技术领域
本发明涉及磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）。特别地，本发明是关于MRI和19F MRI在生物活性试剂如治疗或诊断试剂（下文称为“药物”）的监测或引的导递送中的用途。更特别地，本发明涉及在这种监测或引导的递送中将用作MRI对比剂（contrast agent）的药物载体。
背景技术
主要定位于特定组织中的许多疾病是用全身给予的药物治疗的。标准癌症疗法的一个公知的实例是全身化疗，由于非期望的生物分布和毒性伴随着对患者的显著的副作用。这些药物的治疗窗口通常由以下限定，在一个方面，患病组织中最小需要的治疗浓度，以及在另一个方面，在非靶向的器官例如肝脏、脾脏中的毒性作用。通过例如从纳米载体(nanocarriers)局部释放细胞抑制剂(cytostatics)的局部治疗预示了与标准疗法相比更有效的治疗和更大的治疗窗口。如果其他的治疗选择例如手术太过危险，对于肝癌来说常常是这样，则局部化的药物递送也是重要的。对于心血管疾病(CVD)中的许多适应症，例如冠状动脉中的动脉粥样硬化，局部化的药物递送还可能成为优选的治疗选择。
磁共振成像(通常基于1H作为磁核)是在医院里通常被用于疾病的诊断的一种重要的诊断技术。MRI容许以极好的空间分辨率对软组织进行非侵入性的成像。
基于19F而非1H的磁共振成像开启了新的诊断可能性。19F核具有高磁旋比（40MHz/T）和100%的天然同位素丰度比。在人体中，含有19F的结构排他地以固体盐的形式存在于例如牙齿和骨骼中。因此，内源性19F原子的T2弛豫时间非常地短并且MR信号几乎不可检测。换句话说，具有相对高的横向弛豫时间的内源性19F基结构的缺乏保证了非常低的背景MR信号。因此，外源性的基于19F的MRI对比剂允许以与其它技术例如PET（positron emission tomography，正电子发射断层成像）相似的方式进行“热点（hot spot）”成像。
作为其诊断用途的一种有用延伸，还提出了MRI用于生物活性试剂例如治疗或诊断试剂的递送的监测。即，MRI不仅可用于治疗规划，而且可以用于在图像引导下控制局部药物递送。
鉴于上述的高特异性，希望不仅采用19F MRI作为诊断工具，而且希望将19F MRI用于MRI协助的药物或其它生物活性试剂的递送中。然而，在这里同样的高特异性也对19F MRI的最佳利用形成实际障碍。一方面，鉴于天然19F信号源的缺乏，向药物载体添加19F对比剂将意味着这种药物载体能够通过19F MRI在任何时间定位。另一方面，这将意味着19F对比剂的检测不提供关于所述生物活性试剂释放的信息，而仅仅提供关于所述对比剂存在的信息。
关于MRI监测的药物释放的一篇参考文献是Ponce等, J Natl Cancer Inst 2007；99: 53 – 63。其中，药物，多柔比星(doxorubicin)，容纳在温度敏感的脂质体(liposome)中。在体温，多柔比星保持在脂质体的内部，而在41-42℃的温度该抑制细胞生长的药物从脂质体的内部含水隔区释放。因而，药物释放可以通过施加热量来促进，因为这将引起脂质体的打开，因此药物释放不再由穿过脂质体壳的扩散(如果有的话)来决定。为了通过MRI监测药物释放，锰被添加到制剂中作为MRI对比剂。
几乎所有目前的MRI扫描都是基于本体水分子(bulk water molecules)成像，这些水分子以很高的浓度存在于整个躯体的所有组织中。如果在不同组织间的对比不足以获得临床信息，那么给予MRI对比剂(CA)，例如钆的低分子量络合物。这些顺磁性络合物减小了水分子质子的纵向(T1)和横向弛豫时间(T2)。锰也充当T1对比剂。
前述的药物载体中的锰对比剂将在它暴露于通过MRI检测的本体水分子时起作用，即，在热量施加之后它将在高于脂质（lipids）的熔化转变温度脂质体壳打开时引起瞬时的MRI对比度增强。
如所描述的，在这种药物释放过程中使用的MRI实际上被用于监测实际的释放，从而确认热敏脂质体实际地起作用。即，它仅仅提供事后的信息。
使用19F MRI以引导和/或监测生物活性试剂例如药物的局部释放将是有利的。监测药物载体自其给予后的结局（fate）也将是有利的。并且，与瞬时确定药物被释放的事实相比，更希望这种监测预先确定药物释放是否、何时以及何地应该发生。特别是对于热敏药物载体，定位所述药物载体，并施加用于促进药物在希望的地方以及在希望的时间释放的热量，将是有利的。进一步希望提供这样一种监测可能性，其不必随着释放药物的过程而消失，并且其优选地能够用于量化药物释放过程并评估治疗功效。
发明内容
为了更好地解决上述意愿，本发明在一方面介绍了适合于生物活性试剂（例如药物）的局部递送（localized delivery）的载体，所述载体包含能够由于局部刺激例如能量输入例如热量而释放被包封的（enclosed）生物活性试剂（药物）的壳，其中所述壳包封有19F MR对比剂。
在另一方面，本发明提供了19F MRI和1H CEST MRI的组合，并提供了适合生物活性试剂（例如药物）的局部递送的载体，所述载体包含能够由于局部刺激例如能量输入例如热量，而释放被包封的生物活性试剂（药物）的壳，其中所述壳包封用于1H MRI的lipoCEST 化学位移试剂和19F MRI 对比剂。
在另一方面，本发明提供了适合于生物活性试剂（例如药物）的局部递送的载体，其含有用于19F和1H MRI的对比剂。特别地，在一个进一步的方面中，所述1H MRI对比剂选自由T1和/或T2增强对比剂、CEST MR对比剂和它们的组合组成的组。
