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1、(10)授权公告号 CN 101684163 B (45)授权公告日 2012.04.25 CN 101684163 B *CN101684163B* (21)申请号 200810200407.3 (22)申请日 2008.09.24 A61K 31/737(2006.01) C08B 37/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 中国科学院上海药物研究所 地址 200031 上海市太原路 294 号 (72)发明人 丁侃 邱宏 (74)专利代理机构 北京金信立方知识产权代理 有限公司 11225 代理人 朱梅 黄丽娟 王杰军 . 硫酸多糖 .肿瘤转移。
2、机制及诊疗 进展 . 第二军医大学出版社 ,2002, 第 197 页 . Hong Qiu et alStructure elucidation and sulfated derivatives preparation of two -D-glucans from Gastrodia elata Bl. And their anti-dengue virus bioactivities2007, 第 342 卷第 2230-2236 页的第 2.1-2.3、 3、 4.3、 4.8 节 . (54) 发明名称 一种天麻多糖硫酸化衍生物及其制备方法和 抗肿瘤用途 (57) 摘要 本发明公开了一。
3、种从天麻中提取的天麻多糖 的硫酸化衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤 药物中的用途， 其中该天麻多糖的结构式如下 ： 其 中 x和y为整数且x+y16， n为整数， 其峰尖分子量 为 2.8105， 在其 0.5mg/mL 水溶液中的比旋度为 +95 ； 该天麻多糖的硫酸化衍生物是天麻多糖主 要在 6 位羟基上的硫酸化衍生物， 其峰尖分子量 为 6.5104， 在其 0.5mg/mL 水溶液中的比旋度为 +150.0。经体内外实验证明该天麻多糖的硫酸 化衍生物通过抑制 Id1 的表达而抑制血管生成， 进而抑制肿瘤的生长， 具有明显抗肿瘤作用， 而且 对内皮细胞几乎没有毒性， 因此有望开发为抗肿 。
4、瘤的药物。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张旋 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 CN 101684163 B1/1 页 2 1. 一种从天麻中提取的天麻多糖的硫酸化衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途， 其中该 天麻多糖的结构式如下 ： 其中 x 和 y 为整数且 x+y 16， n 为整数， 其峰尖分子量为 2.8105， 在其 0.5mg/mL 水溶液中的比旋度为 +95 ； 该天麻多糖的硫酸化衍生物是天麻多糖主要在 6 位羟基上的硫酸化衍生物， 其峰尖分 子量为 6.5104， 在其 0.5mg/mL。
5、 水溶液中的比旋度为 +150.0。 权 利 要 求 书 CN 101684163 B1/5 页 3 一种天麻多糖硫酸化衍生物及其制备方法和抗肿瘤用途 技术领域 0001 本发明涉一种从天麻中提取的天麻多糖的硫酸化衍生物及其制备方法和用于制 备抗肿瘤药物的用途。 背景技术 0002 Id1是转录因子bHLH家族中DNA结合抑制蛋白中的一员， 定位于核内， 是血管生成 必须的促进因子之一。 它在多数肿瘤中表达升高， 而在正常组织中的表达偏低， 是一很好的 抗肿瘤靶标。这使得针对 Id1 开发低毒、 高效、 强特异性的抑制剂成为抗肿瘤药物研发的一 个热点， 目前已报道一特异性靶向内皮细胞的反义核苷。
