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1、(10)授权公告号 CN 102151296 B (45)授权公告日 2012.05.09 CN 102151296 B *CN102151296B* (21)申请号 201010111656.2 (22)申请日 2010.02.11 A61K 36/484(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61K 125/00(2006.01) (73)专利权人 兰州大学 地址 730000 甘肃省兰州市城关区天水南路 222 号 (72)发明人 倪京满 王锐 马子娇 (74)专利代理机构 兰州中科华西专利代理有限 公司 62002 代理人 马正良 CN 101347495 A,20。
2、09.01.21, 全文 . 许有瑞等 . 甘草中 _ 葡萄糖苷酶抑制剂的 初步研究 .中药处 .2005, 第 28 卷 ( 第 10 期 ),890-891. 许有瑞等 . 甘草中 _ 葡萄糖苷酶抑制剂的 筛选 .中国药学 （英文） .2006, 第 15 卷 ( 第 1 期 ),24-27. (54) 发明名称 一种从甘草废渣中提取降血糖活性成分的方 法 (57) 摘要 本发明涉及一种从甘草废渣中提取降血糖活 性成分的方法。其步骤是 ： 取干燥甘草渣， 加入 浓度为 65乙醇， 料液比 1 12， ， 在超声温度 75， 功率 40KHz 的条件下提取两次， 每次提取 1.5h， ， 过。
3、滤， 合并滤液得浓缩液， 回收溶剂， 得浸 膏， 将浓缩液浸膏通过 30 60 目过聚酰胺柱层 析， 依次用水、 95乙醇梯度洗脱， 以盐酸 - 镁粉 反应检测合并得总黄酮， 将产物合并得 B， 再将 B 经减压浓缩和真空冷冻干燥得产物。本发明从甘 草废渣中提取分离降糖有效成分， 制备工艺简单， 适宜工业化生产。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李聪 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 CN 102151296 B1/1 页 2 1. 一种从甘草废渣中提取降血糖活性成分的方法， 其步骤是 ： 取干燥甘草渣，。
4、 加入浓度为 65 80乙醇， 料液比 1 12 1 14， 在超声温度 6575， 功率40KHz的条件下提取两次， 每次提取1.5h， 过滤， 合并滤液得浓缩液， 回收 溶剂， 得浸膏， 将浓缩液浸膏通过 30 60 目聚酰胺柱层析， 依次用水、 95乙醇梯度洗脱， 以盐酸 - 镁粉反应检测合并得总黄酮， 将产物合并得 B4， 再将 B4经减压浓缩和真空冷冻干 燥得产物。 权 利 要 求 书 CN 102151296 B1/6 页 3 一种从甘草废渣中提取降血糖活性成分的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种从甘草的废渣中提取降糖活性成分的方法。 背景技术 0002 中 药 甘 草 为 。
5、豆 科 植 物 甘 草 (Glycyrrhiza uralensis Fisch.)， 胀 果 甘 草 (Glycyrrhiza inflata Bat.) 或光果甘草 (Glycyrrhiza glabra L.) 的干燥根及根茎。 我国是世界上认识和研究甘草最早的国家， 东汉的 神农本草经 中即有记载。其味甘， 性 平， 入心、 肺、 脾、 胃经。 用于治疗脾胃虚弱、 中气不足、 咳嗽气喘、 痈疽疮毒、 腹中挛及作痛等 病症和缓和药物烈性、 解药毒。科学研究实验表明 ： 甘草中富含甘草酸、 甘草次酸、 黄酮、 皂 苷、 生物碱和氨基酸等成分， 具有抗病毒、 抗菌、 抗溃疡、 抗氧化、 抗肿。
6、瘤、 解毒、 保肝等功效。 工业化生产只把甘草中的甘草酸作为主要有效成分进行提取， 而提取后的甘草废渣则被遗 弃， 造成了环境污染和资源浪费。 为了和生产甘草酸的企业现有生产技术更好的衔接， 更加 有效的综合利用有限的甘草药材资源， 本项目以提取完甘草酸的药材废渣为研究对象， 进 行了提取降糖有效成分的工艺路线研究。 发明内容 0003 甘草废渣中含有大量有医用价值和经济价值的黄酮类化合物。 甘草黄酮在药理学 方面的功效日趋显现， 已证明有较高的 - 葡萄糖苷酶抑制活性， 能发挥很好的降糖作用。 本发明的目的旨在提供一种从提取过甘草酸的药渣中提取分离降糖活性成分的方法。 为甘 草废渣资源及甘草。
