技术领域：
本发明属于药物技术领域。具体涉及一种治疗变应性鼻炎的中药外用制剂及其制备 方法。
发明背景：
变应性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)指接触过敏原后，由IgE介导产生鼻黏膜炎症，从而 表现出鼻部症状，如鼻痒、喷嚏、流涕、鼻塞等症的一种疾患。
变态反应病是20世纪的流行病，发病率有增高趋势，各类变应性疾病约占全球人口 中的50％，而AR在其中占明显地位，AR发病率的增高在发达国家更明显。AR常伴生 支气管哮喘(BA)，据统计，87％BA患者患有AR。AR患者最烦恼的不仅有睡眠、鼻部症 状等问题，还有日常活动和社会交际限制及情绪问题，所以AR不仅是个医学问题，而 且是个社会问题。寻求有效的治疗方法和药物是全球共同关注的课题。
目前，变应性鼻炎的西医药物治疗大都采用抗组胺药、减充血药、皮质类固醇类等 药物治疗。由于这些药物久用易产生不良反应、远期疗效差等而在临床上受到诸多限制。 从局部作用的西药来看含有高效抗炎、抗过敏作用的糖皮质激素类药是现在应用最广 泛、疗效最好的药物，但存在一定的糖皮质激素副作用，如：收缩毛细血管、消除鼻黏 膜充血的药(盐酸麻黄碱等)，长期应用也可能产生心血管系统副作用，以及使鼻黏膜血 供减少；高度选择性组胺H1受体拮抗剂类药物有强效速效缓解症状的作用，但有肾功 能损害者不宜。因此，从中医的研究认为变应性鼻炎应归属于“鼻鼽”的范畴。从中医临 床治疗变应性鼻炎而言，大多采用益气固表、温助肾阳、补益脾胃、滋肾养肝等扶正法， 或以祛风通窍、清热祛风、活血化瘀、利水解毒、调和营卫等祛邪法论治。然而变应性 鼻炎特别是反复发作之后，各种病机均可导致血瘀。如寒凝血瘀，热邪煎灼血液致瘀， 卫表气虚、运血无力、血液瘀滞，久病入络，而用西药抗过敏、激素类应用时间过久也 会致瘀。现代研究也表明变应性鼻炎患者表现出客观上血瘀证的变化，如鼻固有层血管 扩张、组织水肿、大量炎性细胞浸润等、鼻黏膜局部微循环障碍等。变应性患者血浆内 皮素(ET)、血栓素B2(TXB2)等指标均有改变，为指导中药活血化瘀药或抗凝血药的应 用有着重要的临床意义。此外，变应性鼻炎患者还多虚实夹杂，常有血虚血燥的证候， 血虚则血流迟缓，血燥易生风邪。目前市场治疗鼻炎的以内服制剂为多，但效果不理想。
发明内容：
1.本发明所要解决的技术问题在于研究设计扶正祛邪并用的中药外用制剂。
2.本发明提供了一种治疗变应性鼻炎的中药外用制剂，该制剂由下列重量配比中 药组成：当归5-30g，茜草3-30g，鹅不食草3-30g。
3.本发明所用的药材来源符合《中华人民共和国药典》2000版有关规定。
当归：伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。
茜草：茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根。
鹅不食草：菊科植物鹅不食草Centipeda minima(L.)A.Br.et Ashers.的干燥全草。
4.本发明的另一目的提供了一种用于治疗变应性鼻炎的中药外用制剂的制备方法， 该方法包括下列步骤：
(1)水煎：根据药材总重量加8-10倍量水，浸泡30-60min，煎煮3次，每次1hr。 合并煎液并过滤、浓缩；
(2)醇沉：将上述煎液放冷至室温，加乙醇使含醇量达50-60％，冷藏过夜。取上 清液回收乙醇；
(3)调节PH值：调PH值至5.5-6.5，加0.05-0.1％的防腐剂尼泊金乙酯，分装即可。
5.本发明剂型为鼻外用喷剂，每瓶10ml。
本发明制剂的含量测定及稳定性实验：
按照2000版药典要求，对本制剂采用薄层色谱(TCL)以及高效液相色谱(HPLC) 方法，对其含量及稳定性进行考察。TCL鉴别以茜草为研究对象，采用乙酸乙酯萃取 法，分别制备缺茜草的阴性样品、茜草对照药材的对照样品，以及本制剂溶液的阳性样 品，进行茜草所含茜草素的鉴别比对。以当归的有效组分阿魏酸为含量指标，采用HPLC 法从线形关系、精密度、重复性、稳定性，以及加样回收率等方面，对0、1、2月不同 样品进行考察，结果良好。