6、酸 Id1-PCAO 和一能抑制侵袭性乳 腺癌细胞中 Id1 表达的小分子大麻二醇 (cannabidiol)。因为反义核苷酸作为药物在技术 上仍有诸多障碍， 大麻二醇为大麻素类似物， 因而它们都不是很好的候选药物。 0003 天麻(Gatrodia elata BL.)是一著名的传统中药， 目前未见其中多糖和多糖衍生 物的正式报道。本发明人从天麻中分离得到天麻多糖， 通过硫酸化衍生得到的其硫酸化衍 生物 (WSS25)， WSS25 能够在 25g/ml 剂量下几乎完全抑制 Id1mRNA 水平和蛋白质水平的 表达， 而抑制血管生成， 进而抑制肿瘤的生长， 但是对内皮细胞几乎没有细胞毒性， 。
7、因而是 低毒高效的 Id1 抑制剂。 发明内容 0004 因此， 本发明的一个目的在于提供一种从天麻中提取的天麻多糖的硫酸化衍生 物， 其中该天麻多糖的结构式如下 ： 0005 0006 其中 x 和 y 为整数且 x+y 16， 0007 n 为整数， 其峰尖分子量为 2.8105， 在其 0.5mg/mL 水溶液中的比旋度为 +95 ； 0008 该天麻多糖的硫酸化衍生物是天麻多糖主要在 6 位羟基上的硫酸化衍生物， 其峰 尖分子量为 6.5104， 在其 0.5mg/mL 水溶液中的比旋度为 +150.0。 0009 本发明的另一目的为提供一种天麻多糖的硫酸化衍生物的制备方法， 该方法的。
8、具 体步骤如下 ： 0010 1) 水提粗多糖 (WGE) 的制备 ： 干燥的天麻饮片， 经乙醇脱脂、 干燥后， 用热水反复 提取25次， 合并提取液 ； 所得提取液浓缩后用三氯乙酸脱蛋白， 离心分离， 所得上清液经 中和、 透析、 浓缩， 得到一浓缩液 ； 加入25倍于浓缩液体积的乙醇， 离心分离得沉淀， 该沉 淀经真空干燥， 得水提粗多糖 WGE ； 说 明 书 CN 101684163 B2/5 页 4 0011 2) 天麻多糖 (WGESC1A) 的制备 ： 向上述步骤 1) 得到的水提粗多糖 WGE 加入适量 水溶解并离心， 上清液用二乙基氨乙基纤维素 DEAE- 纤维素 (Cl-型。
9、 ) 为载体进行柱层析 分离， 分别以水、 0.1 0.4mol/L NaCl 溶液剃度洗脱， 其中 0.1mol/L NaCl 洗脱液经浓缩、 透析以及冷冻干燥得到白色絮状固体天麻多糖 WGESC1A ； 0012 3) 天麻多糖硫酸化衍生物 (WSS25) 的制备 ： 经分子筛处理的吡啶冰浴冷却后， 将 氯磺酸逐滴加入到吡啶中制成酯化试剂 ； 经分子筛处理的甲酰胺中溶解天麻多糖， 该溶液 冰浴冷却下， 然后往该溶液中逐滴加入上述制备的酯化试剂 ； 反应完毕， 反应液调 pH 值至 7.8， 然后浓缩， 所得浓缩液对饱和的NaHCO3溶液透析后， 换成对水透析 ； 透析袋内液冷冻干 燥得天麻。
10、多糖的硫酸化衍生物 WSS25。 0013 更具体而言， 在步骤 1) 中， 取天麻干燥饮片， 用 95wt乙醇脱脂 1 周， 脱脂后室温 自然干燥 ； 干燥后， 用 100水反复浸渍天麻饮片数次， 至提取液用硫酸 - 苯酚检测无明显 反应， 将每次的提取液合并后加热浓缩 ； 所得浓缩液冷却后以 15 (W/V) 三氯乙酸溶液脱 蛋白， 离心分离， 所得上清液用 1mol/L NaOH 中和至 pH7.0， 然后对流动水透析 72h， 内液浓 缩至小体积， 在搅拌下加入三倍体积的 95wt乙醇， 静置过夜， 倾去上清液， 离心分离， 所得 沉淀依次用 2 倍体积的无水乙醇、 丙酮洗涤以脱去水分。
