一种治疗骨肉瘤的表观遗传药物.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810309037.0 (22)申请日 2018.04.09 (71)申请人 徐州维康生物科技有限公司 地址 221001 江苏省徐州市经济技术开发 区软件园E1-924 (72)发明人 赵蔚 邹昌业 鲁冰 (74)专利代理机构 北京太兆天元知识产权代理 有限责任公司 11108 代理人 陈伯秋 (51)Int.Cl. A61K 31/55(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种治疗骨肉瘤的表观遗传药物 (57)摘要 本发明公开了组。

2、蛋白去甲基化酶的抑制剂 GSK-J4在制备骨肉瘤治疗药物中的应用。 首次证 明了组蛋白去甲基化酶KDM5B与骨肉瘤治疗相 关。 GSK-J4通过作用于此酶显著抑制骨肉瘤细胞 增殖， 因此GSK-J4可以成为制备治疗骨肉瘤新药 物的新突破口； 此外本发明还首次公开了GSK-J4 通过靶向KDM5B抑制骨肉瘤细胞的转移能力， 为 研发治疗骨肉瘤肺转移和骨转移的药物提供新 的思路。 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图2页 CN 108464984 A 2018.08.31 CN 108464984 A 1.一种组蛋白去甲基化酶抑制剂在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的。

3、应用， 其中所述的组蛋白去甲基化酶抑制剂为GSK-J4。 3.根据权利要求2所述的应用， 其中所述组蛋白去甲基化酶抑制剂为GSK-J4的水溶性 盐。 4.一种治疗骨肉瘤的药物， 其特征在于所述药物包含组蛋白去甲基化酶抑制剂。 5.根据权利要求4所述的药物， 其特征在于所述的组蛋白去甲基化酶抑制剂是KDM5B抑 制剂。 6.根据权利要求4或5所述的药物， 其中所述的组蛋白去甲基化酶抑制剂是酶活性抑制 剂和/或基因表达抑制剂。 7.根据权利要求6所述的药物， 其中所述的基因表达抑制剂是抑制基因表达的miRNA， siRNA， dsRNA或shRNA。 8.根据权利要求4所述的药物， 其特征在于所述。

4、的组蛋白去甲基化酶抑制剂是靶向SEQ ID NO:2所示的核酸的抑制剂。 9.根据权利要求8所述的药物， 其特征在于所述的组蛋白去甲基化酶抑制剂是SEQ ID NO:3所示的shRNA。 10.表观遗传酶KDM5B在筛选治疗骨肉瘤的药物中的应用。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108464984 A 2 一种治疗骨肉瘤的表观遗传药物 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 具体涉及一种组蛋白去甲基化酶抑制剂在制备骨肉瘤 治疗药物中的应用。 背景技术 0002 骨肉瘤又称成骨肉瘤， 是指瘤细胞能直接产生肿瘤骨及骨样组织的一种恶性结缔 组织肿瘤， 其发病率在原发性恶性肿瘤中占据首。

5、位， 是最常见的恶性成骨性肿瘤之一。 该瘤 恶性程度甚高， 予后极差， 可于数月内出现肺部转移， 截肢后35年存活率仅为520。 肿 瘤多处于骨端， 偶发生于骨干或骨骺。 发生在股骨下端及胫骨上端的约占所有骨肉瘤的四 分之三， 其它处如肱骨、 股骨上端、 腓骨， 脊椎、 髂骨等亦可发生。 多数为溶骨性， 也有少数为 成骨性， 可发生在任何年龄， 但大多在1025岁， 男性较多。 常见的骨肉瘤可以分为： 1、 血管 扩张性骨肉瘤； 2、 高分化皮质内骨肉瘤； 3、 高分化髓内骨肉瘤； 4、 圆形细胞骨肉瘤； 5、 骨旁 (皮质旁)骨肉瘤； 6、 去分化骨旁骨肉瘤。 大多数骨肉瘤患者确诊时已有肺部。

