发明背景
发明领域
本发明属于医药、疫苗和药物制剂领域。本发明提供了包含尼古丁-病毒样颗粒缀合物和稳定剂的制剂，其中所述的稳定剂包含非还原二糖和非离子型表面活性剂。冻干的制剂于室温经长的储存时间后是稳定的。
相关技术：
用于治疗或预防尼古丁成瘾的疫苗近来吸引了公众的注意。这些疫苗通常含有与载体共价结合的尼古丁分子，因为尼古丁是低分子量有机化合物且不能通过其本身引起免疫反应。此外，由于尼古丁没有能用于此类与载体结合的合适的官能团，通常需要将连接序列引入尼古丁分子。近来已经报道了数种疫苗的开发，例如在US5’876’727、US6’232’082、US6’656’469和US6’932’971中。所描述的缀合物不仅在载体的性质上有所不同，而且连接序列的性质和将连接序列引入到尼古丁上的位点也不同。
US6’932’971描述了将尼古丁分子通过具有酯官能度的连接序列与病毒样颗粒(VLP)的偶联，形成了有序的且重复的尼古丁-载体缀合物并引起了高滴度尼古丁特异性抗体的产生。相同的作者最近显示了包含通过具有酯官能度连接序列与尼古丁分子共价结合的RNA噬菌体Qβ病毒样颗粒的疫苗能对人类戒烟有效(Maurer等，Eur.J.Immun.200535：2031-40)。
疫苗组合物稳定和最小化或避免化学和/或物理降解的需要要求开发满足此类需求的制剂。
发明概述
我们目前惊奇地发现了能够稳定尼古丁-病毒样颗粒缀合物的冻干制剂，所述缀合物含有通过连接序列方式与病毒样颗粒共价结合的尼古丁分子，所述连接序列包含至少一个羧酸酯官能度。此外，我们惊奇地发现这一冻干制剂于室温甚至于升高的温度(40℃)经长的一段保存时间过程中是稳定的。而且，本发明的冻干制剂包含简单且经济的稳定剂组合物，因为在其中包含最少量的赋形剂。
因此，一方面，本发明提供了冻干制剂，其包含：(i)至少一个尼古丁-病毒样颗粒缀合物，该缀合物包含：(a)病毒样颗粒；和(b)至少一个尼古丁分子，其中所述至少一个尼古丁分子通过连接序列共价结合至所述病毒样颗粒，其中所述的连接序列包含酯官能度；以及(ii)稳定剂组合物，其包含：(c)至少一种非还原二糖，其中所述非还原二糖的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是0.5％至15％(w/v)；(d)至少一种非离子型表面活性剂，其中所述非离子型表面活性剂的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是0.0005％至0.1％(w/v)；以及其中所述稳定剂组合物在冻干之前具有从5.4至6.6的pH值。
另一方面，本发明提供了用于制备本发明冻干制剂的方法。
还在另一方面，本发明提供了包含溶解和/或悬浮于生理可接受的溶液或无菌水、优选注射用水(WPI)的本发明冻干制剂的重构制剂。在其它优选的实施方案中，重构制剂进一步包含佐剂。
发明详述
除非另外定义，文中使用的技术和科学术语具有与发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
佐剂：本文所用的术语“佐剂”是指免疫反应的非特异性刺激物或允许在宿主中产生积存的物质，当其分别与本发明的疫苗和药物组合物联合时能提供甚至更增强的免疫反应。可以应用各种佐剂。实例包括完全和不完全弗氏佐剂、氢氧化铝和改良的胞壁酰二肽。其它佐剂是矿物凝胶诸如氢氧化铝、表面活性物质诸如溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、 聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚、以及潜在有用的人类佐剂，诸如BCG(结核菌苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。此类佐剂在本领域也是公知的。其它可以与本发明组合物施与的佐剂包括但不限于单磷酸脂类免疫调节剂、AdjuVax100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294和病毒体佐剂技术(Virosomal adjuvant technology)。佐剂也可以包含这些物质的混合物。通常已将VLP描述为佐剂。然而，在这一申请上下文中使用的术语“佐剂”不是指用于本发明制剂的VLP，而是指包括所述VLP在内的佐剂。
外壳蛋白：在这一申请中，术语“外壳蛋白”(coat protein)可以与术语“衣壳蛋白”(capsid protein)互换使用，是指病毒蛋白，优选病毒的天然衣壳的亚单位，其能被掺入病毒衣壳或VLP中，其中所述病毒优选是RNA噬菌体。
冻干之前的制剂：术语“冻干之前的制剂”是指本发明的液体制剂，其一般地且优选在24小时内、以及更一般和优选在8小时内、甚至更一般和优选在2至4小时内经受冻干处理。术语“冻干处理”(lyophilizationprocess)和术语“冷冻干燥处理”(freeze-drying process)在本文中可互换使用且应被认为是同义的。
冻干制剂：术语“冻干制剂”是指通过液体制剂的冷冻干燥处理得到或能够得到的组合物。一般且优选地，其为具有少于5％、优选少于3％水含量的固体组合物。优选地，术语“冻干制剂”是指通过用于制备本发明冻干制剂的方法得到或可得到的组合物。
重构制剂：术语“重构制剂”是指将冻干制剂溶解和/或悬浮于生理可接受的溶液中得到的液体制剂。
连接序列：文中所使用的术语“连接序列”是指共价结合尼古丁分子至病毒样颗粒的分子实体。
室温：文中使用的术语“室温”是指15℃至30℃、优选20℃至27℃、更优选25℃的温度。
稳定：文中使用的术语“稳定的”是指包含尼古丁-VLP缀合物、优选 包含尼古丁-RNA噬菌体QβVLP的缀合物、以及更优选包含Nic-Qβ的本发明冻干制剂的状态，其中，于室温或于升高的温度(40℃)保存高达15周、优选高达20周、更优选高达25周，(i)在制剂中游离尼古丁和尼古丁衍生物的总量少于制剂中尼古丁总量的7％，优选少于5％、更优选少于3％、甚至更优选少于2％；以及(ii)与在冻干之前的制剂中尼古丁-VLP低聚物和集聚物的总量、优选尼古丁-RNA噬菌体QβVLP低聚物和集聚物总量、优选Nic-Qβ低聚物和集聚物总量相比，尼古丁-VLP低聚物和集聚物的总量、优选尼古丁-RNA噬菌体QβVLP低聚物和集聚物总量、优选Nic-Qβ低聚物和集聚物总量增加不超过10％、优选不超过7％、更优选不超过4％。保存后制剂中尼古丁-VLP低聚物和集聚物的总量减去冻干前尼古丁-VLP低聚物和集聚物的总量得到了如文中使用的增加百分比。例如，如果在冻干前制剂中有1％的Nic-Qβ低聚物和集聚物，且在根据本发明冻干和保存15周后在重构制剂中有4％的Nic-Qβ低聚物和集聚物，则增加百分比是3％。文中使用的术语“游离的尼古丁和尼古丁衍生物”是指没有与本发明的病毒样颗粒共价结合的尼古丁和尼古丁衍生物。确定尼古丁总量及游离尼古丁或尼古丁衍生物的方法优选是如本文实施例1所描述的RP-HPLC分析法。确定尼古丁-VLP低聚物和集聚物总量、优选尼古丁-RNA噬菌体QβVLP低聚物和集聚物总量、优选Nic-Qβ低聚物和集聚物总量的方法优选是如文中实施例1所描述的非对称流场流分级(asymmetrical flow fieldflow fractionation；AF4)分析法，在其中将含有比尼古丁-VLP单体和二聚物、优选比尼古丁-RNA噬菌体QβVLP单体和二聚物、优选比Nic-Qβ单体和二聚物更大的颗粒的级分在计算中相加。
