一种高产Β葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410075528.5	申请日：	2014.03.04
公开号：	CN104152361A	公开日：	2014.11.19
当前法律状态：	实审	有效性：	审中
法律详情：	实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/16申请日:20140304\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/16	主分类号：	C12N1/16
申请人：	西北农林科技大学
发明人：	陶永胜; 彭传涛
地址：	712100 陕西省西安市杨凌示范区西农路西北农林科技大学葡萄酒学院
优先权：
专利代理机构：	西安新思维专利商标事务所有限公司 61114	代理人：	韩翎
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内容摘要

本发明涉及一种微生物的筛选方法技术领域，具体涉及一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法。其根据七叶灵(6,7-二羟基-香豆素-β-D-葡萄糖苷)在β-葡萄糖苷酶的作用下能生成葡萄糖和七叶苷原(6,7-二羟基-香豆素)，七叶苷原能和Fe3+作用呈现棕黑色来辨别产糖苷酶菌株的96孔板显色技术，能同时对大量菌株进行高效快速的筛选，同时根据颜色深浅能灵敏精确判断菌株产酶高低，还可以减少筛选培养基的用量。一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，所述的筛选方法包括以下操作步骤：(1)培养基的配制；(2)非酿酒酵母菌的纯化，得单菌落；(3)单菌落的活化；(4)在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落；(5)通过颜色筛选高产糖苷酶菌株。

权利要求书

1.  一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在于：所述的筛选方法包括以下操作步骤：(1)培养基的配制；(2) 非酿酒酵母菌的纯化，得单菌落；(3) 单菌落的活化；(4) 在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落；(5) 通过颜色筛选高产糖苷酶菌株。

2.  根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在于：
所述的步骤（1）培养基的配制：将重量百分比为0.3%的七叶苷，重量百分比为0.05%的柠檬酸铁，重量百分比为0.2%的NaCl，重量百分比为0.05%的MgSO₄.7H₂O，重量百分比为0.1%的KH₂PO₄和重量百分比为2%的琼脂加水混合后在121℃灭菌20min，得培养基；
所述的步骤（2）非酿酒酵母菌的纯化：将非酿酒酵母菌先在WL营养琼脂培养基上培养5天，得单菌落；
所述的步骤（3）单菌落的活化：根据单菌落颜色、菌落大小、突起、边缘及其形态的不同，分别挑取不同的单菌落，在添加YPD液体培养基的试管中活化，每只试管添加YPD液体培养基5mL，活化两天；
所述的步骤（4）在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落：在96孔板中，每孔添加250μl培养基；再添加经活化后的单菌落15μl，每个活化后的单菌落添加两个孔，与作为对照，同时涂布均匀，记录好每个单菌落与96孔板相对应的编号；
所述的步骤（5）通过颜色筛选高产糖苷酶菌株：培养3天后，选择呈现颜色深的棕黑色单菌落，得胶红酵母和膜璞毕赤酵母，胶红酵母和膜璞毕赤酵母均为高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株。

3.  根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在于：所述的非酿酒酵母菌为美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母或假丝酵母。