6、微小转移灶， 发 生肺转移的患者缺乏有效的治疗药物， 因此肿瘤转移是骨肉瘤致死的重要原因。 0003 当前骨肉瘤的治疗手段主要是手术治疗联合新辅助化疗， 新辅助化疗强调术前化 疗812周后再行肿瘤切除术， 根据肿瘤坏死程度， 制定术后化疗方案， 并继续化疗半年到1 年。 目前， 常用的化疗药物有甲氨喋呤、 阿霉素、 顺铂及异环磷酰胺， 其中化疗的毒副作用包 括粒细胞、 血小板下降及引起的感染。 临床上针对骨肉瘤的新药临床试验一直未取得明显 进步， 亟待通过新的思路探寻治疗骨肉瘤的药物。 表观遗传调控的改变是癌症的几个重要 特征性标志之一。 表观遗传调控主要包括三种类型： DNA甲基化、 组蛋白。

7、修饰及非编码RNA (non-coding RNA)。 不同于基因组DNA突变， 表观遗传学水平上的基因表达调控是可逆的， 因此， 调节表观遗传修饰的酶可作为治疗相关疾病最为适宜的药物靶标。 寻找合适的表观 遗传酶作为骨肉瘤治疗靶点， 针对性的制定治疗策略成为提高骨肉瘤生存率的迫切要求。 0004 GSK-J4(CAS编号1373423-53-0)， 结构如式I所示， 是一种组蛋白去甲基酶抑制剂。 现有技术认为GSK-J4通过抑制组蛋白H3第27位氨基酸的去甲基化酶UTX(又称KDM6A)和 JMJD3(又称KDM6B)活性发挥作用， 抑制胶质瘤和乳腺癌细胞的增殖。 0005 发明内容 000。

8、6 发明人在研究中最终确定， 抑制表观遗传酶KDM5B(NCB I登录号NM_001314042.1， 说 明 书 1/4 页 3 CN 108464984 A 3 GENE I D:10765， SEQ I D NO:1)可有效控制骨肉瘤的发展， GSK-J4可有效作用于KDM5B酶 活性， 进而影响下游基因表达， 最终抑制骨肉瘤细胞的增殖能力和转移能力。 GSK-J4的I C50值约为1-10 g/ml， 对骨肉瘤生长具有明显的抑制效果。 GSK-J4对于正常细胞的生长、 代 谢无明显影响， 毒副作用低。 此外， GSK-J4还可以与化疗药物联用， 增加细胞对化疗药物的 敏感性， 所以GS。

9、K-J4作为有效成分制成的药物和以往治疗骨肉瘤的靶向激酶或转录因子相 比， 具有更加明显的优势。 0007 本发明首次证明KDM5B酶活性与骨肉瘤治疗相关， 通过GSK-J4特异性抑制KDM5B从 而抑制骨肉瘤。 表观遗传酶抑制剂GSK-J4在抑制骨肉瘤细胞增殖有显著作用， GSK-J4将成 为制备治疗骨肉瘤新药物的新突破口； 本发明首次公开了GSK-J4通过抑制KDM5B酶活性从 而抑制骨肉瘤细胞的转移能力， 为研究治疗骨肉瘤肺转移和骨转移的药物提供新的思路。 0008 本发明提供了一种表观遗传药物GSK-J4与其作用的靶点KDM5B及其应用。 0009 本发明提供了一种组蛋白去甲基化酶抑制。

10、剂在制备骨肉瘤治疗药物中的应用。 其 中所述的组蛋白去甲基化酶抑制剂为GSK-J4， 具体来说， 可以是GSK-J4的水溶性盐。 或者是 抑制组蛋白去甲基化酶的miRNA， siRNA， dsRNA或shRNA， 特别地， 所述的表观遗传酶是 KDM5B。 0010 本发明提供了一种治疗骨肉瘤的药物， 其特征在于所述药物包含表观遗传酶抑制 剂， 特别地， 所述的表观遗传酶是KDM5B。 所述的表观遗传酶抑制剂是酶活性抑制剂和/或基 因表达抑制剂。 其中所述的基因表达抑制剂优选是miRNA， siRNA， dsRNA或shRNA。 或者其中 所述的表观遗传酶抑制剂为GSK-J4， 具体来说， 是。