在一个进一步的方面中，本发明提供了含有热敏感的、半透性的壳的药物载体，所述壳包封空腔，其中所述空腔含有19F对比剂、顺磁性化学位移试剂和质子分析物库，并且其中所述壳容许所述质子分析物的扩散。
在再一方面，本发明提供了用于生物活性试剂（例如治疗或诊断试剂）的受控局部释放的载体，其含有热敏感的、半透性的壳，所述壳包封空腔，其中所述空腔含有19F对比剂、顺磁性化学位移试剂和质子分析物库，其中所述壳容许所述质子分析物的扩散，并且其中所述壳能够通过热量进行调节，从而促进包含在所述载体中的生物活性试剂的释放。
附图说明
将参考以下非限定性的实施例和非限定性的附图说明本发明。
图1 用于药物分子的图像引导递送的热敏脂质体。该示意图示出了当施加外部触发因素(trigger)（例如加热、超声或RF）时化学位移试剂（例如[Tm(hpdo3a)H2O)]和19F MRI对比剂（例如NH4PF6）的释放。
图2 用于19F MRI的合适对比剂的例子。
图3二棕榈酰基sn－甘油基－3－胆碱磷酸（DPPC）、氢化大豆sn－甘油基－胆碱磷酸（HSPC）和单棕榈酰基sn－甘油基－3－胆碱磷酸（MPPC）的化学式。
图4 腔中具有50mM NH4PF6的脂质体在7T的19F NMR信号（配方A）。一旦加入Triton-X100，一种非离子表活性剂，所述19F信号变得更尖锐，表明NH4PF6从脂质体内部的释放。
图5 含有NH4PF6和[Tm(hpdo3a)(H2O)]的低温敏感脂质体（配方B）在不同温度的19F NMR谱。
图6 在7T作为温度的函数具有不同浓度的被包封NH4PF6的低温敏感脂质体（LTSL）（配方A-D）的19F NMR信号的强度，示出了温度升高时在熔融相转变温度19F信号的强度增大。
图7 在298K和7.0T，作为预饱和功率水平（2.9－10.6μT）的函数，装载有50mM [Tm(hpdo3a)(H2O)]和50mM NH4PF6（配方B）的低温敏感脂质体的Z谱（左）和CEST效应（右）。所述CEST效果根据以下方程计算：(1-Ms/M0)*100%，其中Ms是脂质体内水库的选择性饱和之后水质子信号的大小，和M0是在相反频率偏移的对照照射下本体水质子信号的强度。
图8作为温度的函数用于CEST 1H和19F MRI的低温敏感脂质体对比剂（配方B）的NMR信号强度。
图9 在3T使用同时双重（simultaneous dual）19F/1H序列（sequence）得到的低温敏感脂质体MRI对比剂（配方B）的CEST图像。在297K观察到的CEST效应在311K消失，表明[Tm(hpdo3a)(H2O)]从脂质体内部的释放（左）。加热所述试剂后，所述19F MR信号变得可见（右）。
图10 低温敏感脂质体（LTSL）（配方E）、传统温度敏感脂质体（TTSL）（配方F）和非温度敏感脂质体（NTSL）（配方G）的CEST效应对温度的关系。低温敏感脂质体CEST MRI对比剂（配方E）在312K呈现CEST效应的急剧下降，而对于基于TTSL或NTSL的CEST MRI对比剂，在较高温度观察到CEST效应的较慢下降。
图11 LTSL（配方E）、TTSL（配方F）和NTSL（配方G）的19F信号对温度的关系。
具体实施方式
广义上，本发明可以关于适合生物活性试剂例如药物的局部递送的载体进行描述，该载体含有19F对比剂。当所述19F对比剂从所述载体释放时，其经历可检测性的变化。特别地，在其中所述19F试剂被包裹在所述载体中的状态下，所述对比剂的19F MR信号是在谱上是非常宽的。因此，所述19F对比剂几乎检测不到。然而，一旦释放，所述19F对比剂即变得可检测，并且得到清晰的、优选尖锐的19F磁共振信号。
特别地，本发明可以关于适合用于生物活性试剂例如药物的局部递送的载体进行描述，该载体含有19F对比剂和CEST对比剂。
用于生物活性试剂，例如药物的局部递送（以下简称为“药物递送”）的载体的适合性可以指的是各种方式，其中载体（当装载有药物时）能够被触发从而局部释放所述药物，例如通过施加受控的外力或递送足够量的能量。这例如指的是热敏药物载体，其能够通过施加局部热量而被触发，以局部地释放药物。用于局部递送的其它方法不一定涉及热敏载体，但涉及能够通过由不同于热敏性的性质控制的活化方法触发从而释放药物的载体，所述不同于热敏性的性质包括但不限于pH、气芯和/或层的存在，以及对外部施加的超声频率/波长和强度的敏感性。
19FMRI对比剂
对于上面给出的解释，将清楚的是可MR检测的19F并不天然地存在于体内，并且因此19F MRI将必须基于使用加入的19F对比剂。
用于19F MRI的对比剂优选具有大量的磁等价氟基团（magnetically equivalent fluoro－groups）（灵敏度与每分子的磁等价F原子的数量成线性比例）。为了所希望的与CEST MRI的结合，使用的19F MR对比剂优选是水溶性的，并且特别优选是带电分子从而具有尽可能高的水溶性。为了在磷脂（phospholipid）壳中应用，优选的19F对比剂并不明显结合磷脂，或者并不明显地与磷脂发生相互作用。为了它们在人或动物体内释放，所述19F对比剂优选具有低毒性和高生物相容性。
优选的19F对比剂选自图2中描绘的化合物和它们的混合物。最优选地，使用脂族烃的带电的全氟类似物。
CEST MRI
在一个优选实施方案中，本发明也涉及CEST MRI对比度增强。这种方法用于通过利用从选定的磁预饱和的质子向本体水分子的化学交换饱和转移(Chemical Exchange-dependent Saturation Transfer, CEST)来产生由MRI所测定的图像对比。