说明书

一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法
一、技术领域：
本发明涉及一种微生物的筛选方法技术领域，具体涉及一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法。
二、背景技术：
  β-葡萄糖苷酶 (EC3. 2. 1. 21)，其英文名是 β-glucosidas，是纤维素分解酶系中重要组成成分之一，属于水解酶类，它的特性是可水解结合于未端、非还原性的 β-D-糖苷键，同时释放 β-D-葡萄糖和相应的配基；此外还能微弱地水解对硝基苯 β-D-半乳糖和 β-D-木糖苷。β-葡萄糖苷酶的应用非常广泛，被用来增香、分解纤维质产酒精、改善发酵制品的风味等方面。β-葡萄糖苷酶在很多行业内广泛应用, 具有巨大的商业价值。特别是对于葡萄酒的增香作用更是显著。现今用于酿酒的绝大多数欧亚种 (Vitis vinifera) 葡萄栽培品种的成熟果实闻起来没有明显的特征香气，但是所酿酒都有各品种独特的香气特征。原因是大多数酿酒葡萄品种果实含有的是香气成分的糖苷结合体，人体嗅觉器官无法感知这些不挥发的香气成分糖苷，酿酒过程促进这些香气前体物质的释放水解，挥发出游离香气成分。葡萄酒香气糖苷是香气成分的预备库。比它们对应的游离态成分多好几倍，甚至几十倍。葡萄果粒和酿酒酵母是酿造过程中酶促反应主要酶的来源，但是典型的葡萄酒生产条件，高含糖量高酒精度低PH值和高浓度多酚物质等，限制了葡萄与酿酒酵母中糖苷酶的活性。所以，从自然界中直接筛选在葡萄酒酿造环境中仍有高效酶活力的β-葡萄糖苷酶的酵母菌株,成为得到高产β-葡萄糖苷酶菌株最直接的方法。
   由于产酶微生物种类丰富，数量巨大，所以通过定量测定β-葡萄糖苷酶活性来筛选高产β-葡萄糖苷酶的菌株工作量巨大。现在研究开发了几种能定性分析或鉴定β-葡萄糖苷酶的显色技术，然后在此基础上进行定量分析，就会大大减少工作量，提高筛选效率。普遍采用的传统初筛方法主要有以下几种：在聚丙烯酰胺凝胶电泳染色时, 将凝胶保温在对-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷溶液中, 会在β-葡萄糖苷酶的位置处出现由硝基酚引起的绿色条带。但其准确性不够, 而且由于硝基酚具有较高的扩散性,其条带会很快逐渐消失。Rissler 利用6-溴-2-萘基β-D-葡萄糖苷为电泳凝胶的保温溶液并以重盐为作用试剂, 酶的降解产物溴萘酚在重盐的作用下形成红色沉淀。由于重盐的感光性, 该技术对操作过程要求苛刻。使用4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷作为底物, 经β-葡萄糖苷酶作用后分解为4-甲基伞形酮, 利用4-甲基伞形酮具有强烈荧光的特点进行检测, 因而需要紫外光才能观察，该技术操作复杂。以对硝基苯-β-葡萄糖苷作为底物，经β-葡萄糖苷酶作用后分解为对硝基苯酚，然后加入碳酸钠进行显色反应，产酶的菌株会呈现亮黄色。该方法灵敏度高，快速，但成本昂贵，而且透明圈和培养基的颜色相似因此不便于分辨。上述方法同时只能处理筛选一株菌株，所以筛选产糖苷酶菌株工作量巨大。
三、发明内容：
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其根据七叶灵( 6,7-二羟基-香豆素-β-D-葡萄糖苷)在β-葡萄糖苷酶的作用下能生成葡萄糖和七叶苷原( 6,7-二羟基-香豆素)，七叶苷原能和Fe³⁺作用呈现棕黑色来辨别产糖苷酶菌株的96孔板显色技术，能同时对大量菌株进行高效快速的筛选，同时根据颜色深浅能灵敏精确判断菌株产酶高低，还可以减少筛选培养基的用量。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在于：所述的筛选方法包括以下操作步骤：(1)培养基的配制；(2) 非酿酒酵母菌的纯化，得单菌落；(3) 单菌落的活化；(4) 在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落；(5) 通过颜色筛选高产糖苷酶菌株。
所述的步骤（1）培养基的配制：将重量百分比为0.3%的七叶苷，重量百分比为0.05%的柠檬酸铁，重量百分比为0.2%的NaCl，重量百分比为0.05%的MgSO₄.7H₂O，重量百分比为0.1%的KH₂PO₄和重量百分比为2%的琼脂加水混合后在121℃灭菌20min，得培养基；
所述的步骤（2）非酿酒酵母菌的纯化：将非酿酒酵母菌先在WL营养琼脂培养基上培养5天，得单菌落；