11、GSK-J4的水溶性盐。 0011 本发明提供了表观遗传酶KDM5B在筛选治疗骨肉瘤的药物中的应用。 0012 本方案提供的GSK-J4浓度范围为1-10M。 0013 本发明提供的方案是将GSK-J4作用于KDM5B， 从而对骨肉瘤生长和骨肉瘤的转移 具有明显的抑制效果。 本发明提供的技术方案给药量低， 大大降低药物副作用。 经试验测定 本发明提供的技术方案可明显抑制骨肉瘤细胞生长和转移， 具有较佳的抗肿瘤功效。 附图说明 0014 图1示采用细胞活力实验测定药物GSK-J4分别对5种骨肉瘤细胞的存活率的抑制 作用 0015 图2示检测GSK-J4对骨肉瘤细胞SJSA1细胞和143B细胞在实。

12、验动物体内成瘤的抑 制作用； 其中， A图左边为SJSA1细胞皮下成瘤的肿瘤生长体积曲线， 右边为143B细胞皮下成 瘤的肿瘤生长体积曲线。 B图为解剖后取出各实验组的肿瘤， 由上至下依次为照组、 GSK-J4 组25mg/kg组、 GSK-J4组50mg/kg组、 GSK-J4组100mg/kg组。 0016 图3示采用Transwell细胞迁移实验测定GSK-J4对于SJSA1细胞和143B细胞迁移的 抑制作用。 药物加在Tranwell的上室， 浓度从左至右分别为0M,2.5M,5M和10M,检测24小时 后迁移到Transwell下室的细胞量。 0017 图4示应用KDM5B shRN。

13、A干扰后KDM5B基因表达量变化(A)， 应用KDM5B shRNA干扰 及GSK-J4后143B细胞数量改变(B)及143B细胞迁移的抑制作用(C)。 结果表明KDM5B的表达 量显著影响143B细胞的增殖和迁移。 说 明 书 2/4 页 4 CN 108464984 A 4 具体实施方式 0018 下面结合实施例， 进一步阐述本发明： 0019 以下实施案例中， 抑制率+存活率1。 0020 1.实施例1 0021 GSK-J4按照不同浓度配置好后待用。 0022 通过MTT实验的方法， 检测测试不同浓度GSK-J4对人骨肉瘤细胞143B、 MG63、 MNNG、 SJSA1和U2增殖的影。

14、响。 将处于指数级增长期的143B(ATCC编号CRL-8303TM， 人源， 上皮样贴 壁生长)、 MG63(ATCC编号CRL-1427TM， 人源， 上皮样贴壁生长)、 MNNG(ATCC编号CRL-1547TM， 人源， 上皮样贴壁生长)、 SJSA1(ATCC编号CRL-2098TM， 人源， 上皮样贴壁生长)和U-2OS细胞 (ATCC编号HTB-96TM， 人源， 上皮样贴壁生长)， 分别用胰酶消化， 吹散成单细胞悬液， 计数， 接 种到96孔培养板中。 在培养箱中培养24h， 待细胞贴壁后， 加入不同浓度的GSK-J4(购自 Selleck,货号S7070)， 分别作用48h后。

15、终止培养， 每孔加入20 l MTT(5mg/mL)， 37避光孵 育4h。 然后将各个孔内液体弃去， 加入150 L DMSO， 震荡15min， 使结晶物充分溶解， 在酶标 仪490nm波长下测定细胞光密度值。 0023 采用上述MTT方法分别检测GSK-J4对骨肉瘤两种细胞系细胞的抑制作用。 药物作 用关系计算方法： 生存率(实验组数值-空白组数值)/(对照组数值-空白组数值) 0024 实验结果： 0025 结果表明GSK-J4对五种骨肉瘤细胞143B、 MG63、 MNNG、 SJSA1和U-2OS细胞均具有较 好的抑制作用(图1)。 其中对于MNNG和U-2OS抑制效果最好。 00。