对本发明制剂采用TDI(2、4-二氰酸甲苯酯)橄榄油溶液大鼠滴鼻造模，以及大 鼠卵清蛋白(OVA)生理盐水喷雾致敏造模法，从动物行为学改变、大鼠鼻分泌物中嗜酸 细胞计数、大鼠鼻腔组织病理变化，以及血、鼻黏膜组胺含量等方面进行药效学研究 的结果如下：
1)TDI及OVA所致大鼠变应性鼻炎模型建立。
TDI滴鼻刺激法 采用Wistar雄性大鼠。分别采用10％TDI橄榄油溶液滴鼻7日、 10％TDI橄榄油溶液滴鼻15日、15％TDI橄榄油溶液滴鼻7日致敏。实验组每只动物用 移液器滴入TDI橄榄油溶液10ul，每侧5ul，每日1次，直至造模结束。空白对照组仅 给橄榄油滴入双侧鼻孔内，每日每侧5ul，其方法同致敏组。
OVA激发法 采用2％卵清蛋白生理盐水喷雾10日、5％卵清蛋白生理盐水喷雾10 日、10％卵清蛋白生理盐水喷雾10日致敏。实验组大鼠放入密闭玻璃干燥器内，通过 雾化吸入各浓度卵清蛋白生理盐水溶液致敏，每天喷雾1次，每次10分钟，连续10日。 正常对照组用生理盐水雾化吸入。
动物分组及受试药物给药方法
Wistar雄性大鼠72只，体重140～160g，随机分为6组，每组12只。中药高剂量 组12只，中药中剂量组12只，中药低剂量组12只，西药对照组12只，模型组12只， 空白对照组12只。于模型成功后第1日起，各组均每日滴鼻给药3次。中药大剂量组 0.56g/kg/d，中剂量组0.28g/kg/d，中药小剂量组0.14g/kg/d，西药对照组用立复汀鼻喷雾 剂0.3mg/kg/d。均以精密移液器滴入双侧鼻孔，每次每侧10μl。模型组及正常对照组 用等容量的0.9％生理盐水滴鼻治疗。连续用药15日。
2)药效实验观察指标及方法
行为学评分标准 以鼻部症状和体征为主要观察内容，自给致敏药始，依据鼻痒、 喷嚏、流涕等出现的时间长短、轻重程度、次数多少为评分标准并评分记录。鼻痒轻度： 轻擦鼻几次，记1分；重度：抓挠鼻、面不止，到处磨擦记2分。喷嚏：1-3个为1分， 4-10个为2分，11个以上为3分。流涕：流至鼻前孔为1分，超过鼻前孔为2分，流 涕满面为3分。各症状记分叠加，总分数5分者为模型成功。其症状观察时间为每次给 致敏物后30min。
鼻黏膜分泌物涂片 鼻腔分泌物涂片检查于激发症状出现后，用小棉棒取鼻腔分 泌物，均匀涂在载玻片上，风干后，用滴管取瑞氏染色液染色，4分钟后用自来水冲洗， 风干后用树胶封片。每张涂片计数100个细胞中的嗜酸性粒细胞的总数。
组织病理切片 取下动物双侧鼻腔，剪下小部分迅速放入10％福尔马林溶液中。行 常规组织制片技术制片。光镜下观察黏膜上皮情况、黏膜固有层血管扩张充血情况、组 织水肿情况、嗜酸粒细胞浸润程度及其他炎症细胞浸润程度。
血及鼻黏膜组胺测定方法
腹主动脉取血处死动物，取下动物双侧鼻腔，迅速放入10％福尔马林溶液中。(1) 取全血2ml，加1.8ml双蒸水使之溶血，后加0.2ml浓过氯酸(10mol/L-12mol/L)充 分摇匀振荡，40C、5000rpm离心10min，取离心后的上清液2ml，每1ml分装入1.5ml 离心管内，迅速置于液氮中，转移到-70℃冰箱保存。
(2)取血2ml放入事先加入消炎痛-EDTA.Na2约0.08ml的试管内，4℃、3500rpm 离心15min，吸取上清，分装入1.5ml离心管内，置-20℃冰箱保存。
(3)取4ml血静置2h后，2000rpm离心20分钟，吸取上清。血清各500μl分装入 1.5ml离心管内，置于-70℃冰箱保存直至测定。
(4)取下动物双侧鼻腔，剪下小部分迅速放入10％福尔马林溶液中。
(5)冰浴分离鼻黏膜，用冰双蒸水冲净血液及黏液，滤纸吸干多余水分，称重后迅速 置于液氮中，转移到-70℃保存，直至测定。
鼻腔灌流方法
经抗原致敏的大鼠，于末次给药后1小时，用Urethane1.2/kg腹腔注入麻醉。切开 气管，气管插管，以维持自主呼吸。另用连接微量注射泵的PE-20聚乙烯管从气管插 至鼻腔后部，灌流生理盐水，灌流速率0.25ml/min(37℃)，灌流10分钟，从鼻孔的流 出处收集灌流液。随之，将1％Evansblue(0.5ml/100g)从尾静脉注入，注射3分钟后， 启动微量泵，收集灌流10分钟的流出液。然后，将0.3％卵蛋白灌流鼻腔10分钟，并 收集后10分钟的灌流液。将3次收集的灌流液分别以1200×g离心10min，取上清液， 通过分光光度计，在620nm处测定Evansblue的浓度。