所述的步骤（3）单菌落的活化：根据单菌落颜色、菌落大小、突起、边缘及其形态的不同，分别挑取不同的单菌落，在添加YPD液体培养基的试管中活化，每只试管添加YPD液体培养基5mL，活化两天；
所述的步骤（4）在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落：在96孔板中，每孔添加250μl培养基；再添加经活化后的单菌落15μl，每个活化后的单菌落添加两个孔，与作为对照，同时涂布均匀，记录好每个单菌落与96孔板相对应的编号；
所述的步骤（5）通过颜色筛选高产糖苷酶菌株：培养3天后，选择呈现颜色深的棕黑色单菌落，得胶红酵母（保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC NO：M2013660；分类命名：胶红酵母北29（Rhodotorula mucilaginosa 北29）。）和膜璞毕赤酵母（保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学，保藏日期：2013年12月13日，保藏编号： CCTCC NO：M2013659；分类命名：膜璞毕赤酵母南13（Pichia membranifaciens 南13）。），胶红酵母（保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC NO：M2013660；分类命名：胶红酵母北29（Rhodotorula mucilaginosa 北29）。）和膜璞毕赤酵母（保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学，保藏日期：2013年12月13日，保藏编号： CCTCC NO：M2013659；分类命名：膜璞毕赤酵母南13（Pichia membranifaciens 南13）。）均为高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株。
所述的非酿酒酵母菌为美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母或假丝酵母。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
1、本发明利用96孔板代替传统平板进行筛选产酶菌株，能同时对大量菌株进行筛选，降低了菌株筛选的工作量，同时通过对比颜色深浅来定性判断菌株产酶高低。
   2、本发明对96孔板进行创新性应用，96孔板原本是用于培养细胞的平板，在本发明中用于筛选菌株，可以用很少的筛选培养基筛选大量的菌株。
   3、本发明筛选培养基的配制，可以使显色反应(棕黑色）与筛选培养基(透明色）区别明显，所以对筛选产糖苷酶菌株较为灵敏和准确。
四、附图说明：
图1为本发明的显色技术流程图。
五、具体实施方式：
    参见图1：本发明是将筛选培养基加入到96孔板中，然后添加活化的菌株，最终通过显色筛选出高产糖苷酶菌株。具体实施步骤如下：
所述的步骤（1）培养基的配制：将重量百分比为0.3%的七叶苷，重量百分比为0.05%的柠檬酸铁，重量百分比为0.2%的NaCl，重量百分比为0.05%的MgSO₄.7H₂O，重量百分比为0.1%的KH₂PO₄和重量百分比为2%的琼脂加水混合后在121℃灭菌20min，得培养基；
所述的步骤（2）非酿酒酵母菌的纯化：为了避免不纯菌株带来干扰，得到较纯的单菌落菌株，将非酿酒酵母菌先在WL营养琼脂培养基上培养5天，得单菌落；
所述的非酿酒酵母菌为美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母或假丝酵母。
所述的步骤（3）单菌落的活化：根据单菌落颜色、菌落大小、突起、边缘及其形态的不同，分别挑取不同的单菌落，在添加YPD液体培养基的试管中活化，每只试管添加YPD液体培养基5mL，活化两天；
所述的步骤（4）在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落：在96孔板中，每孔添加250μl培养基；再添加经活化后的单菌落15μl，每个活化后的单菌落添加两个孔，与作为对照，同时涂布均匀，记录好每个单菌落与96孔板相对应的编号；