在该优选的实施方案中，尽管本发明涉及任何CEST类型对比增强对热敏药物释放的应用，但是当已经变得可用时其优选使用更先进的CEST方法。
与顺磁性化学位移试剂（Para CEST）结合的CEST是这样一种方法，其中CEST对比剂的顺磁位移的质子库(a pool of paramagnetically shifted protons)的磁化通过施加射频（RF）辐射而被选择性地饱和。通过质子交换进行的这种饱和到本体水分子的转移导致在CEST对比剂的环境中可激发的水质子数量的减少。因此，观察到本体水信号强度的降低，这在MRI影像中能用于产生（负）对比增强作用。
一种获得高CEST效力的方法是基于利用含有顺磁性位移试剂(例如，Na[Tm(dotma)(H2O)])的溶液的大量水分子，其中“H4dotma”表示α,α’,α’’,α’’’-四甲基-1,4,7,10-四乙酸和dotma代表该配体的相应的四去质子化的四阴离子形式，以提供被化学位移并因此能被RF脉冲选择性地饱和的质子库。如果该体系被包裹于载体，例如脂质体中，则磁饱和能够被转移到在载体的外部的、没有被化学位移的本体水分子(LipoCEST)。磁化转移的量以及由此对比增强的程度由水经载体壳(例如磷脂膜)扩散的速率以及载体内水的量决定。
最佳的水交换速率直接与载体内的质子库(proton pool)和载体外的本体水之间的化学位移差相关。在脂质体内部的水分子上诱导的顺磁位移由两个主要的贡献组成：由水分子与位移试剂之间的直接偶极相互作用产生的化学位移(δdip)，以及由体磁化率效应(bulk magnetic susceptibility effect)产生的顺磁位移(δbms)。总顺磁位移是这两个贡献的加合：
δ=δdip+δbms (1)
对于球形粒子，δbms是零，但是对于各向异性的粒子它能够是显著的。非球形的粒子在磁场中受到力的作用，这使得它们沿磁力线排列。在脂质体的情形中，如果它们带有与磷脂膜相结合的顺磁性分子，则该效应被进一步增强。
关于使用非球形脂质体的CEST的一篇文献是Terreno, E.等，Angew. Chem. Int. Ed. 46, 966-968 (2007)。
组合的19F和1H MR对比增强
对于本发明，19F和1H MR的合适组合可以以各种方法实现。
因此，可以通过利用CEST机理和/或19F MR产生双重或多重标记MR对比。作为选择，多重MR对比可以通过经由存在于所述载体中的含金属化合物对已成像的分析物（典型地是水质子）的纵向弛豫时间（T1），或横向弛豫时间（T2）的改变而产生。任何这些对比增强机理都可以进一步以它们的任意组合使用。
所述双重/多重标记的MRI对比（取决于所述载体的物理状态）使用常规MR设备以顺序或交替方式被监测—或使用在双重调节的谱仪系统上的序列组合（例如在1H和19F MR共振频率）同时地被监测。
在这方面，本发明还涉及同时双核（simultaneous dual nuclei）MR成像在监测和/或引导药物递送中的用途。
热敏脂质体中CEST和19F对比剂的组合提供了独立地和同时地通过CEST和19F MRI监测药物释放过程的机会。两种不同MR信号的同时监测通过相应的双重标记MR技术调解(mediated)。该方式导致了几种可能的益处。因此，装载了药物的颗粒的空间分布可以在药物释放之前通过CEST MRI进行估计；所述1H CEST和19F MR信号与被释放的药物的量成比例，这允许使用反馈回路定量控制体内被递送的药物剂量；在病变部位药物从所述载体的释放可以通过局部刺激进行诱导，例如在热敏脂质体的情况下使用例如RF或超声进行加热；所述CEST MR对比增强可以随意打开和关闭。
载体
在上文中，提到的是适合于生物活性试剂例如药物的局部递送的载体。下文中，术语“生物活性试剂”将被简称为“药物”并且将所述载体称为“药物载体”。
本发明情形中药物载体是指在其内或在其上能含有生物活性剂从而能够在对象体内被释放的任意材料。
合适的载体包括微载体(microcarriers)以及尤其是纳米载体，例如脂质体、聚合物囊泡（polymersomes）、纳米囊（nanocapsules）以及其他具有与用作CEST对比剂匹配的尺寸或性质的剂型。
所述药物载体将被引入到将接受MRI的人的体内。这将例如被注射到血流中，或通过其他方法将载体引入到体液中。
药物是用于治疗、治愈、预防或诊断的疾病或病症，或此外用于增强生理或心理健康的化学物质。本发明预期的引导的递送最有用将是用于治疗剂(即狭义上的药物，准备用于治疗或预防疾病或病症)，但是也可用于为诊断目的给予的试剂。尽管其他生物活性试剂，即非治疗或诊断性质的那些，如功能性食品成分，通常将不被用于引导的和/或监控的递送，但是如果需要的话，使用本发明也可以这样做。
本发明的最佳应用是在靶向的治疗剂(即打算用于靶向递送的药物)的情况下获得，因为这样的递送本性上将从本发明使得实现的监测受益最多。这涉及例如在肿瘤治疗中将被在位点递送的试剂，在心血管疾病例如冠状动脉中的动脉粥样硬化的治疗或预防中的试剂，或抗血栓剂(例如用于局部溶解血凝块(blood cloths))或需要通过血脑屏障的试剂如神经调节物质，可用于治疗神经病症如癫痫、阿尔茨海默氏病、帕金森病或中风。来自靶向药物递送的引导和监测的益处同样可应用于靶向的诊断试剂。与靶向的治疗剂相似，在这里癌症同样是其中位点特异性递送能够非常重要的领域。