3)药效实验结果
TDI致敏动物模型的实验结果
行为学评分结果见表1。
表1TDI致敏动物行为学评分 组别 动物数(n) 叠加记分( x±SD) 空白对照组 模型组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 立复汀组 伯克纳组 12 12 12 12 12 12 12 0.17±0.39 7.08±0.52## 2.92±0.52**# 2.83±0.58**# 2.50±0.52**# 2.67±0.49**# 2.75±0.45**#
注：方差分析(下同)，*与模型组比较P＜0.05，**与模型组比较P＜0.01，#与正常组比较P＜0.05。
血组胺经荧光分光光度计检测结果见表2。
表2各组动物血清中组胺含量 组别 动物数(n) 组胺(ug/ml)( x±SD) 正常组 模型组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 立复汀组 伯克纳组 12 12 12 11 12 12 12 0.22±0.111 0.75±0.210## 0.35±0.095** 0.36±0.122** 0.23±0.128** 0.39±0.237**# 0.64±0.219##
注：*与模型组比较P＜0.05，**与模型组比较P＜0.01，#与正常组比较P＜0.05。
鼻黏膜组胺经荧光分光光度计检测结果见表3。
表3各组动物鼻黏膜中组胺含量 组别 动物数(n) 组胺(ug/g)( x±SD) 正常组 11 0.74±0.491 模型组 12 2.76±0.547## 中药低剂量组 11 1.56±0.844**## 中药中剂量组 11 1.32±0.173**# 中药高剂量组 12 1.13±0.452** 立复汀组 12 1.11±0.402** 伯克纳组 12 1.17±0.417**
注：*与模型组比较P＜0.05，**与模型组比较P＜0.01，##与正常组比较P＜0.01。
鼻黏膜中嗜酸粒细胞计数结果见表4。
表4鼻黏膜中嗜酸粒细胞计数 组别 动物数(n) 嗜酸粒细胞计数(％)( x ±SD) 空白对照组 模型组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 立复汀组 伯克纳组 12 12 12 12 12 12 12 0.25±0.452 6.75±0.866## 3.08±0.900**## 2.17±0.835**## 2.00±0.853**## 1.75±0.754**## 2.75±0.965**##
注：方差分析(下同)，**与模型组比较P＜0.01，##与正常组比较P＜0.01。
血浆TXB2含量测定结果：
表5血浆TXB2含量测定
组别 动物数(n) TXB2(pg/ml)( x±SD) 正常组 模型组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 立复汀组 伯克纳组 10 10 10 9 10 10 10 55.18±17.432 57.36±28.226 55.23±21.664 53.95±15.069 55.62±21.281 56.96±22.465 51.56±19.925
以上各组之间血浆TXB2含量差异无统计学意义。
鼻黏膜组织形态学观察结果显示：光镜下可见模型组部分黏膜上皮脱落，固有层血 管扩张充血，组织水肿，伴大量嗜酸细胞及其其他炎症细胞浸润，黏膜下腺体增生；空 白对照组黏膜上皮呈柱状排列，未见血管充血及组织水肿，未见炎症细胞浸润；西药对 照组及各中药组仅见少量嗜酸粒细胞浸润，炎症细胞少于模型组，可见血管轻度充血， 组织轻度水肿，黏膜上皮基本完好，黏膜下腺体有轻度增生。
OVA喷雾致敏动物模型的实验结果
行为学评分结果见表1。