所述的步骤（5）通过颜色筛选高产糖苷酶菌株：培养3天后，选择呈现颜色深的棕黑色单菌落，得胶红酵母（保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC NO：M2013660；分类命名：胶红酵母北29（Rhodotorula mucilaginosa 北29）。）和膜璞毕赤酵母（保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学，保藏日期：2013年12月13日，保藏编号： CCTCC NO：M2013659；分类命名：膜璞毕赤酵母南13（Pichia membranifaciens 南13）。），胶红酵母（保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC NO：M2013660；分类命名：胶红酵母北29（Rhodotorula mucilaginosa 北29）。）和膜璞毕赤酵母均为高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株。
胶红酵母（保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC NO：M2013660；分类命名：胶红酵母北29（Rhodotorula mucilaginosa 北29）。）和膜璞毕赤酵母（保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学，保藏日期：2013年12月13日，保藏编号： CCTCC NO：M2013659；分类命名：膜璞毕赤酵母南13（Pichia membranifaciens 南13）。）是高产糖苷酶菌株，可用于混合发酵或产糖苷酶增加葡萄酒香气。经定量方法分析：胶红酵母产酶活性为42.1U/ml×10^-3；膜璞毕赤酵母42.51U/ml×10^-3。
所述的步骤（6）定量验证高产糖苷酶菌株活性：
    a  提取粗酶液：将筛选的胶红酵母（保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学；保藏日期：2013年12月13日；保藏编号：CCTCC NO：M2013660；分类命名：胶红酵母北29（Rhodotorula mucilaginosa 北29）。）和膜璞毕赤酵母（保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国、武汉、武汉大学，保藏日期：2013年12月13日，保藏编号： CCTCC NO：M2013659；分类命名：膜璞毕赤酵母南13（Pichia membranifaciens 南13）。）按10%的接种量接入到发酵培养基（300mL 三角瓶装20ml培养基，121℃灭活20min），温度为30℃，摇床150rpm/min条件下培养72h，取出发酵液1.0ml于1.5ml离心管中，8000rpm/min离心10min除菌，收集上清液，即为β-葡萄糖苷酶粗酶液。
    b 波长选择：0.1、0.3、0.5 mmol/L的对硝基苯酚溶液，分别取5ml，用分光光度计扫描最大吸收峰波长，扫描条件：吸光度范围为0.00-3.00，波长范围为390-415nm。选择最大吸收波长。
β-葡萄糖苷酶酶活的测定：（1）对硝基苯酚标准溶液的配制称取0.0209g对硝基苯酚，用蒸馏水溶解，转移到100ml的容量瓶中，定容，摇匀，配制成1.5mmol/L的对硝基苯酚溶液。分别配制成0.05mmol/L，0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.3 mmol/L，0.4 mmol/L，0.5mmol/L，0.6 mmol/L，0.7 mmol/L，0.8 mmol/L的对硝基苯酚溶液。
对硝基苯酚标准曲线   取10支25ml刻度管，分别加入0.05mmol/L，0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.3mmol/L，0.4 mmol/L，0.5mmol/L，0.6 mmol/L，0.7 mmol/L，0.8 mmol/L对硝基苯酚溶液0.4ml，再加入2.0ml 1 mmol/L的碳酸钠溶液和10ml的蒸馏水，室温放置5min后摇匀。以蒸馏水作为空白对照，在上述最大吸收波长处测定吸光值A。以吸光值为纵坐标，对硝基苯酚的浓度为横坐标，制定标准曲线。
（2）β-葡萄糖苷酶酶活的测定  相对应pH值加入 750 μL 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入200ul的粗酶提取液，加入250 μL1 mmol/L的对硝基苯-β-葡萄糖苷（pNPG）40℃处理60min，然后加入1.0 ml 的1mol/L Na₂CO₃ 终止反应。在上述最大吸收波长处测吸光度，蒸馏水为空白对照。每个样重复两次。β-葡萄糖苷酶酶活力单位（IU）定义为：40℃下1min内催化生成1μmol对硝基苯酚所要的酶量。

