发明领域
本发明涉及药学领域，具体的，本发明涉及一种用于预防和/或治疗 乙型肝炎、肝硬化的，含有化学式1所示结构的鞣花酸衍生物的药物组合 物，
<化学式1>
在上述化学式中，R1、R2、R3及R4相互独立的是H、OH或C1～C3的 烷氧基。
<化学式2>
背景技术
人的乙型肝炎病毒(HBV)能够诱发急性或慢性肝炎，并能够转化为 自抑性急性肝炎、暴发性肝炎或慢性活动性肝炎。慢性活动性肝炎能够诱 发肝硬变及肝癌等，而且也能恶化成为伴有肝功能衰竭的严重疾病 (Brechot，C.，J.Hepatol.，4，269-279，1987)。如果患上肝炎，大 部分患者表现出持续性或活动性肝炎的症状，也有些患者没有任何的症 状。但是，上述病毒性肝炎的发病原因或诱发因子还没有完全明确的研究 结果。在发现乙型肝炎病毒所导致的肝损伤是宿主的免疫细胞所传递的部 分证据之后(Milich，D.R.et al.，J.Immunol.，143，3141-3147，1989)， 积极开展了针对诱发肝细胞坏死的病毒性抗原和特定B细胞及T细胞的免 疫反应，及病毒蛋白的直接细胞发病原因或肿瘤发病原因的研究(R. Zschke，O.et al.，Nature，348，252-254(1990))。
但是，不同患者表现出来不同症状的原因还没有研究透澈。乙型肝炎 因为其症状的严重性而引起了针对其治疗的众多关注和研究。现在，虽然 已开发出几种药物或疫苗，而且在临床前实验和临床实验中得到了较满意 的效果，但是几乎没有针对性治疗的药物，因此，到目前为止针对乙型肝 炎病毒(HBV)性肝炎患者的唯一的治疗方法是依靠人体免疫系统。HBV 的人体免疫作用虽然能够去除HBV粒子，但另一方面也破坏肝细胞，因此 上述免疫作用的副作用也可能引发致命的疾病。另外，上述问题的存在也 导致了难以预测疾病的进程，因此为了快速有效的治疗肝炎，最好综合使 用抗病毒疗法和免疫疗法。
也就是说，在治疗病毒性肝炎时，感染的肝细胞通过有细胞毒性的T 淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)而被破坏，对于遭到破坏的 肝细胞所释放出的病毒粒子，需要去除其中病毒的中和抗体，在防止对肝 细胞再次感染的同时，也需要抑制病毒的增殖。到目前为止，为了治疗乙 型肝炎病毒，尝试过干扰素、核酸衍生物或免疫调节物质等各种方法，其 中只有干扰素-α有一定治疗效果。因此，在美国目前只把干扰素-α作 为肝炎治疗剂使用。干扰素-α是在1970年代中期，由Sculled等人首先 作为乙型肝炎的治疗剂使用，发现其具有抑制HBV复制的效果。但是，干 扰素-α需要一周用药三次，至少要使用三个月的时间，才在20％左右的 患者身上表现出抑制病毒增殖的治疗效果，并且没有表现出持续的抑制效 果。对于东方人来说，许多母婴之间垂直感染的患者或儿童对干扰素-α 表现出一定的抗药性，因此治疗效果不佳。另外，最近的研究成果发现， 被乙型肝炎病毒感染的急性或慢性患者中只有不足50％的患者适合采取干 扰素-α的治疗方法。也就是说，只有因病毒的影响而使肝所生成的各种 酶(AST、SGOT、ALT、SGPT等)的酶量提高的患者，干扰素-α治疗法才 能取得一定疗效。
因此，当务之急是开发出对干扰素-α产生抗药性的乙型肝炎患者的 治疗剂。尤其是通过寻找阻碍病毒附着于收容体或特异性的阻碍病毒的活 性蛋白或综合酶的物质，开发出抑制乙型肝炎病毒增殖的方法。
在乙型肝炎病毒复制的过程中，生成三种主要抗原(c、s、e抗原)， 其中c抗原(核心抗原)为结构性抗原的结晶体，而s抗原(表面抗原) 为通过病毒表面蛋白质生成的抗原结晶体。e抗原是能够检测被乙型肝炎 病毒感染与否的血液中的指示物质。e抗原不是乙型肝炎病毒繁殖所需的 必要条件，其对乙型肝炎病毒有何影响还没有准确的研究报告。但是，根 据e抗原的遗传因子能够在类似动物的病毒中发现的情况推断，上述抗原 的作用非常重要。因此，e抗原是除去病毒的免疫学目标物，尤其是在去 除病毒的过程中宿主起到重要的作用(Pignatelli，M.et al.，J.Hepal. 4，15-16，1987)。