低聚物：在术语“尼古丁-VLP低聚物”、“尼古丁-RNA噬菌体QβVLP低聚物”、“Nic-Qβ低聚物”中所使用的术语“低聚物”分别是指至少三个且多至十个VLP或Qβ的VLP的聚集。
集聚物：在术语“尼古丁-VLP集聚物”、“尼古丁-RNA噬菌体QβVLP集聚物”、“Nic-Qβ集聚物”中所使用的术语“集聚物”分别是指至少十个VLP或Qβ的VLP的聚集。
病毒颗粒：本文中使用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形式。在一些病毒类型中，其包含被蛋白衣壳包围的基因组；其它病毒类型还具有其它结构(例如，被膜、尾等)。
文中使用的病毒样颗粒(VLP)是指非复制性或非感染性的、优选非复制性和非感染性的病毒颗粒，或者指非复制性或非感染性的、优选非复制性和非感染性的类似于病毒颗粒的结构，优选病毒衣壳。文中使用的术语“非复制性”是指不能复制VLP所包含的基因组。文中使用的术语“非感染性”是指不能进入宿主细胞。根据本发明的病毒样颗粒优选是非复制性和/或非感染性的是因为其缺乏全部或部分的病毒基因组或基因组功能。在一个实施方案中，病毒样颗粒是其中病毒基因组已被物理或化学失活的病毒颗粒。一般且更优选地，病毒样颗粒缺乏全部或部分的病毒基因组的复制和感染元件。根据本发明的病毒样颗粒可以含有与它们的基因组不同的核酸。根据本发明的病毒样颗粒的典型和优选实施方式是病毒衣壳，诸如相应病毒、噬菌体、优选RNA噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指由病毒蛋白亚单位组装组成的大分子组合体。一般地，有60、120、180、240、300、360以及超过360个病毒蛋白亚单位。一般且优选地，这些亚单位的相互作用导致形成了具有固有重复结构的病毒衣壳或病毒衣壳样结构，其中所述的结构典型地是球状或管状。例如，RNA噬菌体或HbcAgs的衣壳具有二十面体对称的球状形式。文中所使用的术语“衣壳样结构”是指由病毒蛋白亚单位组成的大分子组合体，其类似于上面所定义的衣壳形态但与典型的对称组合体不同，但是保留了足够程度的顺序和重复性。病毒颗粒和病毒样颗粒的一个常见特征是其亚单位的高度有序和重复排列。
RNA噬菌体的病毒样颗粒：本文所使用的术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指包含RNA噬菌体外壳蛋白、突变体或其片段，或优选基本上由RNA噬菌体外壳蛋白、突变体或其片段组成，或由RNA噬菌体外壳蛋白、突变体或其片段组成的病毒样颗粒。此外，RNA噬菌体病毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构、是非复制和/或非感染性的，且至少缺乏编码 RNA噬菌体复制系统的基因，以及典型地也缺乏编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白的基因。然而，这一定义也应当包含其中上述提及的基因仍然存在但失活的RNA噬菌体病毒样颗粒，这样也因此产生了非复制和/或非感染性的RNA噬菌体病毒样颗粒。优选的衍生自RNA噬菌体的VLPs展示出二十面体对称且由180个亚单位组成。在本发明中，在这一上下文中术语“亚单位”和“单体”可互换且相同地使用。提供RNA噬菌体非复制和/或非感染性病毒样颗粒的优选方法是通过物理、化学失活，诸如UV辐射、甲醛处理，一般且优选地通过基因操作。
一个、一种：在这一发明中使用术语“一个”或“一种”时，除非另外标明，它们的意思是“至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”。
本发明一方面提供冻干制剂，其包含：(i)至少一个尼古丁-病毒样颗粒缀合物，该缀合物包含：(a)病毒样颗粒；以及(b)至少一个尼古丁分子，其中所述的至少一个尼古丁分子通过连接序列共价结合至所述病毒样颗粒，其中所述的连接序列包含酯官能度；以及(ii)稳定剂组合物，其包含：(c)至少一种，优选一种单一的非还原二糖，其中所述非还原二糖的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是0.5％至15％(w/v)；(d)至少一种，优选一种单一的非离子型表面活性剂，其中所述非离子型表面活性剂的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是0.0005％至0.1％(w/v)；以及其中所述稳定剂组合物在冻干之前具有5.4至6.6的pH值。如本领域所知的那样，蛋白组合物的冻干通常产生更稳定并因此具有更长贮存期限的产品。此外，冻干制剂具有存在于尼古丁-VLP缀合物中的酯功能度的增强稳定性以及RNA组分的增强稳定性。
备选地另一方面，本发明提供了液体制剂，其包含：(i)至少一个尼古丁-病毒样颗粒缀合物，该缀合物包含：(a)病毒样颗粒；以及(b)至少一个尼古丁分子，其中所述至少一个尼古丁分子通过连接序列共价结合至所述病毒样颗粒，其中所述的连接序列包含酯官能度；以及(ii)稳定剂组合物，其包含：(c)至少一种，优选一种单一非还原二糖，其中所述非还原二糖的 浓度就在所述制剂中的浓度而言是从0.5％至15％(w/v)；(d)至少一种，优选一种单一的非离子型表面活性剂，其中所述非离子型表面活性剂的浓度就在所述制剂中的浓度而言是从0.0005％至0.1％(w/v)；以及其中所述稳定剂组合物具有5.4至6.6的pH值。此外，本发明提供了通过包括冷冻所述液体制剂和干燥所述液体制剂步骤的冻干方法可得到的制剂。
另一方面，本发明提供了液体制剂，其包含(i)至少一个尼古丁-病毒样颗粒缀合物，该缀合物包含：(a)病毒样颗粒；以及(b)至少一个尼古丁分子，其中所述至少一个尼古丁分子通过连接序列共价结合至所述VLP，其中所述的连接序列包含酯官能度；以及(ii)稳定剂组合物，其包含或由以下组分组成：(c)至少一种，优选一种单一的非离子型表面活性剂，其中所述非离子型表面活性剂的浓度就在所述制剂中的浓度而言是从0.0005％至0.1％(w/v)；以及其中所述稳定剂组合物具有5.4至6.6的pH值。
在一个优选的实施方案中，本发明的液体或冻干制剂只包含一种碳水化合物、优选只有一种糖，糖优选非还原二糖。在一个优选的实施方案中，本发明的液体或冻干制剂不包含添加的氨基酸。这意味着没有额外的氨基酸被添加至制剂中。然而，由于病毒样颗粒的降解，制剂可以包含痕量的氨基酸。
在一个优选的实施方案中，本发明的液体或冻干制剂不包含牛血清白蛋白或人血清白蛋白。在一个更优选的实施方案中，本发明的制剂不包含任何种类的血清蛋白。排除血清有利于避免潜在的血清污染问题。
在一个优选的实施方案中，本发明的液体或冻干制剂，尤其是本发明的冻干制剂不包含氯化钠。NaCl的排除避免了制剂中不必要的高摩尔渗透压浓度。此外，盐的排除还消除了在冻干过程中盐对蛋白稳定性的可能的不利影响。
在一个优选的实施方案中，所述至少一种、优选一种单一的非还原二糖是蔗糖或海藻糖。在一个进一步优选的实施方案中，非还原二糖是海藻糖。
在一个优选的实施方案中，就液体制剂中的浓度而言，或对于冻干制 剂来说就冻干之前制剂中的浓度而言，至少一种、优选一种单一的非还原性二糖的浓度是从3％至15％(w/v)、优选从5％至12％(w/v)、优选从5％至10％(w/v)、优选从7.5％至10％(w/v)、优选10％(w/v)。除非另外明确表明，在整个申请中所表达的海藻糖浓度是指海藻糖二水合物(2H2O)的浓度。在海藻糖二水合物浓度和无水海藻糖浓度之间转换是本领域技术人员的公知常识。例如，10％海藻糖二水合物等于9％无水海藻糖。