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1、10申请公布号CN104152361A43申请公布日20141119CN104152361A21申请号201410075528522申请日20140304CCTCCNOM201365920131213CCTCCNOM201366020131213C12N1/1620060171申请人西北农林科技大学地址712100陕西省西安市杨凌示范区西农路西北农林科技大学葡萄酒学院72发明人陶永胜彭传涛74专利代理机构西安新思维专利商标事务所有限公司61114代理人韩翎54发明名称一种高产葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法57摘要本发明涉及一种微生物的筛选方法技术领域，具体涉及一种高产葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法。

2、。其根据七叶灵6,7二羟基香豆素D葡萄糖苷在葡萄糖苷酶的作用下能生成葡萄糖和七叶苷原6,7二羟基香豆素，七叶苷原能和FE3作用呈现棕黑色来辨别产糖苷酶菌株的96孔板显色技术，能同时对大量菌株进行高效快速的筛选，同时根据颜色深浅能灵敏精确判断菌株产酶高低，还可以减少筛选培养基的用量。一种高产葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，所述的筛选方法包括以下操作步骤1培养基的配制；2非酿酒酵母菌的纯化，得单菌落；3单菌落的活化；4在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落；5通过颜色筛选高产糖苷酶菌株。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书4页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利。

3、要求书1页说明书4页附图1页10申请公布号CN104152361ACN104152361A1/1页21一种高产葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在于所述的筛选方法包括以下操作步骤1培养基的配制；2非酿酒酵母菌的纯化，得单菌落；3单菌落的活化；4在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落；5通过颜色筛选高产糖苷酶菌株。2根据权利要求1所述的一种高产葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在于所述的步骤（1）培养基的配制将重量百分比为03的七叶苷，重量百分比为005的柠檬酸铁，重量百分比为02的NACL，重量百分比为005的MGSO47H2O，重量百分比为01的KH2PO4和重量百分比为2的琼脂加水混合。

4、后在121灭菌20MIN，得培养基；所述的步骤（2）非酿酒酵母菌的纯化将非酿酒酵母菌先在WL营养琼脂培养基上培养5天，得单菌落；所述的步骤（3）单菌落的活化根据单菌落颜色、菌落大小、突起、边缘及其形态的不同，分别挑取不同的单菌落，在添加YPD液体培养基的试管中活化，每只试管添加YPD液体培养基5ML，活化两天；所述的步骤（4）在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落在96孔板中，每孔添加250L培养基；再添加经活化后的单菌落15L，每个活化后的单菌落添加两个孔，与作为对照，同时涂布均匀，记录好每个单菌落与96孔板相对应的编号；所述的步骤（5）通过颜色筛选高产糖苷酶菌株培养3天后，选择呈现颜色深的。

5、棕黑色单菌落，得胶红酵母和膜璞毕赤酵母，胶红酵母和膜璞毕赤酵母均为高产葡萄糖苷酶酵母菌株。3根据权利要求1所述的一种高产葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在于所述的非酿酒酵母菌为美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母或假丝酵母。权利要求书CN104152361A1/4页3一种高产葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法0001一、技术领域本发明涉及一种微生物的筛选方法技术领域，具体涉及一种高产葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法。0002二、背景技术葡萄糖苷酶EC32121，其英文名是GLUCOSIDAS，是纤维素分解酶系中重要组成成分之一，属于水解酶类，它的特性是可水解结合于未端、非还原性的D糖苷键，。

6、同时释放D葡萄糖和相应的配基；此外还能微弱地水解对硝基苯D半乳糖和D木糖苷。葡萄糖苷酶的应用非常广泛，被用来增香、分解纤维质产酒精、改善发酵制品的风味等方面。葡萄糖苷酶在很多行业内广泛应用,具有巨大的商业价值。特别是对于葡萄酒的增香作用更是显著。现今用于酿酒的绝大多数欧亚种VITISVINIFERA葡萄栽培品种的成熟果实闻起来没有明显的特征香气，但是所酿酒都有各品种独特的香气特征。原因是大多数酿酒葡萄品种果实含有的是香气成分的糖苷结合体，人体嗅觉器官无法感知这些不挥发的香气成分糖苷，酿酒过程促进这些香气前体物质的释放水解，挥发出游离香气成分。葡萄酒香气糖苷是香气成分的预备库。比它们对应的游离态。

