A157/9页16N为肌苷23GCNCAGGGNCATAACAATGG202420DNA人工引物MISC_FEATURE33N为肌苷MISC_FEATURE99N为肌。
33、苷24GCNCAGGGNCATAATAATGG202526DNA人工引物25TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC262626DNA人工引物序列表CN104195247A168/9页1726TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC262721DNA人工引物27CCTATTCTTCACCATGCCTTA212826DNA人工引物28TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC262920DNA人工引物29CAACTTCATCCACGTTCACC203020DNA人工引物30GAAGAGCCAAGGACAGGTAC20序列表CN104195247A179/9页183124DNA人工引物31TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC24序列表CN104195247A181/3页19图1图2说明书附图CN104195247A192/3页20图3图4说明书附图CN104195247A203/3页21图5图6说明书附图CN104195247A21。