在一个优选的实施方案中，本发明的液体或冻干制剂、优选冻干制剂的稳定剂组合物还包含至少一种、优选一种单一的填充剂。在一个进一步优选的实施方案中，就液体制剂中的浓度而言，或对于冻干制剂来说就冻干之前制剂中的浓度而言，所述非还原二糖和所述填充剂的总浓度是0.5％至15％(w/v)，条件是所述非还原二糖浓度至少是0.5％(w/v)、优选至少1％(w/v)。在一个进一步优选的实施方案中，在液体制剂中，或对于冻干制剂来说就冻干之前制剂中的浓度而言，所述至少一种、优选一种单一的非还原二糖和所述至少一种、优选一种单一的填充剂的总浓度是从3％至10％、优选从3％至8％(w/v)、优选从3％至7％、优选从4.5％至7％、更优选从4.5％至6％(w/v)。
在一个优选的实施方案中，在冻干之前的制剂中所述至少一种、优选一种单一的非还原二糖和所述至少一种、优选一种单一的填充剂的总浓度是从3％至10％(w/v)、优选从4.5％至7％(w/v)，其中所述非还原二糖的浓度至少是1％(w/v)。优选地，制剂的摩尔渗透压浓度是从250至350毫渗摩尔/Kg(mosm/Kg)，更优选约300毫渗摩尔/Kg。
在一个优选的实施方案中，在冻干之前的制剂中所述至少一种、优选一种单一的非还原二糖和所述至少一种、优选一种单一的填充剂的总浓度是从3％至10％(w/v)、优选从4.5％至7％(w/v)，其中所述填充剂的浓度至少是1％(w/v)。优选地，制剂的摩尔渗透压浓度是从250至350毫渗摩尔/Kg，更优选约300毫渗摩尔/Kg。
在一个优选的实施方案中，在冻干之前的制剂中所述至少一种、优选一种单一的非还原二糖和所述至少一种、优选一种单一的填充剂的总浓度 是从3％至10％(w/v)、优选从4.5％至7％(w/v)，其中所述填充剂的浓度至少是1％(w/v)以及所述非还原二糖的浓度至少是1％(w/v)。优选地，制剂的摩尔渗透压浓度是从250至350毫渗摩尔/Kg，更优选约300毫渗摩尔/Kg。
在一个优选的实施方案中，非还原二糖是海藻糖且填充剂是甘露糖醇。
在一个非常优选的实施方案中，在冻干之前的制剂中所述至少一种、优选一种单一的非还原二糖和所述至少一种、优选一种单一的填充剂的总浓度是从5.0至6.5％(w/v)。在一个更优选的实施方案中，填充剂和非还原二糖之间的比值是从3.5:1至4.5:1，优选4:1。在一个更优选的实施方案中，非还原二糖是海藻糖以及填充剂是甘露糖醇。在一个非常优选的实施方案中，在冻干之前的制剂中海藻糖的浓度是1.1％(w/v)以及甘露糖醇浓度是4.4％(w/v)。
在一个优选的实施方案中，填充剂是甘露糖醇或甘氨酸。在一个更优选的实施方案中，填充剂是甘露糖醇。包含填充剂、优选甘露糖醇有助于得到稳定的饼状物结构，并且可能在冻干过程中允许较高的初次干燥温度(primary drying temperature)，这有利于降低生产成本。
在一个优选的实施方案中，稳定剂组合物的pH是从5.4至6.6、优选从5.6至6.4、优选从5.8至6.4、优选从6.0至6.4、优选6.2。在一个更优选的实施方案中，pH是5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5和6.6。
在一个优选的实施方案中，在液体制剂中，或对于冻干制剂来说就冻干之前制剂中的浓度而言，非离子型表面活性剂从0.0025％至0.02％(w/v)、优选0.0025％-0.01％(w/v)、优选0.005％(w/v)。
在一个优选的实施方案中，非离子型表面活性剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯(polysorbate20)或失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚油酸酯(polysorbate80)。在一个优选的实施方案中，非离子型表面活性剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。
病毒样颗粒可以是本领域所知的任何具有有序且重复结构的病毒的病 毒样颗粒。在WO2004/009124第25页10-21行、第26页11-28行、第28页第4行至第31页第4行公开了其外壳或衣壳蛋白可用于制备VLPs的作为例证的DNA或RNA病毒。这些公开在此引入本文作为参考。
在一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒是选自以下病毒的病毒样颗粒：a)RNA噬菌体；b)噬菌体；c)乙型肝炎病毒，优选其衣壳蛋白(Ulrich等，病毒研究(Virus Res).50：141-182(1998))或其表面蛋白(WO92/11291)；d)麻疹病毒(Warnes等，基因(Gene)160：173-178(1995))；e)辛德比斯病毒；f)轮状病毒(US5,071,651和US5,374,426)；g)口蹄疫病毒(Twomey等，疫苗(Vaccine)13：16031610，(1995))；h)诺瓦克病毒(Jiang，X.等，科学(Science)250：15801583(1990)；Matsui，S.M.等，J.Clin.Invest.87：14561461(1991))；i)甲病毒；j)逆转录病毒，优选其GAG蛋白(WO96/30523)；k)逆转录转座子Ty，优选蛋白p1；l)人类乳头瘤病毒(WO98/15631)；m)多形瘤病毒；n)烟草花叶病毒；o)豇豆花叶病毒(cowpea mosaic virus)；以及p)兽棚病毒(Flock House Virus)；q)豇豆褪绿斑点病毒(CowpeaChlorotic Mottle Virus)；以及r)苜蓿花叶病毒。生产豇豆褪绿斑点病毒、苜蓿花叶病毒和豇豆花叶病毒的VLP的方法描述于US2005/0260758和WO05067478。
在一个优选的实施方案中，病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒。在一个更优选的实施方案中，RNA噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；l)噬菌体PP7和m)噬菌体AP205。在一个优选的实施方案中，病毒样颗粒是RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒。生产RNA噬菌体VLP、具体而言是噬菌体Qβ的VLP和噬菌体AP205VLP的方法描述于WO04009124的37-47页及其实施例1和21。
在一个优选的实施方案中，病毒样颗粒是RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒。在一个更优选的实施方案中，病毒样颗粒是在大肠杆菌(E.coli)中重组表达的RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒。
在一个优选的实施方案中，在液体制剂中，或对于冻干制剂来说就冻干之前制剂中的浓度而言，尼古丁-VLP缀合物从0.1mg/ml至2.5mg/ml。在一个优选的实施方案中，在液体制剂中，或对于冻干制剂来说就冻干之前制剂中的浓度而言，尼古丁-VLP缀合物从0.2mg/ml至2mg/ml。在本发明另一个优选的实施方案中，在液体制剂中，一般且优选地就冻干之前制剂中的浓度而言，尼古丁-VLP缀合物的浓度是0.2mg/ml、0.6mg/ml、1.0mg/ml或2mg/ml。又在本发明另一个优选的实施方案中，在液体制剂中，一般且优选地就冻干之前制剂中的浓度而言，尼古丁-VLP缀合物的浓度是0.2mg/ml或0.6mg/ml、优选0.2mg/ml。