7、成分多好几倍，甚至几十倍。葡萄果粒和酿酒酵母是酿造过程中酶促反应主要酶的来源，但是典型的葡萄酒生产条件，高含糖量高酒精度低PH值和高浓度多酚物质等，限制了葡萄与酿酒酵母中糖苷酶的活性。所以，从自然界中直接筛选在葡萄酒酿造环境中仍有高效酶活力的葡萄糖苷酶的酵母菌株,成为得到高产葡萄糖苷酶菌株最直接的方法。0003由于产酶微生物种类丰富，数量巨大，所以通过定量测定葡萄糖苷酶活性来筛选高产葡萄糖苷酶的菌株工作量巨大。现在研究开发了几种能定性分析或鉴定葡萄糖苷酶的显色技术，然后在此基础上进行定量分析，就会大大减少工作量，提高筛选效率。普遍采用的传统初筛方法主要有以下几种在聚丙烯酰胺凝胶电泳染色时,将凝。

8、胶保温在对硝基苯基D葡萄糖苷溶液中,会在葡萄糖苷酶的位置处出现由硝基酚引起的绿色条带。但其准确性不够,而且由于硝基酚具有较高的扩散性,其条带会很快逐渐消失。RISSLER利用6溴2萘基D葡萄糖苷为电泳凝胶的保温溶液并以重盐为作用试剂,酶的降解产物溴萘酚在重盐的作用下形成红色沉淀。由于重盐的感光性,该技术对操作过程要求苛刻。使用4甲基伞形酮D葡萄糖苷作为底物,经葡萄糖苷酶作用后分解为4甲基伞形酮,利用4甲基伞形酮具有强烈荧光的特点进行检测,因而需要紫外光才能观察，该技术操作复杂。以对硝基苯葡萄糖苷作为底物，经葡萄糖苷酶作用后分解为对硝基苯酚，然后加入碳酸钠进行显色反应，产酶的菌株会呈现亮黄色。该。

9、方法灵敏度高，快速，但成本昂贵，而且透明圈和培养基的颜色相似因此不便于分辨。上述方法同时只能处理筛选一株菌株，所以筛选产糖苷酶菌株工作量巨大。0004三、发明内容本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种高产葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其根据七叶灵6,7二羟基香豆素D葡萄糖苷在葡萄糖苷酶说明书CN104152361A2/4页4的作用下能生成葡萄糖和七叶苷原6,7二羟基香豆素，七叶苷原能和FE3作用呈现棕黑色来辨别产糖苷酶菌株的96孔板显色技术，能同时对大量菌株进行高效快速的筛选，同时根据颜色深浅能灵敏精确判断菌株产酶高低，还可以减少筛选培养基的用量。0005为实现上述目的，本发明采用的。

10、技术方案为一种高产葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选方法，其特征在于所述的筛选方法包括以下操作步骤1培养基的配制；2非酿酒酵母菌的纯化，得单菌落；3单菌落的活化；4在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落；5通过颜色筛选高产糖苷酶菌株。0006所述的步骤（1）培养基的配制将重量百分比为03的七叶苷，重量百分比为005的柠檬酸铁，重量百分比为02的NACL，重量百分比为005的MGSO47H2O，重量百分比为01的KH2PO4和重量百分比为2的琼脂加水混合后在121灭菌20MIN，得培养基；所述的步骤（2）非酿酒酵母菌的纯化将非酿酒酵母菌先在WL营养琼脂培养基上培养5天，得单菌落；所述的步骤（3）单菌落的活。

11、化根据单菌落颜色、菌落大小、突起、边缘及其形态的不同，分别挑取不同的单菌落，在添加YPD液体培养基的试管中活化，每只试管添加YPD液体培养基5ML，活化两天；所述的步骤（4）在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落在96孔板中，每孔添加250L培养基；再添加经活化后的单菌落15L，每个活化后的单菌落添加两个孔，与作为对照，同时涂布均匀，记录好每个单菌落与96孔板相对应的编号；所述的步骤（5）通过颜色筛选高产糖苷酶菌株培养3天后，选择呈现颜色深的棕黑色单菌落，得胶红酵母（保藏单位名称中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址中国、武汉、武汉大学；保藏日期2013年12月13日；保藏编号CCTCCNOM2。