7、黄酮的开发利用提供一定的理论依据， 有利于更加有效的综合利用有限 的甘草药材资源， 保护生态环境， 具有较好的社会效益和经济效益。 0004 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现 ： 0005 一种从甘草废渣中提取分离降糖有效成分的方法， 其步骤是 ： 0006 取干燥甘草渣， 加入加入浓度为6580乙醇， 料液比112114， ， 在超 声温度 65 75， 功率 40KHz 的条件下提取两次， 每次提取 1.5h， 过滤， 合并滤液得浓缩 液， 回收溶剂， 得浸膏， 将浓缩液浸膏通过 30 60 目聚酰胺柱层析， 依次用水、 95乙醇梯 度洗脱， 以盐酸 - 镁粉反应检测合并得总黄酮， 。
8、将产物合并得 B4， 再将 B4经减压浓缩和真空 冷冻干燥得产物。 0007 采用超声辅助乙醇热回流法产率达 3.90， 含量达 24.56， - 葡萄糖苷酶抑制 率达 55.70 ( 见表 1)。该结果证明了从甘草废渣中可以有效的提取出 - 葡萄糖苷酶抑 制活性较高的甘草黄酮组分。 0008 该粉末为棕黄色无定形粉末， 难溶于水， 易溶于甲醇、 乙醇、 醋酸乙酯、 乙醚等有机 溶剂及稀碱液中。该粉末经盐酸 - 镁粉反应呈紫红色。 0009 本发明的优点和产生的有益效果 ： 0010 本发明的特点是甘草废渣中提取甘草黄酮， 就其产率和酶抑制活性方面都可接近 从甘草饮片中提取具有 - 葡萄糖苷酶。
9、抑制活性的甘草黄酮的标准， 从而可以逐步替代使 说 明 书 CN 102151296 B2/6 页 4 用以甘草饮片为原料的提取方法， 解决了甘草废渣资源的重复利用的问题。原料甘草废渣 成本低廉， 分离纯化工艺的操作步骤相对简单， 所需成本低， 适宜大规模工业化生产 ； 甘草 的降糖活性成分对糖尿病具有一定的防治作用， 具有良好的药用前景。 0011 本发明方法简便， 成本低廉， 并且替代了以往使用甘草饮片为原料的提取方法， 为 甘草废渣资源及甘草黄酮的利用、 开发提供了理论依据。 附图说明 0012 图 1 是有机溶剂热回流法流程图。 0013 图 2 是超声辅助有机溶剂热回流法流程图。 0。
10、014 图 3 是碱性溶剂提取法流程图。 0015 图 4 是超声辅助碱性溶剂提取法 具体实施方式 0016 实施例 1 0017 实验 1 甘草废渣中甘草黄酮的提取工艺筛选 0018 ( 一 ) 有机溶剂热回流法两种技术路线 ： 0019 取干燥的甘草渣 100g， 加入浓度为 95乙醇溶液 2000ml， 水浴回流温度 65， 时 间 60min， 过滤， 共提取 3 次， 合并滤液， 减压浓缩得浓缩液 ； 0020 a.将浓缩液用等体积石油醚萃取3次， 弃去石油醚层， 再加等体积乙酸乙酯萃取3 次， 得乙酸乙酯提取液 A1。将 A1用 5碳酸钠溶液洗涤 ( 调至溶液 PH8 9)， 然后。
11、加入 5 盐酸溶液 ( 调至溶液 PH5 6)， 静置沉淀， 溶液得 A2， 沉淀得 A3； 0021 b. 将浓缩液浸膏通过 30 60 目聚酰胺柱层析， 依次用水、 95乙醇梯度洗脱， 以 盐酸 - 镁粉反应检测， 将产物合并得 A4。 0022 流程简图见图 1。 0023 ( 二 ) 超声辅助有机溶剂热回流法两种技术路线 ： 0024 取干燥甘草渣 100g， 加入浓度为 80乙醇 1200ml， 超声温度为 65， 功率 40KHz， 每次提取 30min， 共提取 3 次， 过滤， 合并滤液得浓缩液， 0025 a.将浓缩液用等体积石油醚萃取3次， 弃去石油醚层， 再用等体积乙酸乙。
12、酯萃取3 次， 得乙酸乙酯提取液 B1。将 B1用 5碳酸钠溶液洗涤 ( 调至溶液 PH8 9)， 然后加入 5 盐酸溶液 ( 调至溶液 PH5 6)， 静置沉淀， 溶液得 B2， 沉淀得 B3。 0026 b. 将浓缩液浸膏通过 30 60 目聚酰胺柱层析， 依次用水、 95乙醇梯度洗脱， 以 盐酸 - 镁粉反应检测， 将产物合并得 B4。 0027 流程简图见图 2。 0028 ( 三 ) 碱性溶剂提取法 0029 取干燥甘草渣100g， 加入0.2mol/L的NaOH溶液620ml， 于90下加热提取30min， 过滤后滤渣。分别加入 470ml 和 310ml 的 NaOH 溶液， 加。