表1动物行为学评分 组别 动物数(n) 叠加记分( x±SD) 空白对照组 模型组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 立复汀组 伯克纳组 12 12 12 12 12 12 12 0.33±0.492 6.67±0.651## 3.32±0.754**## 3.17±0.718**## 2.83±0.718**## 3.08±0.379**## 2.95±0.793**##
注：方差分析(下同)，*与模型组比较P＜0.01，##与正常组比较P＜0.01。
血中组胺经荧光分光光度计检测结果见表2。
表2各组动物血中组胺含量 组别 动物数(n) 组胺(μg/ml)( x±SD) 正常组 模型组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 立复汀组 伯克纳组 12 12 11 11 11 11 11 0.19±0.079 0.75±0.125## 0.57±0.076**## 0.55±0.141**## 0.31±0.214** 0.41±0.263**## 0.61±0.111*##
注：**与模型组比较P＜0.01，##与正常组比较P＜0.01。
鼻黏膜组胺经荧光分光光度计检测结果见表3。
表3各组动物鼻黏膜中组胺含量 组别 动物数(n) 组胺(ug/g)( x±SD) 正常组 模型组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 立复汀组 伯克纳组 12 12 12 12 12 12 12 0.86±0.605 2.34±0.701## 2.01±0.200## 1.46±0.517**# 1.33±0.382** 1.13±0.877** 0.31±0.105**
注：**与模型组比较P＜0.01，#与正常组比较P＜0.05，##与正常组比较P＜0.01。
鼻黏膜中嗜酸粒细胞计数结果见表4。
表4鼻黏膜中嗜酸粒细胞计数 组别 动物数(n) 嗜酸粒细胞计数％( x±SD) 空白对照组 模型组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 立复汀组 伯克纳组 12 12 12 12 12 12 12 0.33±0.492 5.58±0.793## 3.67±0.778**## 2.92±0.793**## 2.08±0.73**## 2.83±1.115**## 2.33±0.985**##
注：**与模型组比较P＜0.01，##与正常组比较P＜0.01。
血浆TXB2含量测定结果见表5。
表5血浆TXB2含量测定 组别 动物数(n) TXB2(pg/ml)( x±SD) 正常组 模型组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 立复汀组 伯克纳组 10 8 10 9 10 9 10 49.241±10.848 78.716±35.316## 66.532±30.041## 42.729±7.132** 40.233±9.952** 36.568±4.513** 40.168±8.336**
注：**与模型组比较P＜0.01，##与正常组比较P＜0.01。
鼻血管通透性测定
各组动物未注射伊文斯蓝前灌流液OD值为X1，注射伊文斯蓝后灌流液OD值为X2， 卵清蛋白激发后灌流液OD值为X3。激发前OD差值为X2-X1，激发后OD差值为X3- X2。结果见表6。
表6各组动物鼻黏膜血管通透性 组别 动物数(n) 激发前OD差值 ( d±SD) 激发后OD差值 ( d±SD) 空白对照组 模型组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 西药对照组 10 10 10 10 10 10 0.011±0.006 0.024±0.023 0.016±0.009 0.017±0.016 0.013±0.018 0.017±0.015 0.028±0.012 0.102±0.026## 0.057±0.021**## 0.041±0.022** 0.038±0.010** 0.040±0.023**