US5876727、US6656469和US6932971描述了尼古丁分子通过其能与载体共价结合的包含羧酸酯官能度的数种连接序列。这些特定的教导在此引入本文作为参考。能用于本发明且包含酯官能度的连接序列例如是如US5876727第17栏公开的称为CJ2、CJ2.1、CJ2.2、CJ2.3、CJ4、CJ4.1、CJ5、CJ5.1、CJ8、CJ8.1、CJ9和CJ11的连接序列。
在本发明一个优选的实施方案中，连接序列包含A-X-CO(O)-Y-Z-B，其中A代表尼古丁分子以及其中B代表病毒样颗粒，以及其中X＝(CH2)m且m＝1-4，Y＝(CH2)n且n＝1-8，以及Z＝C(O)。
在非常优选的实施方案中，连接序列包含CH2OCO(CH2)nCO，或基本由CH2OCO(CH2)nCO组成，或由CH2OCO(CH2)nCO组成，其中n＝1-8、优选n＝1-4，优选n＝1或2以及更优选n＝2。在又一非常优选的实施方案中，连接序列由A-CH2OCO(CH2)2CO-B组成，其中A代表所述的尼古丁分子以及其中B代表所述的病毒样颗粒。
连接序列可以共价结合至尼古丁分子的吡啶或吡咯烷环。具体而言，关于此的实例公开于US5876727、US6656469和US6932971。在非常优选的实施方案中，所述连接序列共价结合至所述尼古丁分子的3’位置。
共价结合的尼古丁分子的全部以相同的绝对构型存在，即所有尼古丁分子具有(R)-构型或所有尼古丁分子具有天然存在的(S)-构型，或者它们以其任何混合物存在。优选地，尼古丁分子共价地如此连接，使得存在(R)- 构型和天然存在的(S)-构型的约均等混合物或均等混合物。在非常优选的实施方案中，本发明制剂包含的尼古丁-VLP缀合物可以通过应用尼古丁分子或尼古丁分子衍生物的外消旋混合物、一般且优选地应用尼古丁分子或包含具有共价结合至此的所述连接序列的尼古丁分子的尼古丁衍生物的外消旋混合物，用于与病毒样颗粒连接反应产生根据本发明的尼古丁-病毒样颗粒缀合物而可得到或得到。
在一个优选的实施方案中，尼古丁-VLP缀合物、优选尼古丁-RNA噬菌体QβVLP缀合物、优选NicQβ从起始材料O-琥珀酰-3′-羟甲基-尼古丁和起始材料Qβ的VLP形成。
在一个优选的实施方案中，稳定剂组合物包含缓冲剂，诸如琥珀酸盐、醋酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、三羟甲基氨基甲烷、双三羟甲基氨基甲烷、三乙醇胺、两性离子缓冲剂(Tricine)、N-二羟乙基甘氨酸(Bicine)、组氨酸、天冬氨酸、氨基乙酸盐(Glycinate)、谷氨酸、赖氨酸、邻苯二甲酸盐、甲酸盐、丙氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和脯氨酸。
在一个优选的实施方案中，缓冲剂选自：磷酸钠、磷酸钾和组氨酸/组氨酸HCl、乙酸钠、琥珀酸钠。在一个更优选的实施方案中，就在液体制剂中的浓度而言，或对于冻干制剂来说就冻干之前制剂中的浓度而言，缓冲剂的浓度是10-20mM。在一个更优选的实施方案中，缓冲剂是磷酸钠或磷酸钾，优选磷酸钠。在一个优选的实施方案中，缓冲剂是组氨酸/组氨酸HCl。在一个优选的实施方案中，缓冲剂是乙酸钠。在一个优选的实施方案中，缓冲剂是琥珀酸钠。
在一个优选的实施方案中，本发明的液体或冻干制剂还包含0至90mM、优选0至60mM、更优选0至30mM的氯化钠。包含氯化钠主要是稳定液体溶液或调整本发明液体或冻干制剂的摩尔渗透压浓度。
在进一步的非常优选的实施方案中，本发明提供了本发明的冻干制剂，其包含以下组分，或基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：(i)至少一个尼古丁-病毒样颗粒缀合物，该缀合物包含：(a)病毒样颗粒；以及(b) 至少一个尼古丁分子，其中所述至少一个尼古丁分子通过连接序列共价结合至所述病毒样颗粒，其中所述的连接序列包含酯官能度；以及(ii)稳定剂组合物，其由以下组成：(c)至少一种，优选一种单一的非还原二糖，其中所述非还原二糖的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是从0.5％至15％(w/v)、优选3％至12％(w/v)；(d)至少一种，优选一种单一的非离子型表面活性剂，其中所述非离子型表面活性剂的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是从0.0005％至0.1％(w/v)；(e)缓冲剂，其中所述缓冲剂优选选自：磷酸钠、磷酸钾、乙酸钠、琥珀酸钠和组氨酸/组氨酸HCl；(f)任选地就冻干之前制剂中的浓度而言0-30mM的NaCl；以及其中所述稳定剂组合物在冻干之前具有从5.4至6.6的pH值。
在一个备选地优选的实施方案中，发明提供了本发明的冻干制剂，其包含以下组分，或基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：(i)至少一个尼古丁-病毒样颗粒缀合物，该缀合物包含：(a)病毒样颗粒；以及(b)至少一个尼古丁分子，其中所述至少一个尼古丁分子通过连接序列共价结合至所述病毒样颗粒，其中所述的连接序列包含酯官能度；以及(ii)稳定剂组合物，其由以下组成：(c)至少一种，优选一种单一的非还原二糖，其中所述非还原二糖的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是0.5％至15％(w/v)；(d)至少一种，优选一种单一的填充剂，其中所述非还原二糖和所述填充剂的总浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是0.5％至15％(w/v)，条件是所述非还原二糖的浓度至少是0.5％(w/v)；(e)至少一种，优选一种单一的非离子型表面活性剂，其中所述非离子型表面活性剂的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是0.0005％至0.1％(w/v)；(f)缓冲剂，其中所述缓冲剂优选选自：磷酸钠、磷酸钾、乙酸钠、琥珀酸钠和组氨酸/组氨酸HCl；(g)任选地就冻干之前制剂中的浓度而言0-30mM的NaCl；以及其中所述稳定剂组合物在冻干之前具有从5.4至6.6的pH值。