12、013660；分类命名胶红酵母北29（RHODOTORULAMUCILAGINOSA北29）。）和膜璞毕赤酵母（保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址中国、武汉、武汉大学，保藏日期2013年12月13日，保藏编号CCTCCNOM2013659；分类命名膜璞毕赤酵母南13（PICHIAMEMBRANIFACIENS南13）。），胶红酵母（保藏单位名称中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址中国、武汉、武汉大学；保藏日期2013年12月13日；保藏编号CCTCCNOM2013660；分类命名胶红酵母北29（RHODOTORULAMUCILAGINOSA北29）。）和膜璞毕赤酵母（保藏单位名称。

13、中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址中国、武汉、武汉大学，保藏日期2013年12月13日，保藏编号CCTCCNOM2013659；分类命名膜璞毕赤酵母南13（PICHIAMEMBRANIFACIENS南13）。）均为高产葡萄糖苷酶酵母菌株。0007所述的非酿酒酵母菌为美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母或假丝酵母。0008与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下1、本发明利用96孔板代替传统平板进行筛选产酶菌株，能同时对大量菌株进行筛选，降低了菌株筛选的工作量，同时通过对比颜色深浅来定性判断菌株产酶高低。00092、本发明对96孔板进行创新性应用，96孔板原本是用于培养细胞的平板，。

14、在本发明中用于筛选菌株，可以用很少的筛选培养基筛选大量的菌株。00103、本发明筛选培养基的配制，可以使显色反应棕黑色）与筛选培养基透明色）说明书CN104152361A3/4页5区别明显，所以对筛选产糖苷酶菌株较为灵敏和准确。0011四、附图说明图1为本发明的显色技术流程图。0012五、具体实施方式参见图1本发明是将筛选培养基加入到96孔板中，然后添加活化的菌株，最终通过显色筛选出高产糖苷酶菌株。具体实施步骤如下所述的步骤（1）培养基的配制将重量百分比为03的七叶苷，重量百分比为005的柠檬酸铁，重量百分比为02的NACL，重量百分比为005的MGSO47H2O，重量百分比为01的KH2PO。

15、4和重量百分比为2的琼脂加水混合后在121灭菌20MIN，得培养基；所述的步骤（2）非酿酒酵母菌的纯化为了避免不纯菌株带来干扰，得到较纯的单菌落菌株，将非酿酒酵母菌先在WL营养琼脂培养基上培养5天，得单菌落；所述的非酿酒酵母菌为美极梅奇酵母、葡萄汁有孢汉逊酵母、东方伊萨酵母或假丝酵母。0013所述的步骤（3）单菌落的活化根据单菌落颜色、菌落大小、突起、边缘及其形态的不同，分别挑取不同的单菌落，在添加YPD液体培养基的试管中活化，每只试管添加YPD液体培养基5ML，活化两天；所述的步骤（4）在96孔板中添加培养基和活化后的单菌落在96孔板中，每孔添加250L培养基；再添加经活化后的单菌落15L，。

16、每个活化后的单菌落添加两个孔，与作为对照，同时涂布均匀，记录好每个单菌落与96孔板相对应的编号；所述的步骤（5）通过颜色筛选高产糖苷酶菌株培养3天后，选择呈现颜色深的棕黑色单菌落，得胶红酵母（保藏单位名称中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址中国、武汉、武汉大学；保藏日期2013年12月13日；保藏编号CCTCCNOM2013660；分类命名胶红酵母北29（RHODOTORULAMUCILAGINOSA北29）。）和膜璞毕赤酵母（保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址中国、武汉、武汉大学，保藏日期2013年12月13日，保藏编号CCTCCNOM2013659；分类命名膜璞毕赤酵母南13。