16、26 2.实施例2 0027 利用动物模型验证GSK-J4对于骨肉瘤生长有抑制作用。 实验采用6周龄雌性裸鼠， 购自广东省实验动物中心， 体重在1520g之间， 在无特殊病原菌(SPF)条件下分笼饲养， 12h交替光照， 自由饮食。 骨肉瘤细胞143B和SJSA1使用含10优质胎牛血清的DMEM高糖培 养液培养至对数生长期进行实验。 待细胞铺满培养瓶的瓶底时， 用5胰蛋白消化酶消化细 胞， 优质胎牛血清终止消化， 轻轻吹打至细胞全部离壁， 1500转/分离心5min， 弃上清。 再用 生理盐水洗涤细胞2次。 洗涤完成后生理盐水重悬细胞， 调整细胞浓度为107/ml， 备皮下成 瘤用。 对于每种。

17、骨肉瘤细胞皮下种植瘤模型， 裸鼠随机分为四组， 每组10只， 分别编号， 进行 前腋皮下注射107/ml细胞悬液150 l。 然后按照每组分别隔日腹腔注射0mg/kg,25mg/kg, 50mg/kg,100mg/kgGSK-J4， 共给药5次。 0028 5次注射结束后于2天后开始测量肿瘤长径(a)和短径(b)， 根据公式Vab2/2计算 肿瘤体积。 并且在接种细胞悬液6周后处死裸鼠， 计算成瘤率， 剥取肿瘤。 观察有无肿瘤远处 播散转移。 取肿瘤组织作病理切片， 显微镜下观察肿瘤血管密度差异。 数据结果以 s表 示， 应用SPSS15.0软件进行数据处理。 采用 2检验进行组间比较。 用P。

18、0.05表示差异的显著 性。 0029 结果显示GSK-J4对于骨肉瘤的肿瘤生长抑制效果显著， 而且抑制效果与药物剂量 呈现出剂量依赖性(图2)， 表明GSK-J4可能成为治疗骨肉瘤的药物。 0030 3.实施例3 0031 利用Transwell实验验证GSK-J4对于骨肉瘤细胞143B和SJSA1骨肉瘤转移有抑制 说 明 书 3/4 页 5 CN 108464984 A 5 作用(图3)。 0032 取一块24孔板， 加入24个Transwell小室， 分成8组， 每种细胞4组， 每组3个复孔。 依 次向每个小室内加入50 L BD matrigel基质胶， 待其凝固后加入50 L无血清的。

19、DMEM培养 基， 再依次于小室内分别接种对数生长期的143B或SJSA1细胞， 每孔50 L培养基中含2104 个细胞。 GSK-J4加在Tranwell的上室， 浓度从左至右分别为0 M,2.5 M,5 M和10 M。 分别沿 24孔板孔壁缓慢加入含10胎牛血清的细胞培养基500 L， 置于5CO2、 37恒温恒湿培养 箱中培养24h。 待实验结束后依次除去Transwell小室及孔内培养基， PBS清洗3遍， 10min/ 次。 沿着孔壁依次加入500 L多聚甲醛固定30min后， 除去多聚甲醛。 再沿着孔壁依次加入 500 L结晶紫染色10min， 除去结晶紫染料。 将Transwel。