13、热提取两次， 合并 3 次提取液， 浓缩 得 C1。将 C1用 5盐酸 ( 调至溶液 PH5 6) 洗涤并沉淀， 得 C2。 0030 流程简图见图 3。 0031 ( 四 ) 超声辅助碱性溶剂提取法 说 明 书 CN 102151296 B3/6 页 5 0032 取甘草废渣 100g， 加入 0.2mol/L 的 NaOH 溶液 620ml， 于 45下超声 30min， 功率 40KHz， 过滤后滤渣。分别加入 470ml 和 310ml 的 NaOH 溶液， 再超声提取两次， 合并 3 次提 取液， 浓缩得 D1。将 D1用 5盐酸 ( 调至溶液 PH5 6) 洗涤并沉淀， 得 D2。。
14、 0033 流程简图见图 4。 0034 将各组分所得产物产物合并得 A4、 B4、 C2 和 D2冷冻干燥， 分别过筛混合均匀得固 体粉末， 称重并计算产率， 干燥密封保存， 用于甘草黄酮含量及 - 葡萄糖苷酶抑制活性的 测定。 0035 ( 五 ) 甘草黄酮含量的测定 0036 1 对照品溶液的制备 0037 精密称定甘草苷对照品 10mg， 用 50甲醇溶解， 定容于 50mL 容量瓶中， 得浓度为 0.2mg/mL 的对照品溶液， 备用。 0038 2 供试液的制备 ： 0039 精密称取 10mg 甘草黄酮粉末， 用 50甲醇溶解， 定容于 50mL 容量瓶中， 得浓度为 0.2mg。
15、/mL 的供试品溶液， 备用。 0040 3 检测波长的确定 0041 精确吸取甘草苷对照品溶液 2mL， 加入 7 NaOH 溶液 2mL， 室温放置 5min， 用甲醇 定容至10mL， 用甲醇做空白对照， 于190800nm波长处扫描， 结果在399nm处有最大吸收。 以同样的方法对辅料进行处理后扫描， 发现辅料在此处无吸收 ； 对甲醇和 7 NaOH 溶液进 行扫描， 结果发现二者均无明显的吸收。因而确定检测波长为 399nm。 0042 4 标准曲线的制作 0043 精确吸取 0.2mg/mL 甘草苷对照品溶液 0.25、 0.5、 1、 2、 2.5mL， 分别加入 1mL 甲醇，。
16、 再加入 7 NaOH 溶液 2mL， 室温放置 5min， 用甲醇稀释至 10mL， 在 399nm 处测定其吸收值。 以吸收度 Y 为纵坐标， 浓度 X 为横坐标， 得线性回归方程 ： Y 18.222X+0.0782， r 0.998， 线性范围 5 50g/mL。 0044 5 样品测定 0045 取供试液 2mL， 加入 7 NaOH 溶液 2mL， 室温放置 5min， 用 50甲醇定容至 10mL， 在 399nm 处测定其吸收值， 计算百分含量。 0046 ( 六 )- 葡萄糖苷酶抑制活性的测定 0047 反应体系为 ： 以 PNPG 为底物， 在 0.1mol/L 的磷酸盐缓。
17、冲 (PH 6.86)1ml 中， 加适 量待测样品溶液与 PNPG 溶液 ( 终浓度为 2mmol/L)， 然后加 - 葡萄糖苷酶 0.05U， 37反 应 15min 后， 加入 0.1mol/LNa2CO3 溶液 4ml 终止反应， 在 400nm 处测定吸收值。 0048 本实验中酶活性抑制率的计算公式 ： 0049 酶活性抑制率 A 空白 -(A 样品 -A 背景 )/A 空白 100 0050 A 空白 ： 不加待测样品反应后的吸收值 ； 0051 A 样品 ： 加入待测样品反应后的吸收值 ； 0052 A 背景 ： 只加待测样品的吸收值。结果见表 1。 0053 表 1 甘草废渣。
18、中甘草黄酮的提取工艺筛选结果 0054 实验所得各组分 产率 甘草黄酮百分含量 - 葡萄糖苷酶活性抑制 率 说 明 书 CN 102151296 B4/6 页 6 0055 A1 5.54 26.67 34.48 0056 A2 4.63 0.42 0 0057 A3 3.97 26.39 8.30 0058 A4 3.00 23.79 50.60 0059 B1 8.59 24.30 36.10 0060 B2 6.70 0.66 0 0061 B3 7.25 23.64 9.1 0062 B4 3.90 24.56 55.70 0063 C1 17.83 0.29 0 0064 C2 21。