11、， 离心分离， 所得沉淀置 40下真空 干燥， 得水提粗多糖 WGE。 0014 在步骤 2) 中， 取水提粗多糖 WGE， 用适量水溶解， 离心除去不溶物， 上清液通过二 乙基氨乙基纤维素DEAE-纤维素(Cl-型)柱进行分离。 逐步以水、 0.1mol/LNaCl、 0.2mol/ LNaCl和0.4mol/LNaCl洗脱， 用硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线， 根据洗脱曲线分别收取合并洗 脱液， 其中 0.1mol/L NaCl 的洗脱液经浓缩， 对蒸馏水透析， 所得透析袋内液冷冻干燥得天 麻多糖 WGESC1A。 0015 在所述步骤 3) 中， 经分子筛处理的吡啶冰浴冷却后， 以氯磺酸 / 。
12、吡啶 V/V 2:1 的氯磺酸逐滴加入到吡啶中制成酯化试剂 ； 每 8mL4分子筛处理的甲酰胺中溶解 158.9mg的天麻多糖， 该溶液冰浴至0， 然后往溶液中逐滴加入2mL新鲜制备的酯化试剂 ； 加毕， 25水浴反应 4h ； 反应完毕， 反应液用 5mol/L NaOH 调 pH 值至 7.8， 然后 30减压 浓缩至小体积 ； 浓缩液对 2L 饱和的 NaHCO3溶液透析 24h 后， 换成对 2L 去离子水透析， 每次 24h， 共三次 ； 透析袋内液冷冻干燥得天麻多糖的硫酸化衍生物。图 2 为 WSS25 的 13C NMR 谱 图， 由图 2 可知硫酸化主要发生在 6 位。 001。
13、6 在上述提取过程中， 天麻饮片购自上海市徐汇中药饮片有限公司 ； 水可以采用蒸 馏水或去离子水 ； 透析所用膜为本领域常规使用的透析膜。 0017 本发明的又一目的是提供所述天麻多糖的硫酸化衍生物在制备抗肿瘤药物中的 用途， 经体内外实验证明天麻多糖的硫酸化衍生物通过抑制 Id1 的表达而抑制血管生成， 进而抑制肿瘤的生长， 具有明显抗肿瘤作用， 因此有望开发为抗肿瘤的药物。 附图说明 0018 图 1 为 WGESC1A 的 13C NMR 谱图 ； 0019 图 2 为 WSS25 的 13C NMR 谱图 ； 0020 图 3 显示 WSS25 对 Id1-luc/HEK293 细胞中。
14、荧光素酶表达的影响 ； 0021 图 4 显示 WSS25 在不同浓度下对 HMEC-1 在基质胶上管腔形成的抑制作用 ； 说 明 书 CN 101684163 B3/5 页 5 0022 图 5 显示 WSS25 不同浓度和不同处理时间对 HMEC-1 细胞生长的影响 ； 0023 图 6 显示 WSS25 对肝癌细胞 Bel7402 在裸小鼠中移植瘤生长的抑制作用 ； 0024 图 7 显示 WSS25 对肝癌细胞 SMMC7721 在裸小鼠中移植瘤生长的抑制作用。 具体实施方式 0025 实施例 1 从天麻中提取天麻多糖 0026 取天麻干燥饮片 1000g， 用 5L95wt乙醇脱脂 。
15、1 周， 脱脂后室温自然干燥。干燥后 的天麻饮片 975g 用沸水提取， 每次加水 30L， 每次 4h， 硫酸 - 苯酚法检测提取液的糖含量， 直至糖反应不明显。 将每次的提取液合并， 浓缩至小体积， 以15(W/V)三氯乙酸溶液脱蛋 白， 离心分离， 所得上清液用 1mol/L NaOH 中和至 pH7.0， 然后对流动水透析 72h， 内液浓缩 至小体积， 在搅拌下加入三倍体积的 95wt乙醇， 静置过夜， 倾去上清液， 离心分离， 所得沉 淀依次用无水乙醇、 丙酮洗涤以脱去水分， 离心分离， 沉淀置 40下真空干燥， 得水提粗多 糖 WGE195g。 0027 取 5g 水提粗多糖 W。