本发明中适用的生物活性试剂包括生物学上的活性剂，包括治疗药物、内源性分子，以及药理学活性剂，包括抗体；营养分子；美容剂；诊断试剂；以及用于成像的附加对比剂。如本文中所用的那样，活性剂包括活性剂的药理学可接受的盐。
本发明的药物载体可以包含亲水性或疏水性的生物活性试剂。亲水性生物活性试剂可以包裹在所述载体的含水隔区中，而疏水性的生物活性试剂可以加入到载体的疏水性区域中，例如在脂质体的脂质双层（lipid bilayer）中。核酸、碳水化物和一般地蛋白质和肽是水溶性的或亲水性的。例如，还设想了是小分子、脂质、脂多糖、多核苷酸和反义核苷酸(基因治疗试剂)的生物活性试剂。因而可以加入的这种生物学活性试剂包括非肽、非蛋白质药物。在本发明的范围内可以加入聚合性质的药物，但是也可以加入具有低于1500 g/mol、或甚至低于500 g/mol的相对小的分子量的药物。
因此，在本发明的情境中设想用作生物活性试剂的化合物包括具有治疗或预防效果的任何化合物。它可以是影响或参与组织生长、细胞生长、细胞分化的化合物，能够引起生物学作用例如免疫反应的化合物，或可以在一种或更多种生物过程中起到任何其他作用的化合物。非限定性的例子列表包括抗微生物剂（包括抗菌、抗病毒剂和抗真菌剂）、抗病毒剂、抗肿瘤剂、凝血酶抑制剂、抗血栓剂、血栓溶解剂、纤维蛋白溶解剂、血管痉挛抑制剂、钙通道阻断剂、血管扩张剂、抗高血压剂、抗微生物剂、抗生素、表面糖蛋白受体抑制剂、抗血小板剂、抗有丝分裂物质、微管抑制剂、抗分泌剂、肌动蛋白抑制剂、改型抑制剂(remodeling inhibitors)、抗代谢物、抗增殖物质（包括抗血管生成剂）、抗癌化疗剂、抗炎类固醇类或非类固醇抗炎剂、免疫抑制剂、生长激素拮抗剂、生长因子、多巴胺激动剂、放疗剂、细胞外基质组分（extracellular matrix components）、ACE抑制剂、自由基清除剂、螯合剂、抗氧化剂、抗聚合酶和光动力治疗剂。
相对小的肽可以通过氨基酸的数目来命名(例如，二肽、三肽、四肽)。具有相对小数量的酰胺键的肽还可以称为寡肽(最多50个氨基酸)，而具有相对高数量(超过50个氨基酸)的肽可以称为多肽或蛋白质。除了是氨基酸残基的聚合物之外，某些蛋白质可进一步通过所谓的四级结构来表征，一种不一定通过酰胺键化学连接、而是通过本领域技术人员一般已知的力例如静电力和范德华力结合的许多多肽的簇合物(conglomerate)。在此使用的术语肽、蛋白质或其混合将包括所有以上提及的可能性。
通常，在其生物学活性的基础上选择蛋白质和/或肽。取决于所选的聚合物的类型，可通过本发明的方法获得的产品高度适合于蛋白质和肽的受控释放。在一个特定的实施方式中，所述蛋白质或肽是生长因子。
可以有利地包含在加载的聚合物中的肽或蛋白质或包含肽或蛋白质的实体(entities)的其他实例包括但不限于免疫原性(immunogenic)肽或免疫原性蛋白质，其包括但不限于以下：
毒素例如白喉毒素和破伤风毒素。
病毒表面抗原或病毒部分例如腺病毒、Epstein-Barr病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、疱疹病毒、 HIV-I、HIV-2、HTLV-III、流感病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、乳头瘤病毒、副粘病毒、骨髓灰质炎病毒、狂犬病、病毒、风疹病毒、牛痘（天花）病毒和黄热病病毒。
细菌表面抗原或细菌部分例如百日咳杆菌、幽门螺杆菌、破伤风梭菌、白喉杆菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、克雷伯菌属、嗜肺军团菌、牛分支杆菌、麻风杆菌、结核分枝杆菌、淋球菌、脑膜炎奈瑟球菌、变形杆菌属、铜绿假单胞菌、沙门氏菌属、志贺菌属、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、霍乱弧菌和鼠疫菌。
引起疾病的寄生虫的表面抗原或寄生虫部分例如间日疟原虫（疟疾）、恶性疟原虫（疟疾）、卵形疟原虫（疟疾）、三日疟原虫（疟疾）、热带利什曼原虫（利什曼病）、杜氏利什曼原虫（利什曼病）、Leishmania branziliensis（利什曼病）、Trypanosoma rhodescense（昏睡病）、冈比亚锥虫（昏睡病）、克氏锥虫（查格斯病）、曼氏血吸虫（血吸虫病）、Schistosomoma haematobium（血吸虫病）、日本血吸虫（血吸虫病）、旋毛虫（旋毛虫病）、Stronglyloides duodenale（钩虫）、十二指肠钩虫（钩虫）、美洲钩虫（钩虫）、Wucheria bancrofti（丝虫病）、马来丝虫（丝虫病）、罗阿丝虫（丝虫病）、Dipetalonema perstaris（丝虫病）、Dracuncula medinensis（丝虫病）和盘尾丝虫（丝虫病）。
免疫球蛋白例如IgG、IgA、IgM、抗狂犬血清免疫球蛋白和抗牛痘免疫球蛋白。
抗毒素例如肉毒抗毒素、白喉抗毒素、气性坏疽抗毒素、破伤风抗毒素。
引起抵抗手足口病的免疫响应的抗原。
激素和生长因子例如促滤泡激素、催乳素、血管生成素、表皮生长因子、降血钙素、促红细胞生成素、促甲状腺释放激素、胰岛素、生长激素、胰岛素样生长因子1和2、骨骼生长因子、人绒毛膜促性腺激素、黄体化激素、神经生长因子、促肾上腺皮质激素（ACTH）、黄体化激素释放激素（LHRH）、甲状旁腺素（PTH）、促甲状腺激素释放激素（TRH）、抗利尿激素、胆囊收缩素和促肾上腺皮质素释放激素；细胞因子，例如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、和肿瘤坏死因子：纤维蛋白溶酶，例如尿激酶、肾胞浆素原活化体；和凝血因子，例如蛋白质C、因子VIII、因子IX、因子VII和抗凝血酶III。