在一个非常优选的实施方案中，发明提供了本发明的冻干制剂，其包含以下组分，或者备选地基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：(i)至少一个尼古丁-病毒样颗粒缀合物，优选至少一个尼古丁-RNA噬菌体病 毒样颗粒，优选至少一个尼古丁-RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒缀合物，甚至更优选NicQβ缀合物，其包含：(a)病毒样颗粒，优选RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒，其中所述缀合物的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言优选0.1mg/ml至2mg/ml、优选0.2mg/ml至1mg/ml；以及(b)至少一个尼古丁分子，其中所述至少一个尼古丁分子通过连接序列共价结合至所述病毒样颗粒、优选连接至所述RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒，其中所述的连接序列包含酯官能度；以及(ii)稳定剂组合物，其由以下组成：(c)至少一种，优选一种单一的非还原二糖，优选海藻糖，其中所述非还原二糖的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是从5％至12％(w/v)、优选10％(w/v)；(d)至少一种，优选一种单一的非离子型表面活性剂，优选失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯，其中所述非离子型表面活性剂的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是从0.005％至0.1％(w/v)、优选0.005％(w/v)；(e)缓冲剂，其中所述缓冲剂优选是磷酸钠、磷酸钾、乙酸钠、琥珀酸钠或组氨酸/组氨酸HCl，更优选是组氨酸/组氨酸HCI；以及其中所述稳定剂组合物在冻干之前具有从5.6至6.2的pH值。
本发明提供了冻干制剂，其包含以下组分，或备选地由以下组分组成：(i)至少一个尼古丁-病毒样颗粒缀合物，其包含：(a)RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒；以及(b)至少一个尼古丁分子，其中所述至少一个尼古丁分子通过连接序列共价结合至所述病毒样颗粒，其中所述的连接序列由A-CH2OCO(CH2)2CO-B组成，以及其中A表达所述尼古丁分子及其中B代表所述的RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒，以及其中所述连接序列共价结合至所述尼古丁分子的3’位置；以及(ii)稳定剂组合物，其包含：(c)一种非还原二糖，其中所述的非还原二糖是海藻糖，以及其中海藻糖的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是10％(w/v)；(d)一种非离子型表面活性剂，其中所述非离子型表面活性剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯，以及其中失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是0.005％(w/v)；以及其中所述稳定剂组合物在冻干之前具有6.2的pH值。
本发明提供了冻干制剂，其包含以下组分，或备选地由以下组分组成：(i)至少一个尼古丁-病毒样颗粒缀合物，其包含：(a)RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒；以及(b)至少一个尼古丁分子，其中所述至少一个尼古丁分子通过连接序列共价结合至所述病毒样颗粒，其中所述的连接序列由A-CH2OCO(CH2)2CO-B组成，以及其中A代表所述尼古丁分子及其中B代表所述的RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒，以及其中所述连接序列共价结合至所述尼古丁分子的3’位置；以及(ii)稳定剂组合物，其基本上由以下组分组成、或由以下组分组成：(c)一种非还原二糖，其中所述的非还原二糖是海藻糖，以及其中海藻糖的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是10％(w/v)；(d)一种非离子型表面活性剂，其中所述非离子型表面活性剂是失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯，以及其中失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是0.005％(w/v)；(e)一种缓冲剂，其中所述缓冲剂是磷酸钠或组氨酸/组氨酸HCl，以及其中所述磷酸钠或所述组氨酸/组氨酸HCI的浓度是20mM；以及其中所述稳定剂组合物在冻干之前具有6.2的pH值。
在一个进一步非常优选的实施方案中，本发明提供本发明的冻干制剂，其包含以下组分，或备选地基本上由以下组分组成，或由以下组分组成：(i)至少一个尼古丁-病毒样颗粒缀合物，该缀合物包含：(a)病毒样颗粒；以及(b)至少一个尼古丁分子，其中所述至少一个尼古丁分子通过连接序列共价结合至所述病毒样颗粒，其中所述的连接序列包含酯官能度；以及(ii)稳定剂组合物，其由以下组成：(c)至少一种，优选一种单一的非还原二糖，其中所述非还原二糖的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是5％至15％(w/v)、优选10％(w/v)；(d)至少一种，优选一种单一的非离子型表面活性剂，其中所述非离子型表面活性剂的浓度就冻干之前制剂中的浓度而言是0.0005％至0.1％(w/v)、优选0.005％；(e)缓冲剂，其中所述缓冲剂优选选自乙酸钠、琥珀酸钠和组氨酸/组氨酸HCl；(f)任选地就冻干之前制剂中的浓度而言0-30mM的NaCI；以及其中所述稳定剂组合物在冻干之前具有6.0至6.4、优选6.2的pH值。
在一个优选的实施方案中，本发明的冻干制剂于室温或甚至于升高的温度(40℃)下稳定至少15周、优选至少25周。
一方面，发明提供了包含溶解或悬浮于生理可接受的溶液或无菌水、优选注射用水的本发明冻干制剂的重构制剂。在另一个优选的实施方案中，溶液是NaCl溶液。优选的重构制剂具有生理可接受的摩尔渗透压浓度值。
在一个优选的实施方案中，重构制剂还包含佐剂。在一个更优选的实施方案中，佐剂是氢氧化铝水合凝胶或磷酸铝水合凝胶。
一方面，本发明提供了用于制备本发明冻干制剂的方法，其包括如下步骤：(i)通过将搁板温度(shelf temperature)降至-35℃以下、优选-38℃以下，优选-40℃以下、优选-45℃以下以及优选-50℃以下，冷冻冻干之前的制剂；(ii)于-45℃至-15℃、优选-40℃至-20℃、优选-35℃至-25℃的搁板温度、在0.2毫巴以下的室压下初次干燥制剂；(iii)在10℃至40℃、优选10℃至30℃的搁板温度、在0.2毫巴以下的室压下第二次干燥所述制剂。该方法任选包括在步骤(ii)后，在-30℃至-15℃、优选-20℃的搁板温度、在0.2毫巴以下的室压下干燥制剂的步骤。
在一个优选的实施方案中，在初次和第二次干燥期间的室压是0.005毫巴至0.2毫巴、优选0.020毫巴至0.2毫巴、优选0.03至0.1毫巴、优选从0.040至0.05毫巴。