16、GE， 适量水溶解， 离心除去不溶物， 上清液通过二乙基氨乙基 纤维素 DEAE- 纤维素 (Cl-型 ) 柱进行分离。逐步以蒸馏水、 0.1mol/L NaCl、 0.2mol/ L NaCl 和 0.4mol/L NaCl 洗脱， 硫酸 - 苯酚法绘制洗脱曲线， 根据洗脱曲线分别收取合并 洗脱液， 其中 0.1mol/L NaCl 洗脱液经浓缩、 对蒸馏水透析， 和所得透析袋内液冷冻干燥得 WGESC1A(2.0g)。 0028 物化性质测定 ： 按照多糖的常规方法， 以分子量已知的右旋糖酐 T-700， T-580， T-110， T-80， T-40， T-11 为标准， Waters。
17、 HPGPC 测定 WGESC1A 峰尖分子量为 2.8105， 使用 旋光仪 Perkin-Elmer241M 测得其在浓度为 0.5mg/mL 水溶液中比旋度为 +95。 0029 糖组成分析 ： 取 2mgWGESC1A 样品， 110下封管用三氟乙酸 (TFA) 水解 1.8 小时， 水解产物经乙酰化后用岛津 GC-14B 气相色谱仪分析。结果显示， 该多糖为葡聚糖。 0030 化学结构测定 ： 按照多糖的常规方法， 室温下， 取 40mgWGESC1A 经氢交换后用核磁 共振仪 Brucker AM-400 获得其 13C NMR 谱图 ( 参见图 1)。取 8mgWGESC1A 按。
18、照 Needs 方法 进行甲基化分析， 结果显示 WGESC1A 中末端葡萄糖、 (1 4) 连接的葡萄糖和 1、 4、 6 连接的 葡萄糖的摩尔比为 1:16:1， 是一 (1 4) 连接的葡聚糖， 6 位上带有少量 (1 4) 连接 的寡聚葡萄糖。 0031 实施例 2 天麻多糖硫酸化衍生物的制备 0032 经分子筛处理的吡啶冰浴冷却后， 以氯磺酸 / 吡啶 V/V 2:1 的氯磺酸逐滴 加入到吡啶中制成酯化试剂。每 8mL分子筛处理的甲酰胺中溶解 158.9mg 的 WGESC1A， 该溶液冰浴至 0， 然后往溶液中逐滴加入 2mL 新鲜制备的酯化试剂。加毕， 25水浴反应 4h。反应完。
19、毕， 反应液用 5mol/L NaOH 调 pH 值至 7.8， 然后 30减压浓缩至小体积。浓缩 液对 2L 饱和的 NaHCO3溶液透析 24h 后， 换成对 2L 去离子水透析， 每次 24h， 共三次。透析 袋内液冷冻干燥得 WGESC1A 的硫酸化衍生物 WSS25。图 2 为 WSS25 的 13C NMR 谱图， 由图 2 可知硫酸化主要发生在 6 位。 0033 物化性质测定 ： 按照多糖的常规方法， 以分子量已知的右旋糖酐 T-700， T-580， T-110， T-80， T-40， T-11 为标准， Waters HPGPC 测定 WSS25 峰尖分子量为 6.510。
20、4， 使用旋 光仪 Perkin-Elmer241M 测得其在浓度为 0.5mg/ml 水溶液中比旋度为 +150.0。 说 明 书 CN 101684163 B4/5 页 6 0034 试验性实施例 0035 1、 Id1 表达抑制剂的筛选 0036 将装载 Id1 启动子区的 pGL4.14luc2/Hygro 转入人胚肾细胞 HEK293( 来源于美 国典型培养物保存中心 )， 经潮霉素筛选得稳定细胞株 Id1-luc/HEK293， 该细胞株用于 Id1 表达抑制剂的筛选， 用含 10胎牛血清 ( 杭州四季青产品 ) 的 DMEM 培养基于 37 度 5 CO2 的培养箱培养。筛选时将。