溶解性的e抗原具有在血液中循环并分泌的性质。e抗原于血清中分 泌并存在，而且有通过胎盘由母亲传染给新生儿的可能性。但是，s抗原 不存在上述可能性。如果e抗原通过循环系统到达胸腺，预计将会破坏辅 助T细胞(T-helper cell)的功能。因此，呈阳性的母亲所生出来的孩 子，带有c抗原/e抗原-特定辅助T细胞的耐受性(tolerance)的免疫性 缺陷(Milich，D.R.，et al.，PNAS USA 87，6599-6603，1990)。因为 呈阳性的母亲所生的孩子具有辅助T细胞的耐受性，因此如果被HBV感染， 很容易发展成慢性肝炎。
另外，还有报告称各种蔬菜及水果中的苯酚化合物具有抗癌、抗病毒、 防止脂质氧化及预防循环系统疾病等药理活性(赵后宗、李春子、吴盛灿、 徐研后著，具有药理作用的食品，晓日文化社，1998)。
因此，本发明的发明人从天然物质中提取了具有抗乙型肝炎病毒的活 性的物质，开发出肝炎治疗剂及肝硬化预防和治疗剂，研究结果发现，广 泛存在于植物中的鞣花酸的鞣花酸衍生物具有抑制乙型肝炎病毒e抗原的 生成，从而可抑制免疫耐受性(immuno tolerance)，能够有效地预防和 治疗肝炎和肝硬化。
发明内容
本发明的目的是提供了含有化学式1所示结构的鞣花酸衍生物在乙 型肝炎、肝硬化的预防和/或治疗中的应用。
为了达到上述目的，本发明提供了含有化学式1所示结构的鞣花酸 (ellagic acid)的鞣花酸衍生物或其药用盐作为有效成分的，用于预防 和治疗乙型肝炎的药物组合物。
下面，对本发明进行详细说明。
本发明提供了含有化学式1所示结构的鞣花酸的鞣花酸衍生物或其 药用盐作为有效成分的，用于预防和治疗乙型肝炎的药物组合物。
<化学式1>
其中R1、R2、R3及R4相互独立的是H、OH或C1～C3的烷氧基。
本发明的鞣花酸衍生物包括下述化学式2所示的鞣花酸。具体而言， 鞣花酸衍生物包括在化学式1中满足R1、R2、R3、R4＝OH的下述化学式2 的鞣花酸等。
<化学式2>
上述化学式1所示的本发明的鞣花酸衍生物，可以药用盐的形式使 用，优选上述盐为与药学上可用的游离酸所形成的酸加成盐。所述游离酸 可以是无机酸或有机酸。 其中，无机酸包括盐酸、溴酸、磺酸及磷酸等，有机酸包括柠檬酸、乙 酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸 葡糖酸、甲磺酸、乙 醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、格鲁特伦酸 盐本酸 谷氨酸和天冬氨酸等。另外，化学式1的鞣花酸衍生物可以是与 碱形成的药学可用的金属盐，尤其是碱金属盐，例如钠盐及钾盐。
本发明在评价上述鞣花酸衍生物对乙型肝炎病毒的抗病毒活性时，利 用乙型肝炎病毒的代表物质HbeAg，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)进 行测定，结果发现随着鞣花酸衍生物浓度增加，HBeAg的量显著减少。另 外，分泌到细胞外部的e抗原得到了很大程度的抑制，但对于细胞内的e 抗原的生成不产生影响(图2)。另外，投放鞣花酸的试验组中发生了T/B 细胞反应(图3)，而且促进了e抗体的生成和IgG形态的抗体的生成(图 5、图6)。
本发明含有鞣花酸衍生物或其药用盐作为有效成分的药物组合物可 抑制将病毒性肝炎转变为慢性肝炎的乙型肝炎病毒e抗原的生成，从而抑 制免疫耐受性，因此能够有效地用于肝炎、肝硬化的预防和治疗。
根据本发明，为了治疗乙型肝炎病毒，将鞣花酸衍生物或其药用盐作 为有效成分，并将其和药剂学上可用的载体混合在一起，即可制出用于疾 病的预防或治疗的药物组合物。本发明用于预防和/治疗乙型肝炎的药物 组合物，可包括常规的赋形剂、甜味剂、润滑剂及香味剂等，而且可通过 常规的制药方法制成颗粒剂、胶囊剂、散剂、乳剂或其他剂型。