在另一个优选的实施方案中，搁板温度的下降以0.1℃至1.0℃/分钟、优选0.5℃至1.0℃/分钟的速率进行。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：(i)通过将搁板温度降至-40℃以下、优选-50℃以下，冷冻冻干之前的制剂；(ii)在-35℃的搁板温度、0.2毫巴以下的室压下初次干燥制剂至少10小时、优选20小时；(iii)在10℃至30℃的搁板温度、0.2毫巴以下的室压下第二次干燥所述制剂。该方法任选包括在步骤(ii)后，在-20℃的搁板温度、0.2毫巴以下的室压下干燥制剂的步骤。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于制备本发明冻干制剂的方法，其包括以下步骤：(i)通过将搁板温度降至-40℃以下、优选至-50℃， 冷冻冻干之前的制剂；(ii)在0.2毫巴以下、优选0.045毫巴的室压下，在-35℃的搁板温度初次干燥制剂，优选干燥25小时；升高搁板温度并在-20℃的搁板温度干燥制剂，优选干燥10小时；(iii)在0.2毫巴以下、优选0.045毫巴的室压下，于20℃的搁板温度第二次干燥所述制剂。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法还包括在通过如本发明所描述的冷冻方法之一冷冻制剂之后的额外的退火步骤，优选地在-10至-20℃、一般历时二至五小时。此类退火步骤优选地在当本发明的稳定组合物包含至少一种填充剂、诸如甘露糖醇或甘氨酸时应用。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了用于制备本发明冻干制剂的方法，其包括以下步骤：(i)在0.2毫巴以下、优选0.045毫巴的室压下，通过将搁板温度降至-40℃以下、优选至-50℃，冷冻冻干之前的制剂；(ii)任选地在-15℃退火；(iii)在-15℃的搁板温度初次干燥制剂，优选干燥20小时；(iii)在0.2毫巴以下、优选0.007毫巴的室压下，在40℃的搁板温度第二次干燥制剂。
实施例
实施例1
材料和方法
“NicQβ”-文中使用的术语“NicQβ”是指至少一个尼古丁-病毒样颗粒缀合物，其包含(a)RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒；以及(b)至少一个尼古丁分子，其中所述至少一个尼古丁分子通过连接序列共价结合至所述病毒样颗粒，其中所述连接序列由A-CH2OCO(CH2)2CO-B组成，以及其中A代表所述尼古丁分子且其中B代表所述RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒，以及其中所述连接序列共价结合至所述尼古丁分子的3’位置。如US6’932’971的实施例1描述的那样生产NicQβ。于室温融化NicQβ药品。
冷冻干燥方案：
表1：冷冻干燥方法I。
表2：冷冻干燥方法II。
冻干产品的重构
如本领域技术人员所熟知的那样，对于以下描述的某些分析，需要使冻干产品形成水性溶液。因此，将冻干产品用无菌过滤水重构，一般且优 选地用能调整至冻干前制剂总体积的一定体积的无菌过滤水。作为举例，如果在冻干处理之前的制剂每小瓶由0.7ml组成，则优选地将从冻干处理中得到的成形饼状物在这样体积的无菌水中重构，诸如最终组合物恢复由0.7ml组成。
非对称流场流分级(AF4)测量法确定VLP集聚物
应用具有350μm定距片的Wyatt分离管道、Eclipse2分离系统(WyattTechnology Corporation)、Agilent1100G1310A等度泵、Agilent1100G1379A脱气器、Agilent1100G1329A自动采样器、用于自动采样器的Agilent1100G1330B恒温器、Agilent1100G1365B MWD探测器、Agilent1100G1362A RI探测器和Wyatt DAWN EOS MALS探测器进行AF4测量。
管道流是1.5ml/分钟。横向流是2.0ml/分钟，历时18分钟，随后在15分钟内降至0.15ml/分钟并在0.15ml/分钟保持5分钟。在最后步骤中，横向流是0.0ml/分钟，历时5分钟。
用MWD探测器在260nm确定VLP的浓度。将Wyatt DAWN EOSMALS探测器用于确定流体动力学半径及VLP种类的分子量。分别将约20μg量的来自液体制剂和重构的冻干产品(如上面描述的那样用水重构)的VLP注射入AF4。
差示扫描量热法(DSC)测量以确定玻璃化转变温度
用Netzsch差示扫描热量计204Phoenix进行DSC测量。一般，将1至25mg样本称量至铝盘中。然后应用普遍封闭压力用铝盖紧密地封闭铝盘。参照铝盘保持为空并且以同样的方法制备。将铝盘置于测量格中。用氮气冲洗格子。在10℃/分钟的加温速率下测量样本。
通过单DSC扫描方法确定冻干产物的玻璃化转变温度Tg。
含水量分析
用具有顶部空间烘箱的电量Karl Fischer滴定仪(Analytic Jena AG)进行冻干产物的水分含量测量。就在2R玻璃小瓶中在80℃的顶部空间温度下测量冻干产物。将样品在烘箱室中加热至少5分钟。
动态光散射(DLS)测量确定制剂的同质性
用Malvern Zetasizer Nano ZS设备进行动态光散射测量。将0.5至1.0ml液体制剂或重构的冻干产品(如上面描述的那样重构)移液至UV微型比色杯中Plastibrand中，并应用经验证的LMU Munich标准方案(SOP蛋白_m_99％)测量。应用体积转换和强度模型计算多分散指数PI、主NicQβ峰的比例和主峰大小。
光阻测定法确定颗粒污染和VLP集聚物
用PAMAS SVSS-C设备进行光阻测定法。用一部分制剂冲洗系统，并且随后将0.1-0.3ml液体制剂或重构的冻干产物用于评估颗粒污染。将溶液通过测量格并且确定每ml计算的大于1、10和25μm的颗粒的量。
SE-HPLC-RNA完整性
在TRI-试剂(酚和硫氰酸胍在单相溶液中的组合以抑制RNA酶活性)中将颗粒匀化后，用1-溴-3-氯丙烷(BCP)-相分离试剂提取RNA。用异丙醇沉淀提取的RNA并用乙醇洗涤沉淀。然后将RNA溶解于DEPC-H2O中并通过HPLC分析(在A260nm监测，等度洗脱)。相对于在相同系列中分析的tRNA标准品确定提取的RNA的保留时间。
RP-HPLC-游离尼古丁
通过在旋转滤器中过滤从NicQβ中分离溶解的尼古丁衍生物羟甲基尼古丁(由于酯键的水解)和琥珀酰基羟甲基尼古丁(由于酰胺键的降解)。通过RP-HPLC(A260nm-尼古丁和尼古丁衍生物的吸收波长)分析流通。从平行实施的尼古丁标准品曲线回归计算尼古丁衍生物的浓度。以总尼古丁的百分 比给出游离尼古丁的值。
RP-HPLC-总尼古丁
将共价结合至Qβ蛋白的尼古丁部分于40℃和pH>11的孵育中经3小时定量切割，在此之后沉淀蛋白。水解产物羟甲基尼古丁保留在上清液中并通过RP-HPLC(A260nm)应用尼古丁标准品曲线定量化，因为水解产物和尼古丁具有相同的生色团。
SE-HPLC-VLP完整性
SE-HPLC是根据不同化合物的大小分离样品中不同化合物的分析方法。因此大的Qβ颗粒可以与较小的分子(例如Qβ衣壳蛋白单体或核酸片段相分离，因此可以应用该方法确定VLP的完整性。该方法也被用于确定药品的纯度。作为对照，将VLP标准品与样品在相同系列中分析。在260nm进行检测。产品相关的杂质可能是蛋白集聚物、更小的切割产物和/或核酸。通过SE-HPLC检测所有的这些产品相关杂质，SE-HPLC显示出能够将这些杂质与产品峰分离。应用260nm的波长用于检测。
浊度测量法
应用实验室浊度计(2100AN，HACH公司)确定液体样品溶液的乳白光度数。通过比例比浊法进行浊度测量，比例比浊法确定透射光和通过样品溶液中颗粒散射的光的比值。应用甲(formazin)浊度标准品悬浮液在规定的样本格中校准仪器。在0-200NTU的范围建立了用户定义的校准曲线以用于在更小试管中测量1-5ml体积的样品。在一次性玻璃试管中测量1ml样本，往试管上施用硅油以降低由玻璃引起的散射效应。
VIS-透射测定法
用双光束UV/可见光分光光度计UV1(Thermo Spectronic)进行透射测定。将0.5至1.0ml液体制剂移液至UV微比色杯Plastibrand中。确定在 600nm的透射。
实施例2
pH对NicQβ稳定性的影响