21、 90LId1-luc/HEK293 细胞加入 96 孔板， 每孔 2500 个细胞， 24 小 时后 10L250g/mL 和 1000g/mL 的 WSS25 加入， 每个浓度设三个复孔， 等体积的生理盐 水作为对照， 继续培养18小时后用luminometer(NOVOstar BMG LABTECH.Pty.Ltd)测定荧 光素酶 (luciferase) 活性， 抑制率 ( 对照组荧光素酶相对活性 - 加药组荧光素酶相对 活性 )/ 对照组荧光素酶相对活性 100。25g/mL 和 100g/mL 的 WSS25 的抑制率分 别为 39.25和 46.24， 如图 3 所示。 003。
22、7 2、 WSS25 对人微血管内皮细胞 HMEC-1 管腔形成的影响 0038 在 96 孔板内加入基质胶 (Matrigel， BD Biosciences)， 每孔 50L， 37 度放置 30 分钟后， 分别加入 10LWSS25 和 90L 含 3104个 HMEC-1 细胞的培养基， 使 WSS25 终浓 度分别为 6.25、 25 和 50g/mL， 每个浓度设三个复孔。培养基为含有 2mM 谷氨酰胺、 10ng/ mL EGF( 上海 PrimeGene 生物科技公司产品 )、 15 FBS( 杭州四季青产品 )、 100U/mL 青霉 素和 100g/mL 链霉素的 MCDB。
23、131(Invitrogen 产品 ) 培养基。于 37 度 5 CO2的培养箱 培养 10h 后， 显微镜 (Olympus IX51) 下拍照， 放大倍数为 200， 在 25g/mL 的浓度下 WSS25 基本抑制了在基质胶上的 HMEC-1 细胞管腔的形成， 而在低浓度时亦有微弱的抑制作用， 如 图 4 所示。 0039 3、 WSS25 对内皮细胞的细胞毒性 0040 含有 2mM 谷氨酰胺、 10ng/mL EGF( 上海 PrimeGene 生物科技公司产品 )、 15 FBS(杭州四季青产品)、 100U/mL青霉素和100g/ml链霉素的MCDB131(Invitrogen产。
24、品) 培养基培养的生长状态良好的人微血管内皮细胞 HMEC-1 细胞 90L 种入 96 孔板， 每孔加 入5000个细胞， 于37度5CO2的培养箱中培养24h后分别加入10L WSS25， 使终浓度分 别为10、 50、 100、 500和1000g/mL， 每个浓度设三个复孔， 继续于37度5CO2的培养箱内 培养， 24h， 48h， 72h 后加入 20L5mg/mL MTT(Sigma 产品 )， 37 度反应 4h 后加入 100L 裂 解液 (10 SDS-5异丁醇 -0.1M HCl)37 度裂解 12 16h， 570 度下测定吸光值 (A570)， 计 算抑制率， 抑制率。
25、 ( 对照 A570- 加药组 A570)/ 对照 A570100。结果表明 WSS25 在剂量 1mg/mL 时仅有微弱的细胞毒作用， 而在剂量 100g/mL 时对细胞几乎没有影响， 如图 5 所 示。 0041 4、 WSS25 对裸鼠移植瘤生长的抑制作用 0042 4.1 受试药物的准备 ： 0043 本发明中制备的受试药物 WSS25 为一硫酸化的葡聚糖， 易溶于水， 实验过程中以 生理盐水为溶媒配制成相应浓度溶液， 溶液经 0.22m 微孔滤膜过滤后给药。 0044 4.2WSS25 对裸小鼠中移植瘤生长的抑制作用实验 0045 4.2.1WSS25 对肝癌细胞 Bel7402 在。