20、l小室置于蒸馏水内漂洗3次， 用棉签 轻轻将小室内壁的水珠擦干， 将小室置于通风处待其风干。 用刀片轻轻挂下已风干的小室 底膜， 置于玻片上封片， 将封片置于通风处待其风干后显微镜下拍照， 处理图片及数据。 0033 结果显示： GSK-J4可以抑制骨肉瘤细胞的迁移能力， 并且随着剂量的增加抑制效 果更佳明显(P0.01)。 这一结果表明GSK-J4有可能成为治疗骨肉瘤转移的药物。 0034 4.实施例4 0035 利用基因敲除证实KDM5B表达水平对GSK-J4抑制骨肉瘤细胞活力和迁移能力的影 响 0036 应用靶向序列为ATCGCTTGCTTCATCGATATT(SEQ ID NO： 2)。

21、的shRNA(SEQ ID NO： 3) 对KDM5B基因进行敲降， 比较未敲降和敲降两种情况下KDM5B表达下调的程度(图4A)。 将骨 肉瘤细胞系143B细胞分为四组， I组为无基因敲降及GSK-J4的对照组； II组加入GSK-J4； III 组为KDM5B基因敲降组； IV组同时进行GSK-J4处理和KDM5B敲降。 在相同培养条件下培养， 利 用实施例2和例3中的方法观察KDM5B敲降对GSK-J4抑制骨肉瘤细胞活力和迁移能力的影响 0037 表1敲降KDM5B基因的shRNA序列 0038 0039 结果表明： KDM5B基因被抑制的细胞其活力和迁移能力均显著下降， 且KDM5B的。

22、敲 降不能进一步增加GSK-J4对骨肉瘤细胞活力和迁移能力的抑制效果(图4B和4C)。 这样的结 果表明， KDM5B是调控骨肉瘤细胞活力和迁移能力的关键基因， 并且是GSK-J4在骨肉瘤细胞 中的靶点。 GSK-J4对于骨肉瘤细胞活力和迁移能力的抑制作用是通过KDM5B实现的。 0040 以上为本发明的其中具体实现方式， 其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理 解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离 本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些显而易见的替换形式均属于本发 明的保护范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 10846。

23、4984 A 6 序列表 徐州维康生物科技有限公司 一种治疗骨肉瘤的表观遗传药物 201810083 3 SIPOSequenceListing 1.0 1 4743 DNA 人(Homo sapiens) 1 atggaggcgg ccaccacact gcacccaggc ccgcgcccgg cgctgcccct cgggggcccg 60 ggcccgctgg gcgagttcct gcctccaccc gagtgcccgg tcttcgaacc cagctgggaa 120 gagttcgcgg accccttcgc tttcatccac aagatccggc ccatagccga 。

24、gcagactggc 180 atctgtaagg tgcggccgcc gccggattgg cagccaccat ttgcatgtga tgttgataaa 240 cttcatttta cgccacgtat ccagagactg aatgaattgg aggcccaaac tcgtgtaaaa 300 ttgaatttct tggaccagat tgcaaagtac tgggagttac agggaagtac tctgaaaatt 360 ccacatgtgg agaggaagat cttggactta tttcagctta ataagttagt tgcagaagaa 420 ggtgg。

25、atttg cagttgtttg caaggataga aaatggacca aaattgctac caagatgggg 480 tttgctcctg gcaaagcagt gggctcacat atcagagggc attatgaacg aattctcaac 540 ccctacaact tattcctgtc cggagacagc ctaaggtgtt tgcagaagcc aaacctgacc 600 acagacacta aggacaagga gtacaaaccc catgatattc cccagaggca gtctgtgcag 660 ccttcggaaa cgtgcccccc agc。

26、ccgacga gcaaaacgca tgagagcaga gagacagagt 720 ctcgctgtgt tgcccaggct ggagtgcagt ggcgcgatct tggctcactg caacctccgc 780 ctcctagatt ccagcaattc ttctgcctca gcctcccaag ccatgaatat taaaatagaa 840 cccgaggaga caacggaagc cagaactcat aatctgagac gtcgaatggg ttgtccaact 900 ccaaaatgtg aaaatgagaa agaaatgaag agtagcatca a。