19、.85 3.85 0 0065 D1 13.65 0.13 0 0066 D2 14.27 7.90 0 0067 从表 1 可以看出 ： 在甘草废渣中甘草黄酮的提取工艺筛选实验中， 上述的四种方 法均可从甘草废渣中提出一定量的黄酮类化合物， 其中碱性溶剂 C、 D 组的产率高， 含量低， 且无 - 葡萄糖苷酶抑制活性。这一结果的原因可能是我们采用的原料是经氨水提取甘草 酸工艺处理的甘草废渣， 而碱性的氨水可能已经将该部分黄酮类化合物带走， 所以再用碱 提取效果不佳。 0068 在有机溶剂热回流法中， 组分 A2( 产率 4.63， 甘草黄酮百分含量 0.42， - 葡 萄糖苷酶活性抑制率 0。
20、 ) 和 B2( 产率 6.70， 甘草黄酮百分含量 0.66， - 葡萄糖苷酶 活性抑制率 0 ) 是经碱提酸沉处理过的溶液部分， 其中已不含黄酮类化合物， 也无 - 葡 萄糖苷酶抑制活性。组分 A3( 产率 3.97， 甘草黄酮百分含量 26.39， - 葡萄糖苷酶活 性抑制率 8.30 ) 和 B3( 产率 7.25， 甘草黄酮百分含量 23.64， - 葡萄糖苷酶活性 抑制率 9.1 ) 是经碱提酸沉处理过的沉淀部分， 其中含有部分黄酮类化合物， 但是对比组 分 A4( 产率 3.00， 甘草黄酮百分含量 23.79， - 葡萄糖苷酶活性抑制率 50.60 ) 和 B4( 产率 3.9。
21、0， 甘草黄酮百分含量 24.56， - 葡萄糖苷酶活性抑制率 55.70 ) 表明 直接采用聚酰胺柱层析分离的方法能有效分离出大量甘草黄酮， 而且 B4 能够保留大部分 具有 - 葡萄糖苷酶抑制活性的组分。而采用碱提酸沉的分离方法效果不佳。 0069 由于组分 B4 的甘草黄酮含量和酶抑制率均高于 A4， 说明有机溶剂热回流法结合 超声辅助提取法可从甘草废渣中有效提取出具有 - 葡萄糖苷酶抑制活性的黄酮组分。 0070 实验 2 甘草废渣中提取分离降糖有效成分工艺路线的优化 0071 ( 一 ) 正交试验 0072 准确称取甘草废渣， 每份 50g， 采用超声辅助有机溶剂热回流法， 根据甘草。
22、黄酮的 理化性质， 选择乙醇浓度、 料液比、 提取时间和提取温度四个因素， 进行4因素3水平L9(34) 正交试验提取甘草黄酮粗提液 ( 见表 2)， 在超声功率为 40KHz 的条件下提取两次， 过滤， 合 并滤液， 回收溶剂， 得浸膏， 将所得浸膏通过聚酰胺(30-60目)柱层析， 依次用水、 95乙醇 洗脱， 以盐酸 - 镁粉反应检测合并得总黄酮。再将各组所得产物经减压浓缩和真空冷冻干 燥得甘草黄酮粉末， 测其产率、 含量和酶抑制率。 0073 表 2. 甘草黄酮分散片制备的因素水平表 0074 Tab.2 The table of factor and level 说 明 书 CN 1。
23、02151296 B5/6 页 7 0075 0076 实验结果通过对产率、 含量和酶抑制率影响的综合评价获得， 考虑三项指标的权 重不同， 将三项指标的结果做如下处理 ： 用产率的各个结果除以产率的最大值， 得到的比值 用来做综合平均值 X 和极差 R 的分析， 含量和酶抑制率结果同法处理 ( 见表 3 L9(34) 试验 表 )。 0077 表 3.L9(34) 试验表 0078 Tab.3 The table of L9(34)test 0079 说 明 书 CN 102151296 B6/6 页 8 0080 经上表分析可知， 从甘草废渣中提取甘草黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度 65， 。
24、料液比 1 12， 提取时间 1.5h， 提取温度 75。总黄酮提取率影响的主次顺序依次为乙醇 浓度 A 提取时间 C 提取温度 D 料液比 B。 0081 ( 二 ) 最佳条件重复性验证试验 0082 为证实上述筛选法提取工艺的稳定性， 以优选工艺， 重复进行 3 次实验， 测定甘草 黄酮平均产率为 7.10， 含量为 25.28， 酶抑制率 63.49， RSD 为 0.19， 提示该工艺稳 定， 重复性好。 说 明 书 CN 102151296 B1/3 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102151296 B2/3 页 10 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102151296 B3/3 页 11 图 4 说 明 书 附 图 。