其它蛋白质或肽的例子是蛋白素、心钠素、肾素、过氧化物歧化酶、α1-抗胰蛋白酶、肺表面活性物质相关蛋白、杆菌肽素、苯丁抑制素、环孢霉素、δ促睡眠肽（DSIP）、内啡肽、胰高血糖素、短杆菌肽、黑素细胞抑制因子、神经降压素、催产素、生长抑素、壬肽抗压素、血清胸腺因子、胸腺素、DDAVP、皮啡肽、甲啡肽、肽聚糖、满足素、胸腺五肽、纤维蛋白降解产物、des-脑啡肽-α-内啡肽、促性腺激素释放激素、亮丙瑞林、α-MSH和美克法胺。
抗肿瘤药物例如六甲蜜胺、氟尿嘧啶、安吖啶、羟基脲、天冬酰胺酶、异环磷酰胺、博莱霉素、环己亚硝脲、白消胺、美法仑、苯丁酸氮芥、巯嘌呤、氮芥、甲氨喋呤、顺铂、丝裂霉素、环磷酰胺、甲基苄肼、阿糖胞苷、替尼泊甙、氮烯咪胺、塞替派、放线菌素、硫鸟嘌呤、柔红霉素、苏消安、多柔比星、噻替派、雌莫司汀、长春碱、乙环氧啶、长春新碱、足叶乙甙、长春地辛和紫杉醇。
抗微生物剂，包含：
抗生素例如氨苄西林、乙氧萘青霉素、羟氨苄青霉素、苯甲异 唑青霉素、阿洛西林、青霉素G、羧苄青霉素、青霉素V、双氯青霉素、苯氧乙基青霉素、氟氯青霉素、氧哌嗪青霉素、甲亚胺青霉素、磺苄青霉素、二甲氧苯青霉素、替卡西林、美洛西林，头孢菌素：头孢克洛、头孢噻吩、头孢羟氨苄、头孢吡硫、头孢孟多、头孢拉定、头孢三嗪、头孢磺啶、头孢唑啉、头孢他啶、头孢雷特、头孢曲松钠、头孢西丁、头孢呋辛、头孢乙腈、拉他头孢钠和头孢氨苄。氨基糖苷类例如阿米卡星、新霉素、地贝卡星、卡那霉素、正大霉素、奈替米星、托普霉素。大环内酯类例如两性霉素B、新生霉素、杆菌肽、制霉菌素、克林霉素、多粘菌素类、粘杆菌素、螺旋霉素、红霉素、大观霉素、林可霉素、万古霉素。四环素类例如金霉素、土霉素、地美环素、吡甲四环素、强力霉素、四环素和米诺环素。其它抗生素例如氯霉素、利福霉素、利福平和甲砜霉素。
化疗剂例如磺胺类药物磺胺嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺二甲氧嗪、磺胺甲唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲异唑、磺胺苯吡唑、磺胺林、磺胺索嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺异唑和具有磺胺甲唑或磺胺甲氧噻二唑的三甲氧苄二氨嘧啶。
尿道抗菌药物例如甲胺、喹诺酮类（诺氟沙星、西诺沙星）、萘啶酸、硝基化合物（呋喃妥英、硝呋妥醇）和喹酸。
用于厌氧性感染的药物例如甲硝唑。
用于肺结核的药物例如氨基水杨酸、异烟肼、环丝氨酸、利福平、乙胺丁醇、硫卡利特、乙硫异烟胺和紫霉素。
用于麻风病的药物例如缩氨硫脲、利福平、氯苯酚嗪、亚磺氨苯砜钠和二氨基二苯砜（DDS，氨苯砜）。
抗真菌药物例如两性霉素B、酮康唑、克霉唑、咪康唑、益康唑、纳他霉素、氟胞嘧啶、利霉菌素和灰黄霉素。
抗病毒药物例如阿普洛韦、疱疹净、金刚烷胺、甲吲噻腙、阿糖胞苷、阿糖腺苷和更昔洛韦。
阿米巴病的化学疗法例如氯喹、双碘喹啉、氯碘羟喹、甲硝唑、去氢依米丁、巴龙霉素、二氯尼特、康酸酯替硝唑和依米丁。
抗疟疾药物例如氯喹、乙胺嘧啶、羟氯喹、奎宁、甲氟喹、磺胺多辛/乙胺嘧啶、戊烷脒、苏拉明钠、伯胺喹、甲氧苄啶和氯胍。
抗蠕虫病药物例如酒石酸锑钾、尼立达唑、二巯基丁二酸锑钠、羟氨喹、酚乙铵、哌嗪、双氯酚、吡喹酮、乙胺嗪、噻嘧啶、羟甲硫蒽酮、扑蛲灵、左旋咪唑、锑波酚、甲苯咪唑、四咪唑、敌百虫、硫苯哒唑和氯硝柳胺。
抗炎剂例如乙酰水杨酸、甲芬那酸、阿氯酚酸、萘普生、azopropanone、尼氟灭酸、苄达明、羟基保泰松、双氯芬酸、吡罗昔康、非诺洛芬、吡咯洛、氯比洛芬、水杨酸钠、布洛芬舒林酸、吲哚美辛、噻洛芬酸、酮洛芬和托美汀。
抗痛风药物例如秋水仙碱和别嘌呤醇。
中枢作用（阿片样）镇痛剂例如阿芬太尼、美沙酮、苯腈米特、吗啡、丁丙诺菲、尼可吗啡、布托菲诺、镇痛新、可待因、哌替啶、右旋吗酰胺、哌腈米特、右旋丙氧吩、舒芬太尼、和芬太尼。
局部麻醉剂例如阿替卡因、马比佛卡因、布比卡因、丙胺卡因、依替卡因、普鲁卡因、利多卡因和丁卡因。
用于帕金森氏病的药物如金刚胺、苯海拉明、阿朴吗啡、爱普杷嗪、甲磺酸苄托品、麦角腈、比哌立登、左旋多巴、溴隐亭、利舒脲、卡比多巴、美噻吨、氯苯氧胺、邻甲苯海明、赛克立明、普环啶、右苄替米特和苯海索。
中枢作用肌肉松弛剂例如巴氯芬、异丙基甲丁双脲、氯美乍酮、氯唑沙宗、环苯扎林、丹曲洛林、苯甲二氮、非巴氨酯、美芬恶酮、甲苯丙醇、美他沙酮、美索巴莫和甲苯哌丙酮。
皮质类固醇，包含：
矿物皮质类固醇例如皮质醇、去氧皮质酮和氟氢可的松。
糖皮质类固醇例如倍氯米松、倍他米松、可的松、地塞米松、氟轻松、氟轻松醋酸酯、氟可龙、氟米龙、氟泼尼龙、氟氢缩松、哈西缩松、肾上腺皮质素、甲羟松、甲强龙、帕拉米松、波尼松龙、强的松和去炎松（丙酮化合物）。
雄激素，包含：
治疗中使用的雄性类固醇（androgenic steroids），例如danazole，氟甲睾酮，美睾酮，甲睾酮，睾酮，和它们的盐。
治疗中使用的合成代谢类固醇例如卡鲁睾酮、诺龙和它的盐、屈他雄酮、氧雄龙、乙雌烯醇、羟甲烯龙、美雄醇、康力龙、羟甲雄二烯酮和睾内酯。
抗雄激素例如醋酸环丙氯地孕酮。
治疗中使用的含有雌激素类固醇的雌激素例如己烯雌酚、雌二醇、雌素三醇、乙炔雌二醇、炔雌醇甲醚和炔雌醚。