具体的，可将本发明的药物组合物制成常常用的锭剂、含片 (troches)、糖锭、水性或油性悬浮液、粉剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶 囊、糖浆剂、酏剂等。为了制成锭剂或胶囊，可加入乳糖、山梨醇、甘露 醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶等粘合剂；磷酸钾盐等赋形剂；玉米 淀粉或红薯淀粉等崩解剂；硬脂酸镁、硬脂酸钾、硬脂酰甲酸钠或聚乙二 醇系列等蜡状物的润滑剂。如果是胶囊，除了加入如上所述物质外，还可 含有脂肪油等液体载体。
另外，本发明的药物组合物可以通过非口服的方式使用，所述非口服 方式是通过皮下注射、静脉注射、肌肉内注射或胸内注射等注射方式。制 备用于非口服方式的剂型时，可将上述化学式1所示的化合物与稳定剂及 缓冲剂一起用水混合，形成溶液或悬浮液，并利用罐和瓶制成单位剂量形 式。
毒性实验结果表明，将本发明的衍生物以5g/kg的容量通过口服的方 式给试验鼠使用时，几乎没有毒性，对包括肝在内的脏器没有任何副作用。
另外，上述包含鞣花酸的鞣花酸衍生物不会对包括肝在内的脏器带来 任何副作用(Merck Index Vol.11th edition.1989)。本发明通过细胞 毒性及口服急性毒性实验证实了鞣花酸衍生物的安全性。
本发明有效成分鞣花酸衍生物的使用量根据活性成分在体内的吸收 程度、非活化率及排泄速度、患者的年龄、性别及状态、所需治疗疾病的 严重程度等决定，通常，化学式1所示化合物的成人日剂量为 0.1-500mg/kg(体重)，可一次或分多次施用，优选剂量为0.1-100mg/kg (体重)。
附图简要说明
图1为本发明鞣花酸的化学式。
图2为在被乙肝病毒感染的肝细胞中，鞣花酸在不改变s抗原内外部 的量，也不改变e抗原内部生成的情况下抑制外部生成分泌的酶免疫反应 示意图。
图3为对e抗原转基因小鼠进行鞣花酸处理后，T/B淋巴细胞变化曲 线图。
图4为对e抗原转基因小鼠进行鞣花酸处理后，抑制e抗原生成的曲 线图。
图5为对e抗原转基因小鼠进行鞣花酸处理后，生成e抗体的曲线图。
图6为对e抗原转基因小鼠进行鞣花酸处理后，生成IgG型免疫抗 体的曲线图。
图7为对e抗原转基因小鼠进行鞣花酸处理后，CTL反应亢进的曲线 图。
图8为对e抗原转基因小鼠进行鞣花酸处理后，促进IL-4生成的曲 线图。
图9为对e抗原转基因小鼠进行鞣花酸处理后，增进IFN-γ生成的 曲线图。
图10为对肝硬化动物模型进行鞣花酸处理后，各种血清因子的变化 曲线图。
图11为对肝硬化动物模型进行鞣花酸处理后，肝星状细胞(Hepatic stellate cell)的变化曲线图。
具体实施方式
下面，对本发明的具体实施方式进行详细描述。
以下实施例仅用以说明本发明而不会限制本发明，尽管参照以下较佳 实施例对本发明进行详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明进行修改、改变性或者等同替换而不脱离本发明的精神和范围，其 均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之中。
本发明以化学式1的衍生物作为有效成分的药物组合物可通过非口 服或口服的方式使用，在下面的内容中，非口服方式采用注射剂，口服方 式采用糖浆剂或锭剂。
实施例1鞣花酸抑制e抗原生成的作用
对e抗原及s抗原所分泌的HepG2 2.2.15细胞用鞣花酸处理后，观 察各抗原是否在细胞内外部进行分泌。于24穴培养皿中培养适当量的细 胞，在没有血清的培养基中放置4-5小时。然后用不同浓度的鞣花酸对其 进行处理，放置过夜。大约过16小时之后，取细胞上清液及细胞，采用 ELISA法测定e抗原及s抗原。结果，细胞外部的s抗原及细胞内部的e 抗原的分泌没有变化，而细胞外部的e抗原的量显著减少(附图2)。
实施例2在e抗原转基因小鼠上的T/B细胞反应