在4.6至8.2范围内的十个不同pH值分析了NicQβ的稳定性。通过用0.1N NaOH溶液或0.1NH3PO4溶液调整溶液的pH。所有的样品均用水稀释至1mg/ml NicQβ的浓度。于室温保存样品达14天。结果如表3所示。
表3：结果-pH稳定性研究NicQβ
RP-HPLC SE-HPLC DLS
游离尼古丁 主峰(通过应用强度
衍生物含量 主峰 PI 转换模型确定)
在第7天[总的 在第7天的相
应用RP-HPLC和SE-HPLC方法研究了NicQβ的化学稳定性。NicQβ的化学不稳定性导致VLP降解为Qβ外壳蛋白单体或多聚体和/或导致尼古丁和QβVLP之间的解离。
游离尼古丁衍生物的含量随着pH值增加而增加。在pH4.6和6.2之 间，只检测到游离尼古丁衍生物很小的增加。高于pH6.2则游离尼古丁衍生物的量随着储存时间延长迅速增加。而且VLP完整性受到增加的pH值的负面影响。如通过SE-HPLC测量的那样，在pH等于或高于7.4时7天后Qβ衣壳的完整性急剧降低。pH7.0时NicQβ的相对含量于室温7天后是约96％，而在pH7.4是约91％。
通过光阻、DLS和VIS-透射测定法研究了NicQβ的物理稳定性。Nic-Qβ的物理稳定性：本文所用的术语“Nic-Qβ的物理稳定性”是指Qβ的VLP的聚集。所有三种分析方法均显示NicQβ在等于和低于5.8的pH值倾向于聚集。DLS测定法显示在pH值等于和低于5.8时，主峰比例减少而包含VLP集聚物和低聚物的峰增加以及多分散指数(PI)增加。通过光阻和VIS-透射测定法得到的结果证实了NicQβ在降低的pH下倾向于聚集的发现。
实施例3
冻融胁迫条件对NicQβ稳定性的影响
对总共36个不同的NicQβ制剂进行冷冻/融化循环。将样本在-80℃冷冻并在20℃至25℃融化。将这一冷冻/融化循环重复5次。通过DLS测定法和通过光阻测定法在冷冻/融化循环之前和之后分析制剂。
海藻糖和添加失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯的影响-制剂包含0.2mg/ml NicQβ、0或10％海藻糖、pH＝6.4、30mM NaCl、具有或没有0.005％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。DLS测定法得到的含有海藻糖但没有失水山梨醇聚氧乙烯醚酯(polysorbate)的制剂的结果显示主峰的少量减少和PI的增加。因此海藻糖导致NicQβ聚集水平的少量增加。然而，这一效果能通过添加失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯防止。光阻结果支持了DLS测定法。与没有失水山梨醇聚氧乙烯醚酯的制剂中>1μm颗粒的数量相比，冷冻/融化后在含有失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯的制剂中检测到显著更低数量的>1μm颗粒。
不同NaCl浓度和添加失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯的影响- 制剂包含0.2mg/ml NicQβ、10％海藻糖、pH＝6.4、不同浓度的NaCl、具有或没有0.005％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。DLS测定法的结果显示NaCl对冷冻/融化后NicQβ的聚集水平有影响。冷冻/融化循环后溶液的PI随着NaCl浓度的增加而增加。因此NicQβ的物理稳定性随着NaCl浓度的增加而显著降低。然而添加失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯能够为浓度等于和低于90mM的NaCI补偿这一物理不稳定性。这些结果得到了光阻测定法的支持。在冷冻/融化后，没有失水山梨醇聚氧乙烯醚酯的制剂显示出大于1μm颗粒的显著增加，这表明了更大量的集聚物。添加失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯防止了聚集，因为几乎没有检测到大于1μm的颗粒。
不同pH和添加失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯的影响-研究了存在或不存在失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯的情况下5.4至7.2范围内的pH对制剂稳定性的影响。制剂包含0.2mg/ml NicQβ、10％海藻糖、不同pH、NaCl30mM、具有或没有0.005％失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯。结果支持了实施例2描述的pH稳定性研究的发现。在制备制剂溶液期间，NicQβ主峰的比例已经随着pH的下降而下降，如通过应用体积转换模型由DLS测定法测定的那样。另一方面，PI也增加。添加失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯在所测试的pH6.4和7.2防止了NicQβ聚集。此外，添加失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯在pH5.4减少了NicQβ聚集。除了DLS测定法之外，通过光阻测定法得到的结果也支持这些结果。上面所描述的通过DLS和光阻测定法的这一pH研究过程中得到的观察结果对于30、60、90和150mM的NaCI浓度是一致的。
实施例4
不同组合物在冷冻干燥期间对NicQβ稳定性的影响
将NicQβ于室温融化。通过将NicQβ移液至赋形剂储存溶液中制备具有不同NicQβ、海藻糖、失水山梨醇聚氧乙烯醚酯、NaCl浓度和具有不同缓冲系统的不同制剂(如图1所示)。将溶液在IKA磁搅拌器上搅拌5-10分 钟。将最终的药物溶液无菌过滤(0.22μm膜滤器)并且随后冻干。
简而言之，将药物溶液装入无菌2R玻璃小瓶中。从制剂F29RL、F48RL和F49RL中每小瓶装入0.7ml。从其它制剂中每小瓶装入0.6ml。将聚二甲基硅氧烷和ETFE(亚乙基四氟亚乙基(Ethylenetetrafluoroethylen))-涂布的冻干塞子(West Pharmaceutical Services)置于小瓶上。将小瓶转移至ChristEpsilon2-12D冷冻干燥仪(MartinChristGefriertrocknungsanlagen GmbH)的冻干室中。以0.5℃至1.0℃/分钟将搁板温度降低至-40℃并保持在-40℃以下3小时。然后将室内压力降低至0.045毫巴，以1℃/分钟将搁板升温至-35℃并保持20小时。此后，将搁板温度以0.1℃/分钟升至-20℃并保持10小时。随后将搁板温度以0.5℃/分钟升至20℃并保持10小时。然后用过滤的干燥氮气对冻干室充气至800毫巴并在冻干室中盖上小瓶。从室中移出小瓶并用封口物密封。冷冻干燥后得到了稳定的冻干产品，得到了充分的饼状物结构。
结果如图2所示。因此从冻干前具有不同的Nic-Qβ(从0.2mg/ml至2.0mg/ml测试)、海藻糖(从5％至10％)测试、失水山梨醇聚氧乙烯醚酯(从0.005至0.01％测试)、NaCl浓度(从0至60mM测试)的制剂中得到的冻干产品都具有少于1％的水分含量。与冷冻干燥前的制剂相比，上面所提到的制剂的NicQβ-低聚物和NicQβ-集聚物的总量在冷冻干燥后增加不超过1％，如通过AF4分析的那样。DLS测定法显示出这些制剂分别具有一般等于和低于0.2的多分散指数(PI)、并且NicQβ主峰的比例高于98.5％，如通过应用体积转换模型确定的那样。这些实施的分析测量得到这样的结果，即这些上述制剂能够稳定0.20mg/ml至2mg/ml浓度的NicQβ。