抗雌激素例如三对甲氧苯氯乙烯、克罗米酚、乙胺氧三苯醇、萘福昔定和三苯氧胺。
孕激素类例如烯丙雌烯醇、脱氧炔诺酮、二甲炔酮、去氢孕酮、炔雌烯醇、脱水羟基孕酮、双醋炔诺醇、炔诺醇、羟孕酮、左炔诺孕酮、利奈孕醇、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、炔诺酮、诺塞甾酮、异炔诺酮、甲基炔诺酮和孕酮。
甲状腺药物，包含：
治疗中使用的甲状腺药物例如左旋甲状腺素和碘塞罗宁。
治疗中使用的抗甲状腺药物例如甲亢平、甲巯基咪唑、甲基硫氧嘧啶和丙基硫尿嘧啶。
除了水溶性的生物活性试剂之外，还可以加入其他水溶性的化合物，例如，抗氧化剂、离子、螯合剂、染料、成像化合物。
优选的治疗试剂处在癌症(例如，抗肿瘤)和心血管疾病领域。
现有技术中已知制备适用于纳米粒子或脂质体制剂的亲脂药物衍生物的方法(参见例如US 5,534,499，描述治疗试剂共价连接到磷脂的脂肪酸链)。本发明中的药物还可以是前药。
药物可以存在于载体的内部隔区、外部隔区或这两种隔区中，例如，存在于脂质体的空腔中和/或壳中。药物的分布与药物载体中含有的任何其他试剂，例如顺磁性化学位移试剂或顺磁性试剂的分布无关。可以使用药物的组合，并且任何这些药物都可以存在于药物载体的内部隔区、外部隔区或这两种隔区中，例如存在于脂质体的空腔中和/或壳中。
热敏载体
本发明优选提供热敏感的载体。这意味着所述载体的物理或化学状态取决于其温度。
任意的热敏载体，其可包装感兴趣的分子并且其在体温(即37℃)是完好的但是在可被对象（subject）承受的任意其他非体温被破坏，都可以使用。本发明的载体包括但不限于热敏微粒子和纳米粒子、热敏聚合物囊泡、热敏脂质体、热敏纳米泡囊（nanovesicles）、以及热敏纳米球。
热敏纳米泡囊通常具有最高达100 nm的直径。在本发明的情形中，大于100 nm、通常最高达5000 nm的泡囊，被认为是微泡囊。术语泡囊描述了任何类型的微泡囊或纳米泡囊。泡囊，例如脂质体泡囊（liposomal vesicles），典型地包括可包含任意感兴趣的物质的空腔。本发明中，如上所述，这是优选的。
热敏纳米球包括但不限于不小于5纳米的球。纳米球典型地不包含空腔，即在本发明的该具体实施方式中，CEST效应应单纯由包含在纳米球中的顺磁性化学位移试剂本身的化学位移的质子来实现。
热敏聚合物囊泡包括但不限于任意的聚合物泡囊，包括微泡囊和纳米泡囊。
热敏脂质体包括但不限于任意的脂质体，包括具有延长的半衰期(half-life)的那些，例如聚乙二醇化的(PEGylated)脂质体。
为了利用最佳的CEST对比增强，优选采用具有包封空腔的半透性壳的热敏载体，例如脂质体（liposomes）。其优点在于CEST对比增强可以基于包含在所述空腔内的顺磁性化学位移试剂与同样存在于所述空腔中的质子库或其它MRI分析物之间的相互作用实施。
在本领域中，术语“半透性的”是公知的。通常，其是指膜（例如壳）的性质是选择性可透过的，有时也表示可部分或差异化透过的。在这个意义上，壳表示基本上封闭的结构，在其不是完全打开的壁的意义上，并且优选地是大部分封闭的壁，（在这种情况下壳包封空腔），其允许某些分子或离子通过扩散穿过所述壳。
在本说明书中，壳的半透性一般是指它容许MR分析物通过扩散穿过它的能力。因此，如果分析物(例如，水，或其他包含质子的小分子)与壳(例如，脂质双层)的组合是使得所述分析物能够通过扩散穿过所述壳，那么就认为所述壳是半透性的。
关于具有半透性壳的热敏载体的文献是例如US 6,726,925、US 2006/0057192、US 2007/0077230A1和JP 2006 – 306794。基于本发明的描述，对于这些公开的参考将使本领域技术人员能够使用热敏脂质体实施CEST对比增强。
脂质体通常是包含包封空腔或内腔的双层膜的球形泡囊。所述双层可以由至少一种磷脂形成，并且可以含有或可以不含有胆固醇。脂质体可以由具有混合的脂质链的源自天然的磷脂（如卵磷脂酰乙醇胺（egg phosphatidylethanolamine））组成，或由纯表面活性剂组分如二油酰基磷酰基乙醇胺（dioleoylphosphatidylethanolamine，DEPO）组成。本发明的说明书中使用的术语脂质体包括通常称为胶束的脂质球。
半透性壳的一个典型例子也在含有磷脂双层的半透膜中被找到。磷脂双层对小的不带电溶质最具可透性。脂质体可以在磷脂双层的基础上制备。
用于本发明的热敏脂质体在约37℃即人体温度理想地保持它们的结构，但是在较高的温度，优选仅稍微升高高于人体温度，并且优选还高于热病身体温度(pyrexic body temperature)，被破坏。一般地，约42℃是用于热引导的药物递送的高度有用的温度。
可以使用所需要的热量来提高热敏药物载体的温度从而来促进热敏载体的破坏。可以以任何生理上可接受的方式施加热量，优选通过利用能够诱导高度局部化的高热(hyperthermia)的聚焦的能量源。所述能量可通过例如微波、超声、磁感应、红外线或光能来提供。
热敏脂质体是本领域中已知的。本发明的脂质体可以通过本领域中公知的多种技术中的任意一种来制备。参见例如U.S专利No. 4,235,871；公开的PCT申请WO 96/14057；New RRC, Liposomes: A practical approach，IRL Press，牛津(1990)，第33-104页；Lasic, D.D., Liposomes from physics to applications，Elsevier Science Publishers, 阿姆斯特丹, 1993；Liposomes，Marcel Dekker, Inc，纽约(1983)。