17、（PICHIAMEMBRANIFACIENS南13）。），胶红酵母（保藏单位名称中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址中国、武汉、武汉大学；保藏日期2013年12月13日；保藏编号CCTCCNOM2013660；分类命名胶红酵母北29（RHODOTORULAMUCILAGINOSA北29）。）和膜璞毕赤酵母均为高产葡萄糖苷酶酵母菌株。0014胶红酵母（保藏单位名称中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址中国、武汉、武汉大学；保藏日期2013年12月13日；保藏编号CCTCCNOM2013660；分类命名胶红酵母北29（RHODOTORULAMUCILAGINOSA北29）。）和膜璞毕赤酵母（保藏单位。

18、名称中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址中国、武汉、武汉大学，保藏日期2013年12月13日，保藏编号CCTCCNOM2013659；分类命名膜璞毕赤酵母南13（PICHIAMEMBRANIFACIENS南13）。）是高产糖苷酶菌株，可用于混合发酵或产糖苷酶增加葡萄酒香气。经定量方法分析胶红酵母产酶活性为421U/ML103；膜璞毕赤酵母4251U/ML103。0015所述的步骤（6）定量验证高产糖苷酶菌株活性A提取粗酶液将筛选的胶红酵母（保藏单位名称中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址中国、武汉、武汉大学；保藏日期2013年12月13日；保藏编号CCTCCNO说明书CN104152361A4。

19、/4页6M2013660；分类命名胶红酵母北29（RHODOTORULAMUCILAGINOSA北29）。）和膜璞毕赤酵母（保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址中国、武汉、武汉大学，保藏日期2013年12月13日，保藏编号CCTCCNOM2013659；分类命名膜璞毕赤酵母南13（PICHIAMEMBRANIFACIENS南13）。）按10的接种量接入到发酵培养基（300ML三角瓶装20ML培养基，121灭活20MIN），温度为30，摇床150RPM/MIN条件下培养72H，取出发酵液10ML于15ML离心管中，8000RPM/MIN离心10MIN除菌，收集上清液，即为葡萄糖苷酶粗。

20、酶液。0016B波长选择01、03、05MMOL/L的对硝基苯酚溶液，分别取5ML，用分光光度计扫描最大吸收峰波长，扫描条件吸光度范围为000300，波长范围为390415NM。选择最大吸收波长。0017葡萄糖苷酶酶活的测定（1）对硝基苯酚标准溶液的配制称取00209G对硝基苯酚，用蒸馏水溶解，转移到100ML的容量瓶中，定容，摇匀，配制成15MMOL/L的对硝基苯酚溶液。分别配制成005MMOL/L，01MMOL/L，02MMOL/L，03MMOL/L，04MMOL/L，05MMOL/L，06MMOL/L，07MMOL/L，08MMOL/L的对硝基苯酚溶液。0018对硝基苯酚标准曲线取10支。

21、25ML刻度管，分别加入005MMOL/L，01MMOL/L，02MMOL/L，03MMOL/L，04MMOL/L，05MMOL/L，06MMOL/L，07MMOL/L，08MMOL/L对硝基苯酚溶液04ML，再加入20ML1MMOL/L的碳酸钠溶液和10ML的蒸馏水，室温放置5MIN后摇匀。以蒸馏水作为空白对照，在上述最大吸收波长处测定吸光值A。以吸光值为纵坐标，对硝基苯酚的浓度为横坐标，制定标准曲线。0019（2）葡萄糖苷酶酶活的测定相对应PH值加入750L柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液，加入200UL的粗酶提取液，加入250L1MMOL/L的对硝基苯葡萄糖苷（PNPG）40处理60MIN，然后加入10ML的1MOL/LNA2CO3终止反应。在上述最大吸收波长处测吸光度，蒸馏水为空白对照。每个样重复两次。葡萄糖苷酶酶活力单位（IU）定义为40下1MIN内催化生成1MOL对硝基苯酚所要的酶量。说明书CN104152361A1/1页7图1说明书附图CN104152361A。

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