27、gcaagaacc tattgagagg 960 aaagattata ttgtagaaaa tgagaaggaa aagcccaaga gtcgatctaa aaaagccacc 1020 aatgctgtgg acctgtatgt ctgtctttta tgtggcagtg gcaatgatga agaccggcta 1080 ctgttgtgtg atggctgtga tgacagttac catacctttt gcttgatccc acctctccat 1140 gatgttccca agggagactg gaggtgtcct aagtgtttgg ctcaggaatg tagtaag。

28、cca 1200 caagaagcat ttggctttga acaagcagcc agggactata ccctccgtac ttttggggaa 1260 atggcagatg cgttcaaatc tgattacttc aacatgccag tccatatggt ccccacagag 1320 cttgttgaga aagaattttg gagactagta agcactattg aggaggatgt cacagtggaa 1380 tatggagctg acattgcctc aaaggaattt ggcagtggct ttcctgtccg agatgggaaa 1440 atcaaac。

29、tct cacctgagga agaggagtat cttgatagtg gctggaattt gaacaacatg 1500 ccagtgatgg agcagtctgt ccttgcacat attactgctg atatatgtgg catgaaactt 1560 ccttggttgt atgtgggaat gtgcttttct tcattctgtt ggcacattga agaccactgg 1620 序 列 表 1/3 页 7 CN 108464984 A 7 agctattcaa ttaactactt gcactggggt gagccaaaaa cctggtatgg agtcccag。

30、gg 1680 tatgctgctg agcagctaga aaatgtaatg aagaaactag ctccagaact ctttgtgtcc 1740 cagccggatc tcctccatca gcttgtgacc atcatgaacc ccaataccct gatgactcat 1800 gaagtgcctg tttaccgaac taatcagtgt gctggggagt ttgtgattac atttccaaga 1860 gcctaccaca gtggttttaa ccagggtttt aattttgctg aggctgttaa cttctgcact 1920 gttgattg。

31、gc tgccattagg ccgacagtgt gtggagcatt atcgcttgct tcatcgatat 1980 tgtgtgtttt cccacgatga gatgatctgc aagatggctt ccaaggctga tgtattagat 2040 gttgtagtgg cttcaactgt tcagaaagac atggccatta tgattgagga tgagaaagct 2100 ttaagagaaa ctgtccgtaa attgggagtg attgattcgg aaagaatgga ttttgagctg 2160 ttgccagatg atgaacgtca gt。

32、gtgtaaaa tgcaaaacta catgcttcat gtctgccatc 2220 tcctgttctt gtaaacctgg ccttcttgtt tgcctgcatc atgtaaaaga attgtgttcc 2280 tgtcctcctt acaaatataa attgcggtat aggtacacgc tggatgatct ctaccctatg 2340 atgaatgcat tgaagcttcg agcagaatct tacaacgaat gggccttgaa tgtgaatgaa 2400 gctttggagg caaagatcaa caagaagaaa agccttg。

33、tca gcttcaaggc tttaattgaa 2460 gaatctgaaa tgaagaaatt cccagacaat gatcttttgc gacaccttcg cctagtcaca 2520 caggatgcag agaagtgtgc ctctgttgcg cagcagttgc ttaatggcaa aaggcaaact 2580 agatatcgat ctggtggagg gaaatcccaa aatcagttga cagtgaatga gctccggcag 2640 tttgtaacac agctgtatgc tcttccatgt gtcctcagtc agacaccatt a。

34、ctaaaggat 2700 ctcttgaatc gtgtagaaga ttttcaacag catagtcaga aactactctc tgaggaaacg 2760 cctagtgctg cggagctgca ggacttgcta gatgtcagct ttgaatttga tgttgaactt 2820 ccacagcttg ctgagatgcg tatccgtttg gaacaagccc gttggctaga agaggtgcag 2880 caagcttgcc tagaccccag ctcccttact ttagatgata tgagacgtct catagaccta 2940 g。