培养e抗原转基因小鼠并进行e抗原免疫，两周之后再次进行免疫， 并在两周之后取脾脏进行T/B细胞增殖试验(cell proliferation assay)。将脾脏用筛研磨，溶解红血球后计算细胞数。在96穴培养皿中 对规定量的细胞添加不同浓度的e抗原并培养过夜，之后在第二天添加 MTT试验溶液，并进行4个小时的反应。4小时后，添加增溶溶液并在450nm 下测定OD。
在转基因小鼠身上几乎没有产生反应，而在使用EA组中发生了与对 照组类似的T/B细胞反应(附图3)。
实施例3观察e抗原转基因小鼠体内e抗原和e抗体的生成
培养e抗原转基因小鼠并进行e抗原免疫，两周之后再次进行免疫。 之后，以三、四、五、六周为间隔取小鼠血液，分离血清之后，利用Enzygnost HBeAg ELISA试剂盒(DADE BEHRING)测定e抗原和e抗体。
在用鞣花酸处理的转基因小鼠组中，在抑制e抗原的生成的同时产生 了e抗体，但未用鞣花酸处理的小鼠不但持续分泌e抗原，而且也没有产 生抗体(附图4、5)。
实施例4观察e抗原转基因小鼠的IgG同型(isotype)
培养e抗原转基因小鼠并进行e抗原免疫，两周之后再次进行免疫， 并在两周之后取脾脏。所述的脾脏通过与T/B细胞试验相同的方法进行分 离之后，于96穴培养皿中用HBeAg(0.05ug/ml)处理并培养7天。7天 之后，分离上清液并用ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping试 剂盒I(PIERCE)测定是否同型。结果标明，转基因小鼠组中没有产生IgG 型的抗体，但鞣花酸处理组产生了IgG型抗体(附图6)。
实施例5观察e抗原转基因小鼠的CTL应答
培养e抗原转基因小白鼠并进行e抗原免疫，两周之后再次进行免疫， 并在两周之后取脾脏。用上述方法从脾脏分离细胞后作为效应细胞 (effector cell)使用，靶细胞(target cell)采用e抗原转染的EL4细 胞系。
将分离出的脾细胞中添加e抗原并进行一夜时间的再刺激 (restimulation)后，第二天早晨将效应细胞与靶细胞之比分别调节为 100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1后进行4-5小时的反应。然后，于上层 各取100ul并添加LDH细胞毒性检测试剂盒(TAKARA)的溶液，进行LDH 试验。
在转基因小鼠组中发生了微弱的CTL应答，而鞣花酸处理组的小鼠发 生了更为亢进的反应(附图7)。
实施例6观察e抗原转基因小鼠体内细胞因子的生成
在按上述方法分离的脾脏中，观察IL-4、IFN-γ细胞因子发生何种 变化。将所分离的脾脏细胞和与e抗原一起培养七天，在第4天和第7天 取其上清液。之后用Titer Zyme EIA(Assay Desings，Inc)的IL-4、IFN- γ试剂盒对细胞因子进行定量测定。结果，在转基因小鼠组中几乎没有发 生反应，但鞣花酸处理组明显的生成了细胞因子，而且辅助T细胞反应也 相当活跃(附图8、9)。
实施例7肝硬化动物模型中血清因子的变化
将wister大鼠中用CCl4处理十三周，形成肝硬化动物模型。然后， 施用鞣花酸4周。之后，取血并用酶联免疫吸附分析法实施血液检查。
用CCl4进行处理后，因为ALT、AST、胆固醇(colesterole)数值显 著上升，加剧了肝的损伤程度，而且发生了纤维化现象。另外，鞣花酸处 理组中，上述数值几乎达到了正常水平(附图10)。
实施例8肝硬化动物模型中肝星状细胞的变化
从肝硬化组、经鞣花酸处理的肝硬化组和正常组等三组中分离出各自 的肝，并对其进行两步胶原酶灌注，然后用Nycodenz(Sigma)进行离心分 离，分离出肝星状细胞。之后在DMEM介质中培养并用MTT试验观察增殖 的程度。与预计相同，发生肝硬化的肝星状细胞产生了活跃的增殖。与之 相比，鞣花酸处理组只产生了非常微弱的增殖(附图11)。
如上所述，本发明的鞣花酸衍生物，可在不影响肝炎病毒的DNA整合 酶活性的情况下大大抑制维持慢性肝炎状态的e抗原的分泌，而且毒性较 低，因此可用于乙型肝炎患者，尤其是免疫力低下的慢性肝炎患者的治疗。