26、裸小鼠中移植瘤生长的抑制作用实验 0046 5-6 周龄购自上海斯莱克实验动物有限责任公司的雄性 BALB/cA 裸小鼠右前肢皮 下注射 400L 含 4106个肝癌细胞 Bel7402( 来源于中国科学院典型培养物保藏委员会 说 明 书 CN 101684163 B5/5 页 7 细胞库 ) 的细胞悬液， 游标卡尺测量， 待肿瘤体积长至 100mm3左右后随机分成阴性对照组 和 100mg/kgWSS25 给药组， 每组裸鼠 5 只， 开始给药。给药组中每只小鼠给予 10mg/mL 生理 盐水配制的 WSS250.1mL/10g， 给药前新鲜配置， 对照组中每只小鼠给予相应体积生理盐水。 从。
27、尾静脉给药 ( 给药前用生理盐水新鲜配置 )， 每两天一次， 持续给药 10 次， 每次给药前称 鼠重。给药后， 每 3 天以游标卡尺测量一次瘤体积， 瘤体积 V 0.52ab2， 其中 a 为移 植瘤最长距离， b 为移植瘤最短距离。第 21 天处死， 以游标卡尺测得对照组平均瘤体积为 822.97mm3， 给药组平均瘤体积为 272.195mm3， 计算抑制率 ( 对照组瘤体积 - 给药组瘤体 积 )/ 对照组瘤体积 100， 抑制率为 66.9， 如图 6 所示。 0047 4.2.2WSS25 对肝癌细胞 SMMC7721 在裸小鼠中移植瘤生长的抑制作用 0048 Balb/c 品系裸。
28、小鼠， 雄性， 12 只， 体重 231g， 由上海斯莱克实验动物有限责任公 司提供。将 1107个人肝癌 SMMC-7721 肿瘤细胞 ( 来源于中国科学院典型培养物保藏委 员会细胞库 ) 注射入裸小鼠的腋下， 传 3 代后取瘤块， 切成 1.5mm3大小瘤块， 种植于试验裸 小鼠的腋下， 游标卡尺测量， 待肿瘤生长至 100mm3左右， 将动物随机分组开始给药。12 只接 种 SMMC-7721 肿瘤细胞的裸小鼠随机分成 2 组， 1) 阴性对照组 6 只， 2)WSS25100mg/kg 组 6 只。阴性对照组隔天尾静脉注射生理盐水 0.1mL/10g， WSS25100mg/kg 组 。
29、( 给药前新鲜配置 于生理盐水中 ) 隔天尾静脉注射 10mg/mL 的 WSS250.1mL/10g。每 3 天称重并以游标卡尺测 定肿瘤体积， 给药 10 次后停药， 阴性对照组和 WSS25100mg/kg 组裸小鼠体重在实验治疗前 后均无显著变化， 各组均无一动物死亡， 于第 23 天处死小鼠， 称体重， 以游标卡尺测定瘤块 体积， 计算相对肿瘤体积 (RTV)、 相对肿瘤增值率 (T/C)。肿瘤体积 V ab2/2， 其中 a 为 移植瘤最长距离， b 为移植瘤最短距离。相对肿瘤体积 (RTV) 的计算遵循 ： RTV Vt/V0， Vt 为给定时间的肿瘤体积， V0为分笼给药时测量。
30、所得肿瘤体积。以相对肿瘤增值率 T/C( ) 作为抗肿瘤活性评价指标， T/C( ) 给药组平均相对肿瘤体积 / 对照组平均相对肿瘤体 积100。 若T/C60， 统计学检测有显著性差异， 视为具有明显的体内抗肿瘤作用。 与相应天数的阴性对照组比较， WSS25100mg/kg 组裸小鼠移植瘤体积从给药后第 3 天开始 减小。阴性对照组相对瘤体积 (RTV) 为 3.0， WSS25100mg/kg 组的 RTV 值为 1.68， 相对肿瘤 增值率 (T/C) 为 56， 如图 7 所示。 0049 通过以上实验可以看出， 本发明中制备的天麻多糖硫酸化衍生物 WSS25 具有明显 的抗肿瘤作用， 而且对内皮细胞几乎没有毒性， 因此有望被开发成抗肿瘤的药物。 说 明 书 CN 101684163 B1/3 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101684163 B2/3 页 9 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101684163 B3/3 页 10 图 6 图 7 说 明 书 附 图 。