35、gggtagggc tggccccgta ttcagcagtg gagaaagcta tggcccggct gcaggaactg 3000 ctcacagtgt cagagcactg ggacgacaaa gccaagagtc tcctcaaggc caggccacga 3060 cattcattga atagccttgc tacggcagta aaggaaatcg aagagatccc tgcatatctg 3120 cccaatggtg cggctctgaa agactcagtg cagagagcca gagactggct tcaggatgta 3180 gagggcctgc aggctg。

36、gagg acgtgtgcca gtgttagaca cactcataga acttgttaca 3240 cgaggccgat ctatccccgt acatctgaat tctttgccaa gactggaaac cctagtagct 3300 gaggttcagg cttggaaaga atgtgctgtt aatacattct tgactgagaa ttctccatat 3360 tctctcttag aggtgctgtg tcctcgatgt gatattggcc ttttgggatt gaaaaggaag 3420 cagagaaagt taaaggagcc cttgccaaat 。

37、ggaaagaaaa aaagcaccaa attagagagt 3480 ctgagtgacc tggagagagc tttaactgaa agcaaggaga ctgcttcagc tatggcaact 3540 cttggggaag ctcgcctaag ggaaatggaa gccttgcagt ctctcagact cgccaatgaa 3600 gggaaattgc tgtcgcctct ccaagatgtg gatataaaaa tctgcctatg tcagaaggcc 3660 ccagctgccc ctatgattca atgtgaactc tgcagggatg ctttc。

38、cacac cagttgtgtg 3720 gcggtaccca gtatttcaca gggcctgcga atctggcttt gtccccattg tcggaggtca 3780 gagaaacctc cattagagaa aattctgccc ctgctcgcct cccttcagcg tatccgagtt 3840 cgccttcctg agggagatgc acttcgatat atgattgaaa gaaccgtgaa ctggcagcac 3900 agagcccagc aactgctttc gtcagggaat cttaaatttg tgcaagatcg agtgggctca。

39、 3960 序 列 表 2/3 页 8 CN 108464984 A 8 ggactgttat atagcagatg gcaagcctca gcaggacagg tgtcagacac aaacaaggta 4020 tctcaacctc ctggcacaac atcattttct ttgcctgatg actgggacaa cagaacctca 4080 tatttgcact cccccttctc aactggacga agttgtatcc ccctccatgg tgttagtcca 4140 gaagtgaatg aactattgat ggaagcccag ctgctccagg tatccc。

40、ttcc tgaaattcag 4200 gaactttacc agactttact tgcaaagcca agccctgctc agcagactga ccgaagctca 4260 ccagtgagac ccagcagtga gaagaatgac tgttgccgag ggaagcgaga tggaattaac 4320 agtcttgaga gaaaactgaa gagacgcctg gaaagagagg gcctctccag tgagcggtgg 4380 gaacgagtta agaaaatgcg gacccccaaa aagaagaaaa tcaaactgag ccaccccaag 。

41、4440 gacatgaaca atttcaagtt agagagagag cgtagctatg aattagttcg ttctgctgaa 4500 actcattccc tgccctcaga cacatcctat tccgaacagg aagactctga ggatgaagat 4560 gccatctgcc cagctgtgag ctgcctgcag ccagaaggag atgaggtgga ctgggtccag 4620 tgtgatggca gctgcaatca gtggtttcat caggtctgtg ttggtgtctc cccagagatg 4680 gcagagaaag 。

42、aagactacat ctgtgtgcgc tgtactgtga aggacgcacc aagccgaaag 4740 taa 4743 2 21 DNA 人(Homo sapiens) 2 atcgcttgct tcatcgatat t 21 3 57 DNA 人工序列(artificial) 3 ccggatcgct tgcttcatcg atattctcga gaatatcgat gaagcaagcg atttttt 57 序 列 表 3/3 页 9 CN 108464984 A 9 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 10 CN 108464984 A 10 图3 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 11 CN 108464984 A 11 。