注：方差分析，**与模型组比较P＜0.01，##与空白对照组比较P＜0.01。
鼻黏膜组织形态学观察结果显示：光镜下可见模型组固有层血管扩张，组织水肿， 伴嗜酸粒细胞及其他炎症细胞浸润；空白对照组黏膜上皮呈柱状排列，未见炎症细胞浸 润；西药对照组及各中药组血管扩张、组织水肿情况较轻，仅见少量嗜酸粒细胞浸润。
(6).安全性试验
皮肤粘膜刺激试验
家兔完整皮肤刺激试验：采用新西兰白色家兔，雌雄各半，分成大(临床人用量的 3倍)、小(临床人用量)剂量组。给药前24小时将家兔背部脊柱两侧用电动剃头刀剃 去毛，每块脱毛区面积为左、右各3cm×3cm，分为给药区和对照区。给药区涂布0.5ml/ 只，1次/天，对照区涂布等量对照物，贴敷时间至少4h，连续给药14天。结果显示， 皮肤刺激评分结果显示大剂量组给药区2-4d平均积分为0.25，其余均为0；根据皮肤 刺激强度评分标准剂病理切片结果评价归归草鼻炎外用剂对家兔完整皮肤无刺激性。
家兔破损皮肤刺激试验：采用新西兰白色家兔，雌雄各半，分成大(临床人用量的 3倍)、小(临床人用量)剂量组。给药前24小时将家兔背部脊柱两侧用电动剃头刀剃 去毛，每块脱毛区面积为左、右各3cm×3cm，分为给药区和对照区。用9号针头在脱 毛区划“井”字形切口，以渗血为度造成破损皮肤，并于试验第4d第7d、第10d、第 13d再次划切于相同部位，维持皮肤破损状态。给药区涂布0.5ml/只，1次/天，对照 区涂布等量对照物，贴敷时间至少4h，连续给药14天。结果提示，皮肤刺激评分结果 以及病理结果均表明归草鼻炎外用剂对家兔破损性皮肤无刺激性。
急性毒性试验
用SD大鼠，雌雄各半，分别鼻腔给与归草鼻炎外用剂和对照物，药物组及对照组 1d内滴鼻，每2h1次，每日6次。每侧鼻孔每次各滴10ul，两侧鼻孔共20ul。给药后 严密观察动物活动(如有无咳嗽、窒息反应等)，记录动物是否有死亡以及死亡时间。 记录受试动物的体重、耗食量，并取受试动物的鼻、咽喉、气管、支气管解剖检查。结 果显示，受试动物在人用剂量86倍下滴鼻未见毒性反应。人常用剂量为0.026g/kg， 受试大鼠的最大给药量为2.24g/kg。
本发明的中药外用制剂针对变应性鼻炎经久难愈的特点，以祛瘀入手，温润养血、宣 通鼻窍，扶正祛邪并用；采用鼻腔给药的外用剂型，使药物通过鼻腔黏膜直接吸收，能 迅速缓解症状，为变应性鼻炎患者提供既扶正又祛邪的中药外用制剂。
具体实施方法(缺配方)
实例1
将当归、茜草、鹅不食草按照4kg、3kg、3kg比例混合，加8倍量水浸泡30分钟， 煎煮3次，每次1小时。每次煎煮后用60目尼龙网过滤。合并三次煎液并浓缩。加入 乙醇使其含醇量达50％。静置过夜，滤去沉淀，回收乙醇并浓缩至2g生药/ml。调PH 值至6.0，加0.05％的防腐剂尼泊金乙酯。装入定量喷雾装置中，喷鼻用。
实例2
将当归、茜草、鹅不食草按照5kg、2kg、3kg比例混合，加10倍量水浸泡30分钟， 煎煮3次，每次1小时。每次煎煮后用60目尼龙网过滤。合并三次煎液并浓缩。加入 乙醇使其含醇量达60％。静置过夜，滤去沉淀，回收乙醇并浓缩至2g生药/ml。调PH 值至5.5，加0.1％的防腐剂尼泊金乙酯。装入定量喷雾装置中，喷鼻用。
实例3
将当归、茜草、鹅不食草按照3.5kg、3kg、3.5kg的比例混合，加8倍量水浸泡 30分钟，煎煮3次，每次1小时。每次煎煮后用60目尼龙网过滤。合并三次煎液并浓 缩。加入乙醇使其含醇量达60％。静置48小时，滤去沉淀，回收乙醇。再加入乙醇使 其含醇量为70％。24小时后滤去沉淀，回收乙醇并浓缩至2g生药/ml。调PH值至5.5-6.5， 加0.1％防腐剂。装瓶滴鼻。
实例4
将当归、茜草、鹅不食草按照3.5kg、3.5kg、3kg的比例混合，加10倍量水浸泡 30分钟，煎煮3次，每次1小时。每次煎煮后用60目尼龙网过滤。合并三次煎液并浓 缩。加入乙醇使其含醇量达50％。静置48小时，滤去沉淀，回收乙醇，并浓缩至2g生 药/ml。调PH值至5.5-6.5，加0.05％防腐剂。装瓶滴鼻。