在本发明的脂质体内药物或其他生物活性试剂的夹带也可以使用本领域中的任何常规方法来实施。在本发明的脂质体组合物的制备中，只要它们基本不干扰本发明的目的，则可以使用稳定剂如抗氧化剂以及其他添加剂。
基于包围空腔的半透性壳的脂质体和其他潜在的载体一般将是球形的。对于在本发明中使用，优选的是使这样的球形载体变为非球形的。例如，对于脂质体来说，这通过使所述脂质体经历相对于高渗缓冲溶液，即与处在脂质体的内部的溶液相比具有更高渗透压的缓冲溶液，的渗析过程来进行。这种渗析引起水从脂质体的内部向本体溶液(bulk solution)的净扩散。这降低了脂质体的总内体积。因为脂质体的表面积保持恒定，所以体积减少迫使脂质体变形并呈现非球形形状，例如，碟形、雪茄形，或任何其他非球形形状。
顺磁性化学位移试剂
在本发明中，顺磁性位移试剂可以以任何方式包含在载体中或载体上。优选的是通过在载体的空腔中包含位移试剂和质子库两者，使所述位移试剂与质子库发生充分的相互作用。
所述一种或多种顺磁性化学位移试剂基本上可以是任何顺磁性试剂，其适合于使含有它的溶液或分散体的相对大数量的水分子，相对于周围的本体水分子的质子，成为关于它们的MR共振频率发生化学位移的质子库。如前文关于lipoCEST进行的解释，优选的热敏药物载体（其中包含所述顺磁性化学位移试剂和内部质子库）可以通过RF脉冲进行饱和。由于优选的药物载体包含在根本上允许质子与它们的直接环境进行交换的壳，例如脂质体的脂质双层膜，所以通过所述RF脉冲导致的饱和将被转移到装载的、RF饱和的热敏药物载体的周围环境。因而，在进行磁共振成像时，热敏药物载体的直接环境与其他本体水分子相比将显示降低的信号强度，并由于降低的信号强度因而容许检测对比剂的直接环境。顺磁性化学位移试剂将包含顺磁性化合物，即具有顺磁性性质的任何化合物。优选地，所述顺磁性化合物包含顺磁性金属，其中术语金属指金属纳米粒子或微粒子，或金属离子，明确地包括被螯合配体络合的金属离子。顺磁性金属是本领域技术人员已知的，不需要在此进行说明。例如，前和后过渡金属，明确地包括铬、锰、铁，以及镧系元素，例如，钆、铕、镝、钬、铒、铥、和镱。
所述顺磁性化学位移试剂将包含螯合结构，其能够强烈地结合到顺磁性金属并容许所述金属与水或与其他适合的质子源发生相互作用。对于适合的螯合结构，参考 P. Caravan等., Chem. Rev., 99, 2293-2352(1999)。优选地，水至少短暂地与顺磁性试剂的金属配位。对于化学位移机理，参考 J. A. Peeters等., Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectr., 28, 283-350(1999)。在一个实施方式中，螯合结构本身还包含可交换的质子，例如，羟基、胺或酰胺质子。
合适地，所述顺磁性化学位移试剂包含与螯合结构配位的镧系元素离子，例如，衍生自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(H4dota)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-α,α’,α’’,α’’’-四甲基-1,4,7,10-四乙酸(H4dotma)和容许顺磁性试剂中轴向配位的水分子的相关配体的大环镧系元素(III)螯合物。在这点上，参考 Aime等., Angew. Chem. Int. Ed., 44, 5513-5515(2005)。
优选地，所述顺磁性化学位移试剂是水溶性的。适合的化学位移试剂是本领域的技术人员已知的。CEST对比剂不需要任何特定的化学位移试剂，只要所述位移试剂和质子库具有足够的相互作用来产生发生化学位移的质子库。
优选地，所述顺磁性位移试剂是包含金属离子和基于多齿螯合配体的配体的金属络合物。更优选地，所述化学位移试剂与质子库的相互作用是以配位的形式提供。因而，优选的是，所述金属络合物的所述金属的至少一个配位位点保持空缺，以用于与至少一个水分子的配位。
适合的水溶性化学位移试剂的实例是[Ln(hpdo3a)(H2O)](1)、[Ln(dota)(H2O)]-(2)、[Ln(dotma)(H2O)]-(3)、[Ln(dotam)(H2O)]3+(4)和[Ln(dtpa)(H2O)]2-(5)，包括其衍生物和相关的化合物，Ln是镧系元素离子。
优选地，所述顺磁性化学位移试剂是镧系元素络合物，例如以下的式1-5：
其中所述镧系元素是Eu3+、Dy3+、Ho3+、Er3+、Tm3+、Yb3+，优选是Tm3+或Dy3+。
所述顺磁性化学位移试剂一般以1 mM到2000 mM、优选1 mM到1000 mM、更优选50 mM到200 mM的量包含在试剂中。所述顺磁性化学位移试剂可以是低聚的或聚合的、寡核或多核化合物，每分子含有许多顺磁金属离子。
其它对比增强剂
本发明的热敏药物载体可以含有T1或T2降低剂。在这方面，参考Aime等., JACS, 129, 2430-2431 (2007)。通过这种方式，可以实现19F MRI与 T1、T2结合，和优选地还与在1H MRI中的CEST对比结合的一体化概念。