不含失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯的F22RL具有约0.35的多分散指数(PI)值。此外，与冷冻干燥前的制剂相比，冷冻干燥后NicQβ-低聚物和NicQβ-集聚物的总量增加约5.5％。这些结果显示非离子型表面活性剂对于防止VLP聚集是必需的。
F08RL、F39RL、F37RL、F38RL分别包含30mM、60mM、90mM和150mM氯化钠。虽然失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯的存在补偿了 NaCl(等于或低于60mM的浓度)对NicQβ物理稳定性的影响，(在冻干后，F08RL和F39RL没有NicQβ低聚物和NicQβ集聚物量的大量增加)，但在NaCl浓度等于和高于90mM时，失水山梨醇聚氧乙烯(20)醚月桂酸酯的存在只能部分地补偿NaCl的影响，因为在冷冻干燥后NicQβ低聚物和NicQβ集聚物的总量增加了2.8和3.5％。此外，等于或高于90mM NaCl的存在导致了高于400mosm/kg的摩尔渗透压浓度值。
实施例5
甘露糖醇/海藻糖组合物在冷冻干燥过程中作为NicQβ的稳定剂的测试
表4：制剂
基本上如实施例4所描述的那样制备四种制剂(图1中F30RL、F32RL、F42RL、F54RL)。小瓶的填充体积是0.6ml。简而言之，制剂F30RL、F32RL和F42RL在以下条件下冻干：以1.0℃/分钟将搁板温度降低至-50℃并在-50℃保持3小时。然后将室内压力降低至0.045毫巴，将搁板以0.15℃/分钟升温至-15℃并保持20小时。备选地，将制剂F42RL和F54RL应用相同 的冷冻干燥方法冻干但包括在-15℃进行2小时的退火步骤。随后将室内压力降低至0.007毫巴并将搁板以0.15℃/分钟升温至40℃并维持另外10小时。然后用过滤的干燥氮气对冻干室充气至800毫巴并在冻干室中盖上小瓶。从室中移出小瓶并用封口物密封。
图2部分地显示了结果。冷冻干燥后实现了稳定的冻干产品并得到了充分的饼状物结构。三种冻干制剂的水分含量一般低于0.3％。制剂的摩尔渗透压浓度一般在250至340[毫渗摩尔/kg]的范围内。摩尔渗透压浓度随着海藻糖和甘露糖醇浓度的增加而增加。
在没有应用退火步骤制备的制剂F30RL、F32RL和F42RL中的甘露糖醇级分是无定形的或部分无定形的。在通过应用退火步骤制备的制剂F42RL和F54RL中甘露糖醇级分在冷冻干燥后是结晶的。
制剂F30RL、F32RL和F42RL显示出在冷冻干燥后NicQβ-低聚物和NicQβ-集聚物的总量没有显著地净增加，如通过AF4测量分析的那样。DLS测定法显示这三种制剂具有0.2以下的多分散指数(PI)并且NicQβ主峰比例一般高于99％，如通过应用体积转换模型确定的那样。对于制剂F54RL，通过AF4能够确定冷冻干燥后NicQβ-低聚物和NicQβ-集聚物总量的增加。
光阻测定法显示重构的冻干产品的颗粒污染一般低于每ml100个颗粒>10μm，以及颗粒>1μm的量一般低于每ml2000个颗粒。这些结果显示出海藻糖和填充剂(诸如甘露糖醇)的混合物能够在冷冻干燥期间稳定NicQβ。
实施例6
经冷冻干燥的NicQβ制剂的稳定性研究
基本上如实施例4和实施例5所描述的那样制备五种制剂F42RL、F35RL、F10RL、F16RL和F54RL。小瓶的填充体积是0.6ml。
在以下条件下冻干仅含有海藻糖的制剂(F35RL，F10RL，F16RL)：以1.0℃/分钟将搁板温度降低至-50℃并在-50℃保持3小时。然后将室内压力 降低至0.045毫巴，将搁板以1℃/分钟升温至-35℃并保持25小时。随后将搁板温度以0.1℃/分钟升至-20℃并维持10小时。随后将搁板温度以0.5℃/分钟升至20℃并维持10小时。
在以下条件下冻干含有海藻糖和甘露糖醇这两者的制剂(F42RL)：以1.0℃/分钟将搁板温度降低至-50℃并在-50℃保持3小时。然后将室内压力降低至0.045毫巴，将搁板以0.15℃/分钟升温至-15℃并保持20小时。随后将室内压力降低至0.007毫巴并将搁板以0.15℃/分钟升温至40℃并维持另外10小时。
在以下条件下冻干仅含有甘露糖醇的制剂(F54RL)：以1.0℃/分钟将搁板温度降低至-50℃并在-50℃保持2小时。应用在-15℃的退火步骤2小时。将搁板温度降低至-50℃并在-50℃保持2小时。然后将室内压力降低至0.045毫巴，将搁板以0.15℃/分钟升温至-15℃并保持20小时。随后将室内压力降低至0.007毫巴并将搁板以0.15℃/分钟升温至40℃并维持另外10小时。
在冻干后，所有经冷冻干燥的制剂都得到了稳定的冻干产物并得到了充分的饼状结构。
将样品在2℃至8℃、25℃和40℃储存达25周。分析结果部分地显示于图3。所有基于海藻糖或海藻糖/甘露糖醇的制剂的冻干产物的饼状结构在储存期间都是稳定的，甚至于升高的温度也是如此。这在所有的储存条件和时间点都观察到了。没有甘露糖醇的冻干产物的玻璃化转变温度一般在60℃至110℃范围内并且在储存期间没有显著变化。制剂的摩尔渗透压浓度是在300至350[毫渗摩尔/kg]的范围内。
冻干制剂的初始水分含量低于1.0％。在2-8℃和25℃储存的冻干产物的水分含量在25周的储存期间是稳定的，其水分含量增加少于0.5％。在40℃储存的冻干产物导致少量增加的水分含量；与储存前约1％相比，储存后的水分含量一般低于1.7％。
在基于海藻糖或海藻糖/甘露糖醇的制剂中NicQβ-低聚物和NicQβ-集聚物的总量在冷冻干燥后没有增加，如通过AF4测量分析的那样。储存后 观察到与冻干之前的制剂相比小于3％的轻微增加，如通过AF4测量分析的那样。基于甘露糖醇的制剂显示出NicQβ-低聚物和NicQβ-集聚物的总量的明显增加。
光阻测定法显示所有的制剂、储存条件和时间点的重构储存后冻干产物的颗粒污染均一般低于每ml500个颗粒>10μm。
DLS测定法显示出来自四种基于海藻糖或海藻糖/甘露糖醇制剂的重构储存后冻干产物分别一般具有低于0.2的多分散指数(PI)，以及主NicQβ峰比例一般高于98.5％，如通过应用体积转换模型确定的那样。这在所有的制剂、储存条件和时间点均观察到了。制剂F54RL在40℃储存6周后显示出多分散指数(PI)至0.24的增加。
IEF、SE-HPLC(RNA完整性)、RP-HPLC(总尼古丁)、光谱测定法(RNA含量)、浊度和LDS-Page测定法显示出所有基于海藻糖和海藻糖/甘露糖醇的制剂在所有储存条件和时间点都没有显著变化。重组生产的Qβ病毒样颗粒一般含有通常在病毒样颗粒内部空间的宿主RNA分子。
对于所有基于海藻糖和海藻糖/甘露糖醇的制剂、所有的储存条件和时间点来说，游离尼古丁衍生物的含量一般低于总的偶联尼古丁的1.5％，如用RP-HPLC测定法确定的那样。在40℃储存6周后的制剂F54RL中，游离尼古丁衍生物的量增加至4.2％。
SE-HPLC(VLP完整性)测定法显示在所有基于海藻糖和海藻糖/甘露糖醇的制剂、时间点和储存条件中，NicQβ的相对含量都高于97％。在40℃储存6周后，制剂F54RL中的NicQβ相对含量减少至93％。
所实施的分析测量得到这样的结论，即所有基于海藻糖和海藻糖/甘露糖醇的制剂能够在冻干和接下来的储存过程中稳定NicQβ，甚至于升高的温度(40℃)下也如此。