在热敏药物载体的环境中与饱和转移质子的化学位移差可以通过给所述热敏药物载体的膜提供另外的顺磁性试剂来进一步提高，所述另外的顺磁性试剂不必是化学位移试剂。因而，非球形载体在磁场中的取向受到影响，前述体磁化率效应（bulk susceptibility effect）被增强。所述另外的顺磁性试剂优选是两亲性化合物，其包含镧系元素络合物(在两亲性化合物的更为极性的一侧)，并具有非极性尾部，其基于疏水分子相互作用具有优先地结合到热敏药物载体表面的脂质双层中并与之对齐的倾向。
这些两亲性顺磁络合物可以例如是：
所述加载有顺磁性化学位移试剂的热敏药物载体可以有利地与其外表面（例述脂质体壳）中或在其外表面处的顺磁性试剂结合。这种试剂通常包含两亲性化合物，其带有顺磁基团，优选镧系元素络合物(在两亲性化合物的更为极性的一侧)，并具有非极性尾部，其基于疏水分子相互作用具有优先地结合到优选热敏脂质体表面处的脂质双层中并与之对齐的倾向。
在可选的与膜相关的顺磁性试剂中的镧系元素离子可以与对比剂的空腔内的镧系元素相同或不同。
如根据本发明提供的，所述顺磁性化学位移试剂可以被包裹在热敏药物载体中。这样，产生了水质子库，其与围绕所述载体的本体水相比具有不同的化学位移。这些发生化学位移的水质子的磁共振可以用具有足够窄的带宽的RF脉冲来饱和。由于在对比剂内部的水分子与围绕所述对比剂的本体水分子快速地交换，所以这种饱和被转移到所述本体水。
因此，当在实践中使用时，在基于热敏药物载体的CEST对比剂的位置处，周围的水(在优选的体内使用中即体液)将在CEST增强的MR图像中作为低强度(hypointense)区域可见。对于CEST增强的MRI，我们是指常规的MRI，其中，在激发之前，可交换的水共振已经被选择性地饱和。用于饱和的RF脉冲一般具有几赫兹到几百赫兹的带宽。所述脉冲的合适频率通常是从模型或临床前的CEST MRI研究先验(a priori)已知的，但也可以在实际的临床MRI检查期间优化。
因此，本发明的优选的载体（其不仅含有19F对比剂，而且通过顺磁性化学位移试剂和质子库的存在提供CEST对比增强）一旦释放所述19F对比剂不仅可以通过19F MRI检测，还可以在所述载体打开之前在任何时间点通过1H MRI检测。如果他们另外包含T1或T2对比剂，则还可检测载体打开时的药物释放步骤(只要壳是闭合的并且饱和质子的交换可以通过扩散发生，那么CEST对比度增强就将发挥作用，T1或T2对比度增强将在使这些对比剂能与本体水(即，体液，当所述试剂通过所述壳的打开被释放时)发生相互作用时显示其作用。
根据本发明的载体可以以多种方式使用。它们可以用于在任何含水环境中产生期望水平的MRI对比。它的主要用途，其也是使用热敏药物载体的益处体现地最好的情况，是在体内应用时产生局部MRI对比。这可以是通过以下方式进行：引入所述对比剂，例如，通过注射到生物优选人类的血液或其它体液中，并进行所述生物的完整或部分身体的CEST对比度增强的MRI扫描。所产生的本体水分子的CEST对比度增强，容许位点例如肿瘤(在此处规则的体液存在被扰动)的可视化。并且，本发明的对比剂在它们的脂质壳中可以提供有疾病特异性分子探针，例如，通过具有拥有适合于插入载体的表面中的疏水性尾部的化合物(例如，对于磷脂表面来说)，其中所述化合物的另一端含有希望的配体。所述热敏药物载体被设计为当在生物靶位置被激活时，释放它们的治疗内容物，其对应于载体壳的解体。对于大多数治疗纳米载体，其例如通过LIPOCEST型MR对比剂标记，所述CEST MRI信号随着释放过程而消失。因此，所含的治疗物质的结局不能再通过MR观察或量化。这正是19F信号对于医学应用的价值特别突出之处。随着药物释放而出现，所述19F信号可以用于量化所述药物释放过程并评价治疗功效。取决于分子结构，所述19F标记物可以继之以药物外渗（drug extravasation）或组织摄取，而所述CEST纳米载体标记物被限制到导管（conducting vessels）。
这容许所述对比剂优先地位于期望的或怀疑的身体位点，其然后通过MRI可以变为可见的。这增加了本发明的药物载体用于局部化递送的适用性。
本发明的CEST对比剂优选地在载体内的质子库的基础上起作用，其与所述载体外的流体交换。这种交换可以通过水-质子传递进行，但也可以通过来自其他小到足以穿过载体的壳（即优选的热敏脂质体的脂质双层）的分子的质子传递来进行。
将要理解的是，本发明不限于上文描述的实施方式和化学式。还将要理解的是，在权利要求中，词语“包含(包括，含有)”不排除其他的要素或步骤。当涉及单数名词使用不定冠词或定冠词例如“a”、或“an”、“the”时，这包括该名词的复数，除非特别有其它声明。
实施例1
通过脂质薄膜水合技术并结合后继的挤出形成平均直径为100nm的脂质体。将MPPC和DPPC溶解在CHCl3/EtOH (4:1 v/v)的溶液中。在减压下温和除去所述溶剂，获得薄的脂质薄膜（lipidic film）。所述脂质薄膜在50mM NH4PF6和50mM [Tm(hpdo3a)(H2O)] 在20mM HEPES缓冲液中的溶液中在7.4的pH水合。随后，将分散体经孔径为200nm和100nm的聚碳酸酯膜滤器挤出几次。所获得的脂质体在4℃渗析过夜，以除去所述脂质薄膜水合后没有被捕获的NH4PF6和[Tm(hpdo3a)(H2O)]。针对含有0.3M NaCl的具有20mM HEPES缓冲剂的缓冲液实施渗析，以获得非球形脂质体。
关于脂质体A-D的组成参考表1。
表1. 低温敏感脂质体（LTSL）
实施例2
以相似的方式，制备具有不同温度敏感性的脂质体，即低（LTSL）、传统（TTSL）和非（NTSL）温度敏感性。
这些脂质体的组成在表2中示出。
表2
各种配方对CEST MRI以及对19F MRI的影响根据前文对图4-11